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基因工程

1.基因工程的DNA聚合酶有幾類?主要有哪些活性?

(1)依賴于DNA的DNA聚合酶:大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(全酶);大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow片段)、耐熱的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)等。

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(全酶)具有三種活性:①5’→3’DNA聚合酶活性,以單鏈DNA為模板,以帶3’自由羥基的DNA片段為引物;②5’→3’外切核酸酶活性,從5’端既降解雙鏈DNA,也降解RNA-DNA雜交體中的RNA鏈(RNA酶H活性);③3’→5’外切核酸酶活性,底物為帶3’自由羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA。主要用于:①以切刻平移法標(biāo)記DNA;②對(duì)DNA分子的3’突出尾進(jìn)行末端標(biāo)記。

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow片段)5’→3’DNA聚合酶活性,以單鏈DNA為模板,以帶3’自由羥基的DNA片段為引物。3’→5’外切核酸酶活性,底物為帶3’自由羥基的雙鏈DNA或單鏈DNA。

TaqDNA聚合酶具有一種活性:5’→3’DNA聚合酶活性,以單鏈DNA為模板,以帶3’自由羥基的DNA片段為引物。

主要用于:①對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序;②通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。

(2)依賴于RNA的DNA聚合酶(即逆轉(zhuǎn)錄酶):優(yōu)先以RNA為模板,也可以DNA為模板。逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板催化合成雙鏈DNA。

逆轉(zhuǎn)錄酶(依賴于RNA的DNA聚合酶)具有兩種活性:①5’→3’DNA聚合酶活性,以RNA或者DNA為模板,以帶3’自由羥基的RNA或DNA片段為引物;②RNA酶H活性,即5’→3’外切核糖核酸酶活性,特異地降解RNA-DNA雜交體中的RNA。

逆轉(zhuǎn)錄酶無3’→5’外切核酸酶活性,即無校對(duì)功能,其催化的聚合反應(yīng)容易出錯(cuò)。

(3)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(簡稱末端轉(zhuǎn)移酶):不以DNA或RNA為模板,只是將核苷酸加到已有DNA分子的末端。

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(末端轉(zhuǎn)移酶)具有一種活性:即末端轉(zhuǎn)移酶活性,在二價(jià)陽離子存在下,其催化dNTP加于DNA分子的3’-羥基端。主要用于:①給載體DNA或cDNA加上互補(bǔ)的同聚尾;②以32P標(biāo)記的一種dNTP或一種rNTP來標(biāo)記DNA片段的3’端。

2.基因工程的大腸桿菌載體有哪些,各有什么特點(diǎn)?

3.瓊脂糖凝膠電泳的原理?有什么特點(diǎn)?

基本原理:在生理?xiàng)l件下,核酸分子之間糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)。當(dāng)核酸分子被放置在電場(chǎng)中時(shí),它們會(huì)向正電極方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì),相同數(shù)量雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因此,它們能以同樣的速度向正電極方向移動(dòng),即電泳的遷移率,取決于核酸分子自身的大小和構(gòu)型。

特點(diǎn):(1)瓊脂糖是一種線性多糖聚合物,當(dāng)其加熱到沸點(diǎn)冷卻凝固會(huì)形成良好的電泳介質(zhì),其密度由瓊脂糖的濃度決定;(2)經(jīng)過化學(xué)修飾的低熔點(diǎn)(LMP)的瓊脂糖,在結(jié)構(gòu)上比較脆弱,低溫下熔化,可用于DNA片段的制備電泳。LMP可不經(jīng)過電洗脫或破碎凝膠,用來回收DNA分子;(3)無毒,凝膠過程中不需要催化劑、加速劑,不會(huì)發(fā)生自由基聚合;(4)分辨率:0.2~50kb。

4.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基本原理?PCR反應(yīng)體系的組成?

基本原理:(1)在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下,利用DNA聚合酶催化合成反應(yīng),體外擴(kuò)增特異DNA片段。(2)能夠指導(dǎo)特定DNA序列的合成。(3)使特定DNA區(qū)段得到了迅速大量的擴(kuò)增。

反應(yīng)條件。94℃變性30s;55℃復(fù)性30s;70~72℃延伸30~60s。一共進(jìn)行30輪左右的循環(huán)。

反應(yīng)體系:(1)模板。待測(cè)的核苷酸(DNA或RNA)分子;雙鏈DNA可直接用于反應(yīng),而RNA則需要用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成為cDNA,然后用作聚合酶反應(yīng)的模板。(2)DNA聚合酶。最初采用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段或T4DNA聚合酶催化。由于每輪反應(yīng)需要三個(gè)溫度點(diǎn),因此采用耐熱TaqDNA聚合酶。(3)一對(duì)引物。人工合成的、長度通常為20~24個(gè)核苷酸。(4)四種三磷酸脫氧核苷(即dNTP),是合成DNA所需的原料。(4)適當(dāng)?shù)木彌_液體系。用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液內(nèi)一般含:50mmol/LKCl、10mmol/LTris-HCl(pH8.3,室溫)、1.5mmol/LMgCl2。

5.常用目的基因制備的方法及其原理?

