r干擾素釋放試驗(yàn)檢測(cè)方法培訓(xùn)-2015.11.27課件

γ-干擾素釋放試驗(yàn)（T-SPOT.TB方法）技術(shù)培訓(xùn)培訓(xùn)內(nèi)容1234T-SPOT.TB技術(shù)原理T-SPOT.TB檢測(cè)試劑、組份T-SPOT.TB技術(shù)操作流程（SOP）T-SPOT.TB操作常見問題γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs）兩種IGRAs用于商業(yè)診斷：T-SPOT?.TB(ELISPOT-basedIGRA)QuantiFERON?-TBGold(ELISA-basedIGRA)

結(jié)核桿菌感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。當(dāng)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)大量分泌IFN-γ直接檢測(cè)IFN-γ或者檢測(cè)分泌IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于診斷是否有結(jié)核桿菌感染。（隱性感染即存在活菌/存在效應(yīng)T淋巴細(xì)胞）γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs）T-SPOT.TB技術(shù)原理基于ELISPOT技術(shù)，計(jì)數(shù)分泌IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)目+抗原IGRA中特異結(jié)核抗原ESAT-6:Rv3875編碼

結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原

CFP-10:Rv3874編碼結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾過蛋白10RD-1(M.TB毒力區(qū))Rv3871～Rv3879Rv3874(CFP-10)Rv3875(ESAT-6)結(jié)核分枝桿菌基因組結(jié)核桿菌RD區(qū)特異抗原：試劑盒中結(jié)核抗原：ESAT-6和CFP-10的重疊肽段T-SPOT.TB檢測(cè)試劑、組份無血清培養(yǎng)液AIM-V（分裝使用）可拆卸96孔板（8連條）特異抗原A和B（ESAT-6和CFP-10）陽(yáng)性抗原PHA抗體、顯色液組份T-SPOT.TB檢測(cè)試劑盒其他試劑無菌Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（建議分裝使用）1×PBS洗液（pH7.2-7.4）：

可配置10×PBS母液，稀釋使用，0.22um濾膜過濾滅菌雙蒸水或去離子水（高壓滅菌或0.22um濾膜過濾滅菌）細(xì)胞培養(yǎng)液：建議分裝使用

RPMI1640培養(yǎng)液臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4%）或其他細(xì)胞染色液所有試劑使用前提前1-2h平衡至室溫（抗原可適當(dāng)減少平衡時(shí)間）T-SPOT.TB操作流程Procedures:

6ml250,000cells/wellFicoll第一步：采血推薦使用：肝素/肝素鈉/肝素鋰抗凝管

(提問:4ML采血管可行嗎?回答:更改為6ML)樣本采集后4小時(shí)內(nèi)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，室溫放置，請(qǐng)勿置于冷凍或冷藏室。第一步：采血免疫低下/受抑制成人成年人或>10兒童2-9歲兒童<2兒童6ml靜脈血8ml靜脈血4ml靜脈血2ml靜脈血第二步：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離1000g，22min務(wù)必緩降45度角緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液中間白膜層按照血液：Ficoll淋巴分離液=2～3:1輕緩加于Ficoll淋巴分離液上層，注意不能夠?qū)⒀獦优c分離液混合。室溫下（18-25℃），1000RCF(g)離心22分鐘。第三步：收集PBMC生理鹽水洗滌1次(也可用1640)，18℃，600g，7minRPMI1640培養(yǎng)基洗滌1次18℃，350g，7min500ulAIM-V培養(yǎng)基重懸

吸取中間白膜層并轉(zhuǎn)移至無菌15ml尖底離心管，生理鹽水和RPMI1640培養(yǎng)基各洗滌細(xì)胞1次，棄上層液，加入0.5mlAIM-V培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。取適量混勻的細(xì)胞懸液適當(dāng)稀釋后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。第四步：計(jì)數(shù)細(xì)胞血球計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)調(diào)整PBMCs濃度：2.5*106cell/ml需要500ul（100ul*4孔）每ml細(xì)胞數(shù)量=細(xì)胞計(jì)數(shù)×稀釋倍數(shù)×104第四步：計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)算公式：

需要的細(xì)胞懸液量(ml)=每個(gè)培養(yǎng)孔需要加入細(xì)胞數(shù)量

/(100,000)×需要使用的細(xì)胞稀釋液量

(ml)/計(jì)數(shù)的每ml細(xì)胞數(shù)量

(106/ml)。所需細(xì)胞懸液：

A（ul）=（2.5×0.5/細(xì)胞計(jì)數(shù)）×1000μl

補(bǔ)加體積（ul）=500-A注：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)不得低于50個(gè)；

