包涵體的溶解原理及方法

蛋白包涵體-溶解原理及方法2009年03月15日星期日00:20維持包涵體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力是分子內(nèi)的作用力，這種作用力也維持天然蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)。先前有報道這種作用力是共價鍵結(jié)合的，但是，現(xiàn)在趨向于一致，就是維持包涵體內(nèi)部的蛋白質(zhì)的緊密的結(jié)構(gòu)的是非共價鍵的作用力。二硫鍵，無論是正確的還是錯誤的二硫鍵，在維持內(nèi)部蛋白質(zhì)的緊密的結(jié)構(gòu)中都沒有發(fā)揮直接的作用。最經(jīng)常的獲得活性蛋白質(zhì)的第一步是溶解這些包涵體蛋白質(zhì)，溶解液是使這些包涵體蛋白質(zhì)完全變性的成分，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被溶解以后，則進入到蛋白質(zhì)的體外折疊的過程。遵循標(biāo)準(zhǔn)包涵體蛋白質(zhì)的溶解同樣是一個工藝的關(guān)鍵的步驟。溶劑的選擇會影響后續(xù)的操作、最終的各種蛋白質(zhì)的收率以及最終的成本，必須遵循以下的標(biāo)準(zhǔn)：快速溶解的動力學(xué)；與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆的；對細胞碎片的分離方法沒有干擾作用；對溫度沒有依賴作用；抑制蛋白質(zhì)酶的降解作用；與蛋白質(zhì)的氨基沒有化學(xué)修飾作用；在可能的情況下，選擇最低的溶解濃度和廉價的溶劑，并適于以后的復(fù)性方法。溶解包涵體的試劑最經(jīng)常使用溶解包涵體的試劑包括離液劑或者去垢劑。最經(jīng)常使用的溶解和制備蛋白質(zhì)的離子型的離液劑最早于1969年Hatefi等人發(fā)展的離子型的去垢劑如SDS是另外一種溶解包涵體蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)的試劑，但是一般不用來大規(guī)模的生產(chǎn)，而是用來定性。除了強酸、強堿和利用有機溶劑來提取疏水性很強的蛋白質(zhì)以外，其他的變性方法如非可逆的共價修飾在工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)中很少用到。一旦蛋白質(zhì)被溶解，蛋白質(zhì)中的巰基很容易快速地氧化并形成共價的聚集體或者分子內(nèi)錯配的二硫鍵，然后這些蛋白質(zhì)就不能再進行折疊。為了防止氧化，可以使這些基團或者利用緩沖液中含有低分子量的疏基試劑保持在還原的狀態(tài)或形成磺酸鹽或者形成混合的二硫鍵。去垢劑去垢劑是一種最經(jīng)濟的溶解包涵體蛋白質(zhì)的方法，一個最大的優(yōu)點是溶解的蛋白質(zhì)有可能保持全部的生物活性，說明在此條件下保持了蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。最重要的是稀釋以后蛋白質(zhì)的聚集比其它溶劑生成的很少。陽離子型、陰離子型的和非離子型的去垢劑都可以使用，使用時的濃度一般高于去垢劑的臨界膠束濃度(CMC)，通常是0.5-5%。SDS僅僅在大量生產(chǎn)牛生長激素、干擾素和白介素-2中用到。SDS由于具有較低的臨界膠束濃度(CMC)而使得結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的SDS比較難于除去。由于N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用來溶解包涵體蛋白質(zhì)并可用稀釋的方法使蛋白質(zhì)復(fù)性，殘余的去垢劑可以使用陰離子交換色譜或者超濾的方法除去。這種去垢劑是一種比較溫和的去垢劑，可以選擇性地溶解一些包涵體，但是不能溶解完全的變性的蛋白質(zhì)的聚集體和大腸桿菌的內(nèi)膜的蛋白質(zhì)分子。使用去垢劑一個主要的缺點是對以后的純化和復(fù)性的步驟的干擾，去垢劑結(jié)合到蛋白質(zhì)上的強度大離子交換色譜復(fù)性蛋白質(zhì)小不同，比較難于除去，并干擾離子交換和疏水相互作用色譜的過程，在變性的濃度時超濾膜會吸附這些變性劑。所以復(fù)性后需要盡量洗滌這些去垢劑，也可以使用環(huán)狀糊精鏈狀糊精或者環(huán)狀淀粉從復(fù)性緩沖液中提取去垢劑。一個不容忽視的問題是去垢劑可以溶解全部的膜蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)酶，這些蛋白質(zhì)酶的活性在去垢劑的存在的情況下被活化，可能造成溶解和復(fù)性過程的收率的降低。蛋白質(zhì)復(fù)性的收率可以通過以下的方法來提高：a）先期使用可以溶解膜蛋白質(zhì)但是不溶解包涵體蛋白質(zhì)的溶劑盡量洗滌包涵體蛋白質(zhì)；b） 包涵體的含有的菌體碎片被完全除去；c） 溶解包涵體的液體中含有蛋白質(zhì)酶的抑制劑，如EDTA，苯甲基磺酰氟（PMSF）等。（2） 離液劑其它的離液劑也被用來溶解包涵體蛋白質(zhì)，最主要的溶解包涵體蛋白質(zhì)的離液劑是鹽酸胍和尿素，這是最經(jīng)常使用的溶解試劑，一般情況下選擇6-8mo1/L的濃度，蛋白質(zhì)濃度在1-10mg/mL。