已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列,基因的制備方法主要分為兩大類:一類是基因化學(xué)合成法,一類是基因生物制備法。一般又可將基因生物制備法分為基因組文庫法、cDNA文庫法和PCR法等。

(一)基因化學(xué)合成法

DNA的化學(xué)合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亞磷酸酰胺法等。磷酸二酯法是最初發(fā)明的化學(xué)合成基因的方法,而固相亞磷酸酰胺法是目前絕大部分DNA自動(dòng)合成儀所使用的方法。

基因的化學(xué)合成法主要用于PCR擴(kuò)增引物、核酸測(cè)序引物和合成接頭等寡核苷酸片段的合成。

(二)基因組文庫法

基因工程中,將某種生物全部基因組的遺傳信息,貯存在可以長期保存的穩(wěn)定重組體中,以備需要時(shí)能夠隨時(shí)應(yīng)用它分離所需要的目的基因,這種保存基因組遺傳信息的材料,稱為基因組文庫。

一種直接從基因組中分離目的基因的方法。

(三)cDNA文庫法

cDNA文庫:指匯集以某種生物體成熟mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄而成cDNA序列的重組DNA群體。

在基因工程中,cDNA文庫法是從真核生物細(xì)胞中分離目的基因的常用方法。

(四)PCR法

一般經(jīng)典的PCR法可用于已知核苷酸序列核酸片段的特異擴(kuò)增;而一些改進(jìn)的PCR法可用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特異擴(kuò)增。

6.重組轉(zhuǎn)化體導(dǎo)入到受體細(xì)胞的方法有哪些?各有什么特點(diǎn)?

(1)轉(zhuǎn)化(transformation):將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞,使受體菌遺傳性狀發(fā)生改變的方法。

(2)轉(zhuǎn)染(transfection):將攜帶外源基因的病毒感染受體細(xì)胞的方法。

根據(jù)受體生物,一般可將重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法主要分為大腸桿菌轉(zhuǎn)化法、酵母轉(zhuǎn)化法、植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法和動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。

7.篩選重組轉(zhuǎn)化體的方法有哪些?

(一)利用表型特征進(jìn)行篩選

利用載體提供的表型特征進(jìn)行篩選

(1)抗藥性標(biāo)記基因插入失活篩選法;

(2)β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法。

利用噬菌斑的形成進(jìn)行篩選

(1)以λ噬菌體載體與外源DNA構(gòu)建的重組體篩選主要依賴于重組體的大小及形成噬菌斑的能力;

(2)重組體DNA只有在為野生型λ噬菌體DNA的75%~105%的長度時(shí),才能在培養(yǎng)平板上形成清晰的噬菌斑,而載體DNA自身不會(huì)包裝成活的噬菌體顆粒。

(二)物理篩選鑒定法

電泳檢測(cè)法

根據(jù)DNA分子質(zhì)量的大小,以凝膠電泳檢測(cè)重組體。

R-環(huán)檢測(cè)法

R-環(huán):指RNA通過取代與其序列一致的DNA單鏈而與另一單鏈DNA雜交,被取代的DNA單鏈與RNA-DNA雜交雙鏈所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

R-環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成就十分穩(wěn)定。應(yīng)用R-環(huán)檢測(cè)法可鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域(可在電子顯微鏡下觀察)。

8.查閱資料,綜述基因工程技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

酶工程

1.酶提取和分離純化的方法有哪些?

酶提取常用的方法:鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取、有機(jī)溶劑提取。

純化常用的方法:沉淀法、超濾法、色譜分離法、結(jié)晶法等。其中沉淀法和超濾法既可用于初步純化,也可用于精制。

理想的提取和分離純化方法:在提高酶的比活的同時(shí),要求酶回收率高,提取步驟少、工藝簡單,成本低。

2.什么是酶的活力和比活力?酶活力測(cè)定的基本步驟有哪些?

比活力:每毫克酶蛋白具有的酶活力單位數(shù)。一般情況下,酶的比活力隨酶的純度的提高而提高。酶的純度也可用酶的比活力來衡量。

在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行酶促反應(yīng),間隔一定的時(shí)間,分幾次取出一定容積的反應(yīng)液,使酶停止作用,然后分析產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量。

3.酶的固定化方法有哪些?各有什么優(yōu)缺點(diǎn)?

