From16SrDNA測序To宏基因組學(xué)研究-技術(shù)發(fā)展及異同點(diǎn)

From16SrDNA測序To宏基因組學(xué)研究一技術(shù)發(fā)展及異同點(diǎn)展開全文主要內(nèi)容:1.16SrDNA測序2.宏基因組測序3.宏基因組的由來及發(fā)展過程4.16SrDNA測序與宏基因組的優(yōu)勢和局限性5.16srDNA測序與宏基因組技術(shù)差異.16SrDNA測序什么是16SrDNA測序16SrDNA測序技術(shù)：目前，主要指基于高通量測序技術(shù)，完成16SrDNA部分或全部基因序列，用于解釋樣本中或樣本組間物種分布、豐度、差異、進(jìn)化等關(guān)系。同時，還可以利用真菌18S、ITS和功能基因(GeneFamily)完成類似的研究。為什么選擇16SrRNA基因①16SrRNA基因的序列有10個保守區(qū)和9個高變區(qū)(V1-V9:長度分布范圍約30?100bp)之分。②保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌間無差別，能反映生物物種的親緣關(guān)系，可變區(qū)具有屬或種的特異性，序列則隨菌間的親緣關(guān)系不同而有一定的差異，所以能揭示生物物種的特征核酸序列，被認(rèn)為是最適于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標(biāo)。③根據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物位點(diǎn)，擴(kuò)增可變區(qū)獲得的序列可以用于菌種鑒定。一種快速、廉價的菌種鑒定方法。④16SrRNA基因測序隨后被發(fā)現(xiàn)能夠?qū)⒓?xì)菌分類到新種，甚至新屬中。⑤用來描述從未被成功培養(yǎng)的新物種。說明：16SrDNA=16SrRNAGene.宏基因組測序什么是宏基因組測序宏基因組測序：目前，是指基于高通量測序技術(shù)，研究收集到的來源于特定條件下環(huán)境樣品的所有遺傳物質(zhì)。宏基因組與16SrDNA測序之間的相愛相殺”從宏基因組的嚴(yán)格定義來說，宏基因組的概念是不包含僅分析現(xiàn)有環(huán)境樣品中部分基因（例如： 16SrRNA）的研究，因為針對部分基因的研究并沒有提供環(huán)境中所有遺傳物質(zhì)潛在的信息。然而，針對這些部分基因群落譜系研究又經(jīng)常和這種嚴(yán)格定義的真實(shí)”宏基因研究形成互補(bǔ)廣義”和狹義”宏基因組廣義宏基因組：是指特定環(huán)境下所有生物遺傳物質(zhì)的總和，它決定了生物群體的生命現(xiàn)象。它是以生態(tài)環(huán)境中全部DNA作為研究對象，通過克隆、異源表達(dá)來篩選有用基因及其產(chǎn)物，研究其功能和彼此之間的關(guān)系和相互作用，并揭示其規(guī)律的一門科學(xué)。狹義宏基因組：則以生態(tài)環(huán)境中全部細(xì)菌和真菌基因組 DNA作為研究對象，它不是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)微生物的基因組，包含了可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物的基因，通過克隆、異源表達(dá)來篩選有用基因及其產(chǎn)物，研究其功能和彼此之間的關(guān)系和相互作用，揭示其規(guī)律。※由于狹義宏基因組學(xué)概念的對象具體、范圍局限和研究目標(biāo)明確，一般文獻(xiàn)上所提的宏基因組學(xué)，除非特別指明，一般均指的是狹義宏基因組學(xué)。.宏基因組的由來及發(fā)展過程宏基因組發(fā)展過程一純培養(yǎng)認(rèn)識微生物傳統(tǒng)的微生物學(xué)研究對象是由基因相同的細(xì)胞組成的純微生物培養(yǎng)物，這些細(xì)胞是通過繁殖分離由的單個細(xì)胞獲得的。20世紀(jì)微生物學(xué)提供的有關(guān)微生物代謝途徑和生化過程多樣性的所有知識都是通過對純培養(yǎng)物的分析獲得的。隨著培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和不同微生物的純培養(yǎng)物的建立，使用微生物、生化和遺傳方法對其進(jìn)行鑒定，產(chǎn)生了具有代表性的微生物集合，并最終加深了對微生物在生物圈中作用的理解。