在溶解色氨酸合成酶A的過程，發(fā)現(xiàn)陽離子的溶解能力順序是Gdm+>Li+>K+>Na+，陰離子的順序是SCN->I->Br->Cr-。一些離液劑由于它們的溶液比鹽酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不適合用于溶解包涵體，因為利用離心和色譜分離起來比較困難。為了溶解包涵體蛋白質(zhì)需要的尿素或者鹽酸胍的濃度根據(jù)蛋白質(zhì)的不同而不同。如果蛋白質(zhì)天然形態(tài)需要溶解的變性劑的濃度不能獲得，則在溶解包涵體時需要首先確定離液劑的濃度。鹽酸胍由于比較貴，所以一般用來溶解一些附加值比較高的藥物蛋白質(zhì)分子，選擇鹽酸胍作為溶解試劑，是因為鹽酸胍是一種比脲更為強烈的變性劑，甚至可以溶解脲所不能溶解的包涵體；尿素，由于可能被自發(fā)的形成的氤酸鹽或者巳有的氤酸鹽的污染，特別是在堿性環(huán)境中，從而造成蛋白質(zhì)的自由的氨基被不可逆的修飾。消除此種影響的方法是用陰離子的緩沖系統(tǒng)如Tris-HCl溶解脲或者脲在使用之前利用陰離子交換色譜純化，并且配制的溶解和復(fù)性的緩沖液在當(dāng)天使用。脲溶液中影響蛋白質(zhì)變性的因素與鹽酸胍的不同。溶在脲中的蛋白質(zhì)受到pH和離子強度的影響，從而影響電荷的蛋白質(zhì)殘基之間的電荷作用，但是由于鹽酸胍含有高濃度的離子強度，所以這兩個因素的影響很少。（3） 混合溶劑一般情況下去垢劑并不聯(lián)合使用，Lilly等人發(fā)現(xiàn)去垢劑和尿素的混合液有效的摩爾濃度較低。尿素和去垢劑型的鹽混合可以使蛋白質(zhì)變性，但是尿素和非去垢劑的鹽如氯化鈉反而降低包涵體蛋白質(zhì)的溶解性，所以要避免使用。去垢劑結(jié)合其他的試劑或者溶解增強劑也被使用，發(fā)現(xiàn)尿素和乙酸，尿素和二甲亞楓，尿素和高pH等是比較有效的溶解包涵體蛋白質(zhì)的方法。高壓（1-2kbar）、超聲也可以溶解包涵體蛋白質(zhì)，此時使用的溶解試劑濃度可以比較低，便于后續(xù)的復(fù)性步驟。3.極端pH酸堿度也是比較廉價的有效的溶解包涵體的方法。最經(jīng)常使用酸的是有機酸，濃度在5-80%之間。Gavif和Better使用低的CpH<2.6）和高溫（85°C）溶解抗真菌的重組蛋白質(zhì)的膚段，低溫和高PH需要溶解時間要長。Reddy和合作者也使用20%乙酸溶解一種麥芽糖結(jié)合的蛋白質(zhì)。但是，同樣的一些不可逆的修飾作用或者酸降解會在極端pH下發(fā)生，所以此種方法并不是經(jīng)常使用的溶解包涵體的方法。高pH（>12）也被用來溶解生長激素和原胰島素。在高pH下一些蛋白質(zhì)同樣可能發(fā)生非可逆的變性，原因在于半胱氨酸在堿性條件下的脫硫過程。所以這種方法盡管比較簡單、廉價，同樣僅僅用于一些特定的蛋白質(zhì)，特別對于藥用蛋白質(zhì)一般不采用這種方法。摘要基因重組蛋白在大腸桿菌中表達時，由于表達量高，往往形成無生物活性的包涵體。包涵體必須經(jīng)過變性和復(fù)性的過程才能獲得有活性的重組蛋白。如何提高基因重組蛋白質(zhì)的復(fù)性率，是生物工程技術(shù)的一個研究熱點。對近年來的重組蛋白質(zhì)的復(fù)性方法做一評述，為研究蛋白質(zhì)折疊以及復(fù)性技術(shù)的進一步應(yīng)用提供依據(jù)。關(guān)鍵詞重組蛋白包涵體復(fù)性二硫鍵到目前為止，人們表達的重組蛋白質(zhì)巳有4000多種，其中用E.coli表達的蛋白質(zhì)要占90%以上，盡管基因重組技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，然而人們在分離純化時卻遇到了意想不到的困難，即這些蛋白質(zhì)在E.coli中絕大多數(shù)是以包涵體形式存在，重組蛋白不僅不能分泌到細胞外，反而在細胞內(nèi)聚集成沒有生物活性的直徑約0.1~3.0"的固體顆粒［1］。自從應(yīng)用大腸桿菌體系表達基因工程產(chǎn)品以來，人們就一直期望得到高活性、高產(chǎn)量的重組蛋白。不可溶、無生物活性的包涵體必須經(jīng)過變性、復(fù)性才能獲得天然結(jié)構(gòu)以及生物活性，因此應(yīng)該選擇一個合適的復(fù)性過程來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的正確折疊，獲得生物活性，近年來的研究可以使復(fù)雜的疏水蛋白、多結(jié)構(gòu)域蛋白、寡聚蛋白、含二硫鍵蛋白在體外成功復(fù)性。包涵體形成的原因重組蛋白在宿主系統(tǒng)中高水平表達時，無論是原核表達體系或真核表達體系甚至高等真核表達體系，都會形成包涵體［2］。主要因為在重組蛋白的表達過程中，缺乏某些蛋白質(zhì)折疊過程中需要的酶和輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的［3］。1、 表達量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達到足夠的溶解度等。2、 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。3、 重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。4、 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。