1.吸附法

(1)物理吸附法。酶被物理吸附于不溶性載體的一種固定化方法。吸附的載體:包括無機(jī)載體(活性炭、石英砂、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、磷酸鈣)和有機(jī)載體(淀粉、谷蛋白、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺)等。

優(yōu)點(diǎn):具有不破壞酶活性中心和酶高級(jí)結(jié)構(gòu)變化少,若能找到適當(dāng)?shù)妮d體,這是簡單的好方法。

缺點(diǎn):酶與載體結(jié)合力弱、酶易脫落等。

(2)離子吸附法。通過離子效應(yīng),將酶分子固定到含有離子交換基團(tuán)的固相載體上。

常見的載體:DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素、DOWEX-50等。

優(yōu)點(diǎn):操作簡單,處理?xiàng)l件溫和,能得到酶活回收率較高的固定化酶。

缺點(diǎn):酶與載體的結(jié)合力較弱,當(dāng)離子強(qiáng)度高、緩沖液種類或pH值發(fā)生變化時(shí),酶容易脫落。

2.化學(xué)結(jié)合法

(1)共價(jià)結(jié)合法。將載體有關(guān)基團(tuán)活化、與酶分子上的功能團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的一種固定化方法,是研究得最多的固定化方法之一。

可與載體結(jié)合的酶的功能團(tuán):α或ε-NH2,α、β或γ-羧基,巰基,咪唑基,酚基等,但參與共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是酶催化活性的非必需基因,否則可能會(huì)導(dǎo)致固定后酶活力完全喪失。

特點(diǎn):反應(yīng)條件苛刻,操作復(fù)雜,容易使酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而破壞活性中心,操作時(shí)需注意。

(2)共價(jià)交聯(lián)法。通過雙功能或多功能試劑(交聯(lián)劑),在酶分子之間或酶分子與微生物細(xì)胞之間形成共價(jià)鍵的連接方法。它與共價(jià)結(jié)合法的區(qū)別是它使用交聯(lián)劑而不用載體。

常用的交聯(lián)劑:戊二醛、異氰酸酯、順丁烯二酸酐和乙烯共聚物等。

特點(diǎn):反應(yīng)條件比較激烈,固定化酶的活力回收率較低,但盡量降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間,會(huì)有助于固定化酶比活力的提高。

3.包埋法

可分為凝膠網(wǎng)格型和微囊型。將酶或微生物包埋在高分子凝膠網(wǎng)格中的包埋法稱為凝膠網(wǎng)格包埋型,將其包埋在高分子半透膜中的包埋法稱為微囊型。

優(yōu)點(diǎn):一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基起結(jié)合反應(yīng),較少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu),酶活力的回收率較高。

缺點(diǎn):僅適用于小分子底物和產(chǎn)物的酶,因?yàn)橹挥行》肿游镔|(zhì)才能擴(kuò)散進(jìn)入高分子凝膠的網(wǎng)格,并且這種擴(kuò)散阻力還會(huì)導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為的改變和酶活力的降低。

(1)凝膠網(wǎng)格型。采用明膠、卡拉膠、海藻酸鈉或淀粉等天然高分子化合物作為包埋劑時(shí),可以將酶直接與溶膠態(tài)的包埋劑混合凝膠化。

缺點(diǎn):凝膠孔徑不規(guī)則,有一部分大于平均孔徑,時(shí)間稍長時(shí),酶容易泄漏。常與交聯(lián)法結(jié)合達(dá)到加固的目的,如先用明膠包埋,再用戊二醛交聯(lián)等。

4.固定化酶的性質(zhì)和評(píng)價(jià)指標(biāo)?

固定化酶(細(xì)胞)的性質(zhì)

1.酶活力的變化

酶經(jīng)固定化后,酶分子的構(gòu)象可能改變,導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力發(fā)生變化;載體的存在給酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙,影響酶與底物的作用;酶包埋于載體,底物必須擴(kuò)散進(jìn)入載體才能和酶分子接觸,擴(kuò)散速率的不同限制了酶與底物的作用。

2.酶穩(wěn)定性的變化

經(jīng)固定化后,大多數(shù)酶的穩(wěn)定性提高,這對(duì)實(shí)際應(yīng)用十分有利。固定化酶的穩(wěn)定性常用半衰期(t1/2)表示,即固定化酶活力降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間。它是衡量固定化酶操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵。