機(jī)器計(jì)數(shù)不得低于2.5×106/mL。第五步：鋪板可拆卸板（按樣本數(shù)取出相應(yīng)條數(shù)）25萬個(gè)細(xì)胞/孔（100ul）細(xì)胞培養(yǎng)箱（37度）

16-20h（過夜）避免交叉污染、混勻細(xì)胞懸液第六步：洗板200ul1×PBS垂直沖入倒扣培養(yǎng)板，甩干液體紙巾上拍打干凈反復(fù)洗滌6次，個(gè)別紅細(xì)胞殘留孔，反復(fù)沖洗至無肉眼可見顏色。配置抗體（多配1-2個(gè)樣本量）加入抗體，4度孵育1h加入顯色液（避光5-7分鐘）第七步：抗體孵育、顯色第八步：讀板CTLAID固定讀板人員和讀板儀器T-SPOT.TB結(jié)果判讀斑點(diǎn)相減ABCD<10>20通常正常結(jié)果，空白對(duì)照孔沒有或很少斑點(diǎn)（<10個(gè)），陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)>20個(gè)。T-SPOT.TB結(jié)果判讀N孔斑點(diǎn)數(shù)P孔斑點(diǎn)數(shù)T孔-N孔斑點(diǎn)數(shù)結(jié)果判定>10任何值任何值不確定≤5≥20任一孔≥6陽(yáng)性兩孔均≤5陰性≤19任一孔≥6陽(yáng)性兩孔均≤5不確定性6≤N≤10≥20任一孔≥N陽(yáng)性兩孔均<N陰性≤19任一孔≥N陽(yáng)性兩孔均<N不確定性空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0-5個(gè)，且（抗原A或抗原B斑點(diǎn)數(shù)）-（空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)）等于5-7時(shí)，此結(jié)果被認(rèn)為是“灰區(qū)”。T-SPOT.TB有效斑點(diǎn)斑點(diǎn)特點(diǎn)：1、圓形，實(shí)心、有核結(jié)構(gòu)2、大小不均一特異性斑點(diǎn)非特異性斑點(diǎn)T-SPOT.TB有效斑點(diǎn)斑點(diǎn)數(shù)在陽(yáng)性閾值上下的，務(wù)必人工輔助判讀。常見問題小結(jié)1、外周血處理-PBMCs問題潛在可能可能解決方法細(xì)胞量少白細(xì)胞減少癥增加采血量錯(cuò)誤的血液收集不能使用含有EDTA的采血管采血管放置溫度不是18-25℃

確保采血管放置溫度是18-25℃

血液存儲(chǔ)超過推薦時(shí)間確保血液存儲(chǔ)在4-6小時(shí)內(nèi)紅細(xì)胞污染采血管放置溫度不是18-25℃

確保采血管放置溫度是18-25℃

錯(cuò)誤的離心分離增加離心時(shí)間到30min調(diào)整離心機(jī)降速到最緩和淋巴細(xì)胞分離液效果欠佳更換淋巴細(xì)胞分離液沒有明顯或清楚的單個(gè)核細(xì)胞層離心速度過低增加離心速度到1500-1800g離心時(shí)間過短增加離心時(shí)間到30min淋巴細(xì)胞分離液效果欠佳更換淋巴細(xì)胞分離液高血脂標(biāo)本采集空腹血液標(biāo)本結(jié)果無效無效結(jié)果可能由許多不正確的標(biāo)本處理情況引起，也可能由污染引起。上面提到的部分保證試劑無菌保證操作無菌常見問題小結(jié)2、斑點(diǎn)和PVDF膜問題潛在可能可能解決方法PVDF膜背景高洗板不充分增加洗板次數(shù)及浸泡時(shí)間(6次)PVDF膜沒有充分干燥PVDF膜徹底干燥后再進(jìn)行斑點(diǎn)讀取。PBMCs洗滌不干凈或破碎重復(fù)洗滌，吹打細(xì)胞沉淀不暴力PBMCs細(xì)胞混有較多紅細(xì)胞采集血樣后室溫保存并4小時(shí)內(nèi)處理，更換淋巴細(xì)胞分離液，必要時(shí)進(jìn)行紅