5、 有報道認為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體。減少包涵體形成的策略1、 降低重組菌的生長溫度，降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成［4］。2、 添加可促進重組蛋白質(zhì)可溶性表達的生長添加劑，培養(yǎng)E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質(zhì)的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)，在最適濃度范圍內(nèi)添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白質(zhì)的合成或運輸，其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl［5］。3、 供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、pH等。包涵體的分離及溶解對于生物制藥工業(yè)來說，包涵體的形成也是有利的，不僅可獲得高表達、高純度的重組蛋白質(zhì)，還可避免細胞水解酶對重組蛋白質(zhì)的破壞。由于包涵體是蛋白質(zhì)聚集而成的致密顆粒，分離的第一步是對培養(yǎng)收集的細胞進行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理，然后5000?20000g離心，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離，接著，包涵體沉淀需用去污劑（TritonX-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導(dǎo)致包涵體溶解和復(fù)性的過程中重組蛋白質(zhì)的降解［6、7、8］。包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8mol/L尿素、6?8mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氤鹽酸胍最強；去污劑，如SDS［7］，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸，如70%甲酸［9］，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應(yīng)加入還原劑（如DTT、GSH、伊ME）打開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，對于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵的有時也應(yīng)使用還原劑，為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應(yīng)加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應(yīng)［10］。蛋白質(zhì)的折疊機理包涵體蛋白在變性劑作用下，為可溶性伸展態(tài)，在變性劑去除或濃度降低時，就會自發(fā)的從變性的熱不穩(wěn)狀態(tài)向熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變，形成具有生物活性的天然結(jié)構(gòu)［11］。然而在去除變性劑的同時，重組蛋白質(zhì)在體外折疊，分子間存在大量錯誤折疊和聚合，復(fù)性效率往往很低，包涵體蛋白折疊復(fù)性的效率實際上取決于正確折疊過程與聚集過程之間的競爭［1］。對于蛋白質(zhì)的折疊機制，目前有多種不同的假設(shè)，但很多學(xué)者認為有一個“熔球態(tài)”的中間狀態(tài)，在“熔球態(tài)”中，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)巳經(jīng)基本形成，其空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模，再做一些局部調(diào)整就可形成正確的立體結(jié)構(gòu)，總之，蛋白質(zhì)的具體步驟可用下式描述［12、13、14］：伸展態(tài)一中間體一后期中間體一天然態(tài)體一聚集體在折疊反應(yīng)中，從伸展態(tài)到中間體的速度是非常快的，只需要幾毫秒，但從中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過程比較緩慢，是一個限速過程。聚集過程與復(fù)性過程相互競爭，故而應(yīng)盡量避免聚集體的產(chǎn)生。一般認為，蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中涉及兩種疏水作用，一是分子內(nèi)的疏水相互作用，可促進蛋白質(zhì)正確折疊；一是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用，在復(fù)性過程中，部分折疊的中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)雖然由其氨基酸的順序決定，然而伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程還受到周圍環(huán)境的影響，如溫度、pH值、離子強度、復(fù)性時間等因素的影響。