3.最適pH值的變化

氫離子在溶液和固定化酶之間的分配效應(yīng),對(duì)反應(yīng)速度具有重要影響。如果酶反應(yīng)產(chǎn)生酸或消耗酸時(shí),pH值曲線會(huì)發(fā)生顯著變化(曲線向右移動(dòng)或向左移動(dòng)),最適pH值也會(huì)相應(yīng)變化。

4.最適溫度的變化

酶反應(yīng)的最適溫度是酶失活速度與酶反應(yīng)速度綜合的結(jié)果。在一般情況下,固定化后酶的失活速度下降,最適溫度也隨之提高。

5.動(dòng)力學(xué)常數(shù)的變化

酶固定于電中性載體后,表觀米氏常數(shù)往往比游離酶的米氏常數(shù)高,而最大反應(yīng)速度變?。欢?dāng)?shù)孜锱c帶有相反電荷的載體結(jié)合后,表觀米氏常數(shù)往往減小,這對(duì)固定化酶實(shí)際應(yīng)用有利。此外,在高離子強(qiáng)度下,酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)幾乎不變。

固定化酶(細(xì)胞)的評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.相對(duì)酶活力

具有相同重量酶蛋白的固定化酶與游離酶活力的比值。它與載體結(jié)構(gòu)、顆粒大小、底物相對(duì)分子質(zhì)量及酶的結(jié)合效率有關(guān)。相對(duì)酶活力低于75%的固定化酶,一般無實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.酶的活力回收率

固定化酶的總活力與用于固定化的酶總活力的百分比。一般情況下,活力回收率應(yīng)小于l。

5.查閱資料,綜述一種酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用(包括工藝流程及控制、固定化等)。

發(fā)酵工程

1.食品發(fā)酵工業(yè)對(duì)微生物菌種的一般要求是什么?

(1).純度高、穩(wěn)定:生產(chǎn)菌種純度高,不易變異退化,以保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

(2).易培養(yǎng):菌種可以在要求不高,易于控制的培養(yǎng)條件下(糖濃度、溫度、pH值、溶解氧和滲透壓等)迅速生長和發(fā)酵。

(3).周期短:菌株生長速度和產(chǎn)物生成速度應(yīng)較快,發(fā)酵周期較短。

(4).來源廣泛:菌種能在廉價(jià)原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長和繁殖,并且生成所需的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量要高。

(5)、產(chǎn)物單一。

(6).不易被感染:選擇一些不易被噬菌體感染的菌株。

(7).非病源菌:不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)(包括激素和毒素等),以保證安全。

2.誘變育種和分子育種?

利用物理或化學(xué)因素處理微生物細(xì)胞群體,促使其中少數(shù)細(xì)胞遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而引起菌體發(fā)生遺傳性變異,再用合理的篩選方法從細(xì)胞群體中篩選出少數(shù)具有優(yōu)良性狀的菌株,這種方法就是誘變育種。

分子育種:應(yīng)用基因工程方法進(jìn)行的育種。

3.組成工業(yè)培養(yǎng)基的主要成分有哪些?配制和選擇培養(yǎng)基應(yīng)注意哪些問題?

能源,碳源,氮源,生長因子,無機(jī)鹽,水

1、根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基2、合適的碳氮比;3、合適的pH值

4、合適的滲透壓;5、合適的氧化還原電位

4.濕熱滅菌的方法有那些?各有什么特點(diǎn)?

(1)煮沸滅菌法

這種滅菌方法是將要消毒的物品放在水中煮沸(100℃)15~20min,一般微生物的營養(yǎng)細(xì)胞即可殺死,但不能殺死芽孢,要?dú)⑺姥挎弑仨氈蠓?~2h,如要加速芽孢的死亡,可在水中添加0.5%石炭酸或碳酸鈉。該方法適用于一般食品、器材、器皿等的消毒。

巴氏滅菌法

有些食品經(jīng)煮沸或用更高的溫度處理會(huì)損害其營養(yǎng)價(jià)值和色香味,為避免之則采用本法處理,以達(dá)到消毒或防腐的目的。將待消毒的物品,在60~62℃加熱30min或在70℃加熱15min,以殺死其中病原菌和一部分微生物的營養(yǎng)體。如牛奶、啤酒、黃酒、醬油、醋等食品均用此法滅菌。

啤酒滅菌常常采用巴氏德滅菌單位Pu,即在60℃,經(jīng)歷lmin所引起的滅菌效應(yīng)稱1Pu。目前,國內(nèi)熟啤酒多采用60℃20min(即20Pu)進(jìn)行滅菌。采用這種低溫消毒方法的具體溫度和時(shí)間是根據(jù)不同物品的性狀來決定的。

(3)間歇滅菌法

采用反復(fù)幾次的常壓蒸汽滅菌,以達(dá)到殺死微生物營養(yǎng)體和芽孢的目的。具體方法是將待滅菌的物品放入滅菌器或蒸籠中加熱至100℃,維持30~60min可殺死微生物的營養(yǎng)體,然后取出冷卻,放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)一天,使芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體,次日再以同樣方法處理,如此反復(fù)3次即可。間歇滅菌法適用于不宜高壓滅菌的物質(zhì),如糖類、明膠、牛奶培養(yǎng)基等,但此法比較麻煩,而且工作周期長

(4)高壓蒸汽滅菌法

工業(yè)發(fā)酵菌種培養(yǎng)及生產(chǎn)過程培養(yǎng)基、管道和設(shè)備的滅菌主要利用此方法。一般在0.1MPa蒸汽壓(對(duì)應(yīng)溫度為121.0℃)下處理15~30min,即可達(dá)到滅菌目的,可殺死各種微生物與芽孢。

5.種子罐級(jí)數(shù)、種齡、接種量?

種子罐的作用:使實(shí)驗(yàn)室中有限數(shù)量的菌體發(fā)芽、生長并繁殖成大量菌體,接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后能迅速生長,達(dá)到一定菌體量,以利于產(chǎn)物的合成。

種子罐級(jí)數(shù):制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù),一般根據(jù)菌種生長特性、孢子發(fā)芽和菌體繁殖速度,以及所采用發(fā)酵罐的容積而定。

種齡:種子培養(yǎng)時(shí)間為種齡

接種齡:種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。

接種量:移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。一般為7-15%,有時(shí)為20-25%。

6.查閱資料,綜述靈芝(香菇、金針菇)菌絲體深層液體發(fā)酵的菌種選育、培養(yǎng)基配制與滅菌、種子擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵工藝檢測(cè)控制和發(fā)酵罐的選型等。

7.自然選擇和誘變育種有何不同?各關(guān)鍵環(huán)節(jié)應(yīng)如何處理?

自然選育:在生產(chǎn)過程中,不經(jīng)過人工誘變處理,利用菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程。

誘變育種:以自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的幾率不高,一般只有1/100-10000萬的幾率,因此為了提高變異幾率,可采用物理和化學(xué)因素促進(jìn)誘變頻率。

基本原理:利用物理或化學(xué)因素處理微生物細(xì)胞群體,促使其中少數(shù)細(xì)胞遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而引起菌體發(fā)生遺傳性變異,再用合理的篩選方法從細(xì)胞群體中篩選出少數(shù)具有優(yōu)良性狀的菌株,這種方法就是誘變育種。

8.菌種保藏有哪些方法?

1、斜面低溫保藏法(定期移殖保藏法)

(1)方法:菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)至菌種生長完全,置于4度冰箱中保藏隔一定時(shí)間轉(zhuǎn)移至另一新的斜面培養(yǎng)基上。一般不產(chǎn)芽孢細(xì)菌一個(gè)月移一次,產(chǎn)芽孢的細(xì)菌三個(gè)月移一次,放線菌、霉菌酵母菌3-6個(gè)月移一次。

(2)原理:低溫延緩微生物的生長代謝。

(3)保藏期限:1-6個(gè)月。

(4)優(yōu)缺點(diǎn):簡單便于操作,工作量大,增加了菌種發(fā)生變異退化和污染的幾率。

2、液體石蠟覆蓋保藏法:

(1)方法:在已培養(yǎng)好的菌種斜面上,倒入經(jīng)121度30分鐘滅菌處理過的化學(xué)純石蠟油高出斜面10毫米,蓋好棉塞或膠塞,用薄膜密封,直立于4度左右的冰箱中保藏,使用時(shí),倒去石蠟,用無菌水洗1-2次即可。

(2)原理:低溫缺氧

(3)適用范圍:酵母、霉菌、放線菌、好氧細(xì)菌。

(4)保藏期限:1-10年。

(5)優(yōu)缺點(diǎn):方法簡單,不需特殊設(shè)備,保藏期長,但厭氧菌和分解烴類的菌種不能用此方法。

3、液氮超低溫保藏法:

(1)方法:

準(zhǔn)備75mm×10mm容1.2ml液體的安瓿瓶;

制備菌懸液:用滅過菌的冷凍保護(hù)劑(10%甘油蒸餾水或5%二甲基亞砜蒸餾水)洗下斜面上的菌種細(xì)胞或孢子,制成菌懸液,真菌則用打孔器將培養(yǎng)物打成5-10mm小塊,連同瓊脂一起放入冷凍保護(hù)劑中制成菌懸液。