提高重組蛋白質(zhì)折疊復(fù)性的方法一個有效的、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備以下幾個特點：活性蛋白質(zhì)的回收率高；正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊蛋白質(zhì)分離；折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品；折疊復(fù)性方法易于放大；復(fù)性過程耗時較少［15］。1、 透析、稀釋和超濾復(fù)性法：這三種方法是最傳統(tǒng)也是應(yīng)用最普遍的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性方法，復(fù)性活性回收率低，而且難于與雜蛋白分離。透析法耗時長，易形成無活性蛋白質(zhì)聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利于工業(yè)放大［16］。2、 高蛋白濃度下的復(fù)性方法：一個成功的復(fù)性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復(fù)性率。一個方法是把變性蛋白緩慢連續(xù)或不連續(xù)地加入到復(fù)性液中［17］。在兩次蛋白加入之間，應(yīng)有足夠的時間間隔使蛋白質(zhì)折疊通過了易聚集的中間體階段。這是由于完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。第二種方法是用溫度跳躍策略［4］。變性蛋白在低溫下復(fù)性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉(zhuǎn)化為不易聚集的后期中間體后，溫度快速升高來促進后期中間體快速折疊為蛋白的天然構(gòu)象。第三種方法是復(fù)性在中等的變性劑濃度下進行［18］，變性劑濃度應(yīng)高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發(fā)正確復(fù)性。3、 添加促進劑的復(fù)性方法：包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進劑的促進作用可以分為：穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、改變錯誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、增加折疊復(fù)性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解性。通常使用的添加劑有：a、共溶劑：如PEG6000?20000，通過與中間體特異的形成非聚集的復(fù)合物，可以阻止蛋白質(zhì)分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質(zhì)的聚集；b、去污劑及表面活性劑：如TritionX-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進作用，但它們能與蛋白質(zhì)結(jié)合，很難去除；c、氧化-還原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程中應(yīng)加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統(tǒng)通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應(yīng)，提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率［19］；d、小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)、降低非正確折疊的穩(wěn)定性、增加折疊中間體的穩(wěn)定性、增加解折疊狀態(tài)的穩(wěn)定性。e、0.4?0.6ML-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進行，可大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。f、添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，并能通過有控制的結(jié)合和釋放，促進新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細胞器蛋白的跨膜運輸?shù)囊活惖鞍踪|(zhì)［20］。折疊酶有二硫鍵異構(gòu)酶、脯氨酸異構(gòu)酶等。分子伴侶和折疊酶都能在體外調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的正確折疊，提高蛋白質(zhì)的合成效率。但這類蛋白在折疊復(fù)性后要除去，而且十分昂貴，因此采用可回收利用的方法如固定化法為好°g、人工伴侶［21］：為模仿分子伴侶而發(fā)展的一種方法：首先，變性蛋白被復(fù)性液中的去污劑捕獲，形成蛋白-去污劑復(fù)合體，復(fù)合體的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入環(huán)糊精從復(fù)合體中去除去污劑，使得蛋白質(zhì)正確折疊。