分解熔封安瓿瓶:用無菌吸管吸取0.5ml菌懸液裝入安瓿瓶中,封熔安瓿瓶口。

凍結(jié):將已封口的安瓿瓶以每分鐘下降1度的速度凍結(jié)至-35°C。

保藏:將凍結(jié)至-35°C的安瓿瓶放入液氮冷凍保藏器小圓桶保藏,溫度為-196°C--130°C。

復(fù)活:將安瓿瓶取出,放入38-40°C水浴中震蕩2-3min進(jìn)行急劇解凍,直至融化為止。開啟安瓿聘將菌種移出。

(2)原理:超低溫使微生物代謝繁殖處于停止?fàn)顟B(tài)。

(3)實(shí)用范圍:除少數(shù)不耐低溫的菌種外,實(shí)用于各種菌種。

(4)保藏期限:4-5年

(5)優(yōu)缺點(diǎn):幾乎實(shí)用于所有菌種,保藏期長,是目前較為理想的保藏方法。但需要特殊設(shè)備,液氮消耗較多操作費(fèi)用高。

4、沙土管保藏法:

(1)保藏方法:

制備沙土管:將河沙過60目篩和80目篩,吸鐵石去鐵,用10-20%鹽酸浸泡,24小時(shí)后倒去鹽酸水洗數(shù)次至中性,將沙子烘干;另取地面下0.4-0.6m非農(nóng)耕土壤研碎過100目篩,水洗至中性烘干,按沙/土2/1的比例混合,均勻分裝入保藏管中,高度為10mm左右,旋松管蓋,121°C濕熱滅菌30min,取出數(shù)支做無菌檢測(cè)。

制斜面培養(yǎng)物;將保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)。

制備菌懸液:向培養(yǎng)好的斜面注入3-5ml無菌水,洗下孢子或細(xì)胞,制成菌懸液,用無菌管吸取菌懸液,均勻滴入沙土管,每管0.2-0.5ml。放線菌和霉菌可直接挑入孢子拌入沙土管。

干燥:真空抽去沙土管中的水分。

保藏:將沙土管用火焰熔封,放入低溫4-6°C干燥處保藏。

復(fù)活:無菌條件下打開沙土管取部分沙土粒于斜面培養(yǎng)基上,長出菌落后再轉(zhuǎn)出一次,或液體培養(yǎng)后在轉(zhuǎn)出。

(2)原理:干燥、缺氧、低溫環(huán)境可長期維持菌種的休眠狀態(tài)。

(3)實(shí)用范圍:實(shí)用耐干燥的菌種如細(xì)菌的芽孢、放線菌和真菌的孢子。

(4)保藏期限:幾年-十幾年。

(5)優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn):簡單,保藏時(shí)間長,恢復(fù)培養(yǎng)簡單。對(duì)干燥敏感的微生物不能用此方法。

5、冷凍干燥保藏

(1)方法:

準(zhǔn)備保護(hù)劑:選10%脫脂乳和10%的蔗糖。

準(zhǔn)備菌種:將保藏菌種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

準(zhǔn)備菌液:制備菌懸液時(shí),取1-2ml保護(hù)劑加到斜面上,用滴管涂擦斜面,制備菌懸液;用液體培養(yǎng)物制備時(shí),離心收集菌體棄上清夜,加入保護(hù)劑每毫升加1-2ml保護(hù)劑,,分裝于安瓿瓶。

預(yù)凍:將菌種放入-70°C預(yù)凍,每分鐘下降1度,使樣品凍結(jié)到-35°C--40°C。

冷凍干燥:用冷凍干燥機(jī)干燥時(shí)間8-20小時(shí)。

保藏:安瓿瓶真空熔封,低溫避光保藏。

復(fù)活:開啟安瓿瓶,注入0.3-0.5ml的無菌生理鹽水,或1%的麥芽汁搖勻制成菌懸液。

(2)原理:低溫、隔氧。

(3)實(shí)用范圍:不產(chǎn)孢子的絲狀菌外,實(shí)用其他各類微生物。

(4)保藏期限:可達(dá)10年。

(5)優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn):冷凍采取升華的方式,細(xì)胞受損小,存活率和保藏效果較好。

9.培養(yǎng)基按不同類型分,有哪些種類?

按原料來源及純度分:合成培養(yǎng)基,天然培養(yǎng)基,半合成培養(yǎng)基

按物理形狀分:固體培養(yǎng)基,半固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基

按用途分類:孢子培養(yǎng)基,種子培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)基

按使用目的分:基礎(chǔ)培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基,增殖培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基

10.說明任一種培養(yǎng)基適用在什么場(chǎng)合?有什么優(yōu)缺點(diǎn)?

合成培養(yǎng)基:使用化學(xué)成分和數(shù)量完全清楚的物質(zhì)配制而成,成分精確,重復(fù)性強(qiáng),可以減少不能控制因素,適合實(shí)驗(yàn)室范圍的作為有關(guān)營養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測(cè)定及選育菌種、遺傳分析定量研究。合成培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分單一且價(jià)格昂貴,故不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

蛋白質(zhì)工程

2.蛋白質(zhì)工程的主要研究方法有哪些?

蛋白質(zhì)的分離純化鑒定方法、結(jié)構(gòu)分析方法、功能研究方法和進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的分子生物學(xué)研究方法

4對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造,你認(rèn)為應(yīng)該直接對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行操作,還是通過對(duì)基因的操作來實(shí)現(xiàn)?

應(yīng)該從對(duì)基因的操作來實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)改造,主要原因如下:

(1)任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的,改造了基因即對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行了改造,而且改造過的蛋白質(zhì)可以遺傳下去。如果對(duì)蛋白質(zhì)直接改造,即使改造成功,被改造過的蛋白質(zhì)分子還是無法遺傳的。

(2)對(duì)基因進(jìn)行改造比對(duì)蛋白質(zhì)直接改造要容易操作,難度要小得多。

細(xì)胞工程

1.根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞核仍具有全能性的特點(diǎn),怎樣將動(dòng)物細(xì)胞的全能性表達(dá)?利用動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)

2.動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)?

(1)分化潛能變窄:隨著細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制,分化潛能變窄,這是指整體細(xì)胞而言。

(2)細(xì)胞核仍具有全能性:細(xì)胞核,它含有保持物種遺傳性所需的全套基因,而且并沒有因細(xì)胞分化而丟失基因,因此高度分化細(xì)胞的細(xì)胞核仍具有全能性

4.為什么選用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞融合?

這樣融合成的雜交瘤細(xì)胞,繼承了雙親細(xì)胞的遺傳物質(zhì),不僅具有B細(xì)胞分泌抗體的能力,而且還有無限增殖的本領(lǐng),因而可以獲得大量單克隆抗體

5.如何大量生產(chǎn)單克隆抗體?

利用淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能

利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性

利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞

利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞

6.什么是抗體?

抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。

7.由單個(gè)B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖(克隆),形成基因型相同的細(xì)胞群,這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。

特點(diǎn):特異性強(qiáng)、靈敏度高,只針對(duì)某一抗原決定簇

8.為什么“番茄—馬鈴薯”超級(jí)雜種植株沒有如科學(xué)家所想像的那樣,地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯?

主要原因是:生物基因的表達(dá)不是孤立的,它們之間是相互調(diào)控、相互影響的,所以馬鈴薯—番茄雜交植株的細(xì)胞中雖然具備兩個(gè)物種的遺傳物質(zhì),但這些遺傳物質(zhì)的表達(dá)受到相互干擾,不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質(zhì)一樣有序表達(dá),雜交植株不能地上長番茄、地下結(jié)馬鈴薯就是很自然的了。

9.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么?較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處?

主要成分:葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素和動(dòng)物血清等。獨(dú)特之處有:1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動(dòng)物血清等

10.為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料?

因?yàn)檫@些組織或器官上的細(xì)胞生命力旺盛,分裂能力強(qiáng)

11.為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞?

成塊組織不利培養(yǎng),分散了做成細(xì)胞懸浮液利于培養(yǎng)

12.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個(gè)體?

不能,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多,不能發(fā)育成新的動(dòng)物個(gè)體

13.細(xì)胞融合技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用:(1)酵母菌的育種(2)氨基酸生產(chǎn)菌的育種(3)酶制劑生產(chǎn)菌株的育種

生物技術(shù)與食品安全

1.生物傳感器的組成和分類?簡要說明生物傳感器的工作原理?

(1).生物傳感器的基本組成

生物識(shí)別元件:生物傳感器中固定化的酶、微生物細(xì)胞、抗原抗體和組織切片等具有分子識(shí)別能力的生物敏感材料。

換能器:能將在生物敏感材料上進(jìn)行的生化反應(yīng)產(chǎn)生的各種信息轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的裝置。

信號(hào)處理裝置:負(fù)責(zé)信號(hào)的分析處理和放大輸出。

(2).生物傳感器的分類

根據(jù)生物敏感材料可分為酶?jìng)鞲衅鳌⑽⑸飩鞲衅?、免疫傳感器、?xì)胞傳感器、組織傳感器和DNA傳感器。

根據(jù)換能器的不同,可分為電化學(xué)傳感器、介體生物傳感器、測(cè)光型生物傳感器、測(cè)熱型生物傳感器等。

具體到某一種傳感器的命名,一般是采用“功能+結(jié)構(gòu)特征”的方法,例如,葡萄糖氧化酶光纖傳感器等。

(3)生物傳感器的工作原理

通過生物的分子識(shí)別作用,生物傳感器中的生物敏感材料和生物樣品中的待測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合,并進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生離子、質(zhì)子和質(zhì)量變化等信號(hào),信號(hào)的大小在一定條件下和樣品中被測(cè)物質(zhì)的量存在一定的關(guān)系,這些信號(hào)經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換成電信號(hào),電信號(hào)再經(jīng)信號(hào)分析處理系統(tǒng)處理后輸出,反映出樣品中被測(cè)物質(zhì)的量。