h、單克隆抗體［22］:待折疊復(fù)性的蛋白質(zhì)的抗體可有效協(xié)助復(fù)性，但只限于此蛋白才能獲得明顯的助折疊作用。I其它：多聚離子化合物如肝素可以促進蛋白質(zhì)的復(fù)性，具有穩(wěn)定天然蛋白質(zhì)的作用；甘油可以增加黏度，減少分子碰撞的機會，減少錯配以提高復(fù)性效率；適量的鹽濃度可以降低某些帶電基團間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊；輔助因子、短鏈醇、高滲物等能有效的降低聚集體的形成，對蛋白有穩(wěn)定的作用。jklmn4、 液相色譜（LC）復(fù)性法：液相色譜是一種最有效的純化蛋白質(zhì)的方法，巳成為基因重組蛋白質(zhì)純化的必不可少的手段，現(xiàn)有報道，疏水相互作用色譜（HIC）［23］、離子交換色譜（IEC）［24］、凝膠排阻色譜（SEC）［25］、親和色譜（AFC）［26］巳成功的對變性蛋白進行了復(fù)性。與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復(fù)性的優(yōu)點是：在進樣后可很快的除去變性劑；由于色譜固定相對變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生，提高蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量和活性回收率；在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時，可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白分離達到純化的目的，使復(fù)性和純化同時進行；便于回收變性劑，降低廢水處理成本。4種色譜法，SEC的分離效果是LC中最差的，鹽酸胍會在IEC柱上保留，與蛋白一起洗脫下來，AFC使用范圍窄、所需時間長、價格昂貴，HIC是其中較為理想的。變性蛋白在HIC上的復(fù)性機理為：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、變性劑和雜蛋白進入HIC系統(tǒng)后，由于變性劑在柱子上的作用力較弱，變性蛋白質(zhì)的作用力較強，變性劑首先同變性的蛋白質(zhì)分離，隨流動相一起流出色譜柱，又因HIC固定相能提供較常法高出十至數(shù)百倍的能量*，在變性蛋白質(zhì)被HIC固定相吸附的同時瞬時除去以水合狀態(tài)附著在蛋白質(zhì)表面和與固定相表面接觸區(qū)域的小分子*，而蛋白質(zhì)的特定的疏水性氨基酸殘基與HIC固定相表面作用以形成區(qū)域立體結(jié)構(gòu)，接著形成折疊中間體，隨著流動相的不斷變化，變性蛋白質(zhì)不斷地在固定相表面上進行吸附-解吸附-再吸附，并在此過程中逐漸被復(fù)性，形成與天然蛋白質(zhì)構(gòu)象相同的蛋白質(zhì)，并流出色譜柱oHIC固定相是從高鹽溶液中吸附變性蛋白質(zhì)，且與變性劑瞬時分離，不僅大大降低了蛋白質(zhì)間的聚集作用，還因固定相在分子水平上為變性蛋白提供里很高的能量，使水化的變性蛋白質(zhì)瞬時失水，并形成局部結(jié)構(gòu)以利于蛋白質(zhì)從疏水核開始折疊。HIC在蛋白質(zhì)復(fù)性的同時還能與其它雜蛋白進行很好的分離，且HIC柱便宜、快速，故有很好的發(fā)展?jié)摿Α?、 反膠束復(fù)性法［27］:由于蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)水相中可以保持其構(gòu)象和活性，運用相轉(zhuǎn)移技術(shù)可以將蛋白質(zhì)分子包于反膠束內(nèi)，由于這樣可使蛋白質(zhì)相互分離，減少了蛋白質(zhì)折疊過程中的聚集作用，通過逐漸降低變性劑的濃度和加入氧化-還原劑，可使變性蛋白質(zhì)復(fù)性，但表面活性劑對蛋白質(zhì)具有變性作用。6、雙水相復(fù)性法［15］：Forciniti用硫氤化鈉、氯化鈉、漠化鋰與聚乙二醇構(gòu)成的雙水相系統(tǒng)使得包涵體的溶解與蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性在一步雙水相技術(shù)操作中完成。由于PEG具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用、高濃度鹽則具有去穩(wěn)定的作用，這樣正確折疊的蛋白質(zhì)會不斷進入到另一相中，直到蛋白質(zhì)的折疊與去折疊達到一個平衡。蛋白質(zhì)知道如何折疊，但我們對蛋白質(zhì)折疊和聚集的機制尚不十分清楚，每種蛋白質(zhì)都有自己特有的折疊方式和途徑，因此對某種蛋白質(zhì)的復(fù)性必須反復(fù)試驗，利用折疊和聚集的知識建立相對優(yōu)化、適合生產(chǎn)規(guī)模的方法。參考文獻［1］ LilieH,SchwarzE,RudolphR.AdvancesinrefoldingofproteinsproducedinE.Coli.CurrOpinBiotechnol,1998,9（5）:497-501［2］ 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