2.舉例說明生物傳感器在食品安全和品質(zhì)控制中的應(yīng)用。

1.農(nóng)藥殘留的生物傳感器檢測(cè)

目前有機(jī)磷農(nóng)藥中的馬拉松、甲基馬拉松、乙基馬拉松、速效磷、久效磷和百治磷等,以及氨基甲酯類農(nóng)藥中的滴滅威、西維因、滅蟲多和殘殺威等農(nóng)藥在食品中殘留量的生物傳感器檢測(cè)都有相應(yīng)的研究報(bào)道。

1996年余孝穎等采用離子敏場(chǎng)效應(yīng)管為基礎(chǔ)傳感器(換能器),將乙酰膽堿酯酶通過戊二醛共價(jià)交聯(lián)固定于場(chǎng)效應(yīng)管上,制備得到了乙酰膽堿酯酶場(chǎng)效應(yīng)管傳感器,用于分析敵敵畏等有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。

原理:乙酰膽堿酯酶能催化乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸,當(dāng)存在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留時(shí),它們能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性,從而使底物的分解減少,膽堿和乙酸的產(chǎn)生減少,其中乙酸的減少量可以通過離子場(chǎng)效應(yīng)管來測(cè)定,且在一定條件下,乙酸的減少量和有機(jī)磷農(nóng)藥的量之間存在一定的比例關(guān)系,因此根據(jù)乙酸的減少量就可以計(jì)算出有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。

2.抗生素殘留的分析

青霉素和磺胺是獸藥中常用的抗生素,其殘留會(huì)污染動(dòng)物性食品,從而對(duì)人類的健康造成危害。

Sternesioes等人采用免疫傳感器測(cè)定了牛奶中硫胺二甲嘧啶的含量,靈敏度達(dá)到1ng/g,傳感器表面經(jīng)NaOH和HCl處理后可以重復(fù)使用。

Avon等用抗體酶共軛物為敏感材料結(jié)合光度分析法檢測(cè)了牛奶中青霉素的含量。

3.細(xì)菌毒素的分析

細(xì)菌毒素是由細(xì)菌分泌產(chǎn)生于細(xì)胞外或存在于細(xì)胞內(nèi)的致病性物質(zhì),有內(nèi)毒素和外毒素之分。

內(nèi)毒素:革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分之一的脂多糖,熱穩(wěn)定,抗原性差,不能轉(zhuǎn)化為類毒素,毒性比較弱,毫克水平才能引起動(dòng)物死亡。

外毒素:細(xì)菌(主要是革蘭氏陽性菌,也有少數(shù)革蘭氏陰性菌)分泌于胞外的一種蛋白質(zhì),熱穩(wěn)定性差,抗原性強(qiáng),能轉(zhuǎn)化成類毒素,毒性很強(qiáng),微克水平就能引起動(dòng)物死亡。

目前研究報(bào)道主要集中在運(yùn)用免疫生物傳感器分析檢測(cè)肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素等細(xì)菌外毒素。運(yùn)用生物傳感器能靈敏、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)到它們?cè)诨鹜群湍逃偷仁称分械暮俊?/p>

4.肉鮮度傳感器

和魚肉一樣,其他肉類也可以通過生物傳感器來測(cè)定其鮮度。Kurube等人將單胺氧化酶固定于氧電極上組成了測(cè)定豬肉鮮度的酶?jìng)鞲衅鳎搨鞲衅鞯捻憫?yīng)時(shí)間為4min,檢測(cè)的線性范圍為5×10-6-10×10-6mo1/L。Kress等人研制開發(fā)出一種測(cè)定肉鮮度的匕首式生物傳感器,測(cè)定時(shí)將傳感器的探頭插入肉表面2-4cm深度,通過測(cè)定葡萄糖的濃度來評(píng)價(jià)肉的鮮度。

5.牛乳鮮度傳感器

主要通過測(cè)定牛乳中的微生物數(shù)量,牛乳的乳酸增加量,或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量等來評(píng)價(jià)牛乳的鮮度。

3.抗原和抗體的定義?常用的免疫

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