宏基因組發(fā)展過程一基因組水平認(rèn)識微生物DNA作為遺傳信息載體的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著生物體的所有屬性都在基因組中被加密，20世紀(jì)中葉分子生物學(xué)的興起催生了基因組微生物學(xué)。分子方法在微生物學(xué)中的第一個標(biāo)志性應(yīng)用可追溯到 20世紀(jì)70年代末，當(dāng)時CarlWoese在比較16S核糖體（r）RNA的基礎(chǔ)上，提生了一個通用的原核生物系統(tǒng)發(fā)育系統(tǒng)。基因組測序技術(shù)的發(fā)展，特別是 21世紀(jì)中葉的二代測序技術(shù)的發(fā)展，導(dǎo)致了微生物學(xué)中所謂的 基因組革命工使得全基因組測序成為常規(guī)，不僅適用于一些研究良好的模式生物如大腸桿菌，也適用于多種微生物。因此，基因組測序已成為分析純培養(yǎng)新微生物的主要方法。宏基因組發(fā)展過程一基因水平表征微生物（微生物生態(tài)學(xué)）一開始，環(huán)境微生物學(xué)的技術(shù)基礎(chǔ)是將微生物群落分離成單個微生物物種的純培養(yǎng)物，然后對其進(jìn)行生理和生化表征。然而，盡管有著一百多年的微生物培養(yǎng)歷史，大多數(shù)生活在自然環(huán)境中的微生物并沒有作為純實(shí)驗室培養(yǎng)物被分離由來。早在1933年，ArthurHenrichi就指由：人們早就知道，細(xì)菌學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法一純培養(yǎng)一在人工培養(yǎng)基上分離和觀察一往往只產(chǎn)生對莫一特定微生物區(qū)系的不完全了解。 ”特別是，他在淡水湖中發(fā)現(xiàn)了不同的形態(tài)不典型的細(xì)菌，這些細(xì)菌是那時還沒有作為純培物被分離。當(dāng)rRNA測序和直接從環(huán)境中獲得的相應(yīng)基因開始用于微生物多樣性的表征時，微生物生態(tài)學(xué)進(jìn)入了一個新的階段。宏基因組的發(fā)展過程一不可培養(yǎng)微生物的認(rèn)知這些研究使人們認(rèn)識到，通常只有不到 1%的天然微生物可以在實(shí)驗室條件下培養(yǎng)，未培養(yǎng)的物種不僅是微生物群落的主要組成部分，而且可以在生態(tài)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Woese首次提由原核生物系統(tǒng)發(fā)育系統(tǒng)的時候，只有12個細(xì)菌門和古細(xì)菌門被確認(rèn)，并且它們都可被培養(yǎng)，這些早期研究的結(jié)果以及現(xiàn)有的rRNA測序技術(shù)清楚地表明，我們離了解微生物世界真正的系統(tǒng)發(fā)育多樣性還很遙遠(yuǎn)。對不同自然生態(tài)系統(tǒng)的分子研究揭示了細(xì)菌和古細(xì)菌的一些新的系統(tǒng)進(jìn)化譜系，只有一部分是可培養(yǎng)的，根據(jù)最近的估計，培養(yǎng)的微生物占原核生物真正系統(tǒng)進(jìn)化多樣性的比例不到20%。盡管未培養(yǎng)的微生物在地球上重要的生物地球化學(xué)過程中起著重要作用，并且在海洋、土壤、沉積物、動物微生物群和其他生態(tài)系統(tǒng)中非常豐富，但它們的表征仍不盡人意。為了強(qiáng)調(diào)支配生命的未培養(yǎng)微生物的范圍和意義，提生了微生物暗物質(zhì)”一詞。類比天體物理學(xué)中的暗物質(zhì)。宏基因組的誕生對微生物系統(tǒng)發(fā)育多樣性的描述，回答了誰在這里？”這只是微生物群落研究的第一步。更困難的任務(wù)是評估特定微生物的功能活動和生態(tài)作用，也就是說，回答 池們能做什么？”與培養(yǎng)微生物的基因組測序（可預(yù)測其代謝潛能）類似，對微生物群落的集合基因組（宏基因組）進(jìn)行分析，可提供有關(guān)整個群落及其每個成員（包括未培養(yǎng)物種）的功能特征的信息。二代高通量測序（NGS）技術(shù)的發(fā)展使基因組研究發(fā)生了革命性的變化，因為它們在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的平行測序，從而以更低的成本產(chǎn)生了數(shù)量級以上的核昔酸序列，使復(fù)雜環(huán)境群落的亞基因組研究即使是小型實(shí)驗室也能負(fù)擔(dān)得起。因此，有可能對動物和人類微生物群、 牛瘤胃、土壤、海水和沉積物等復(fù)雜微生物種群進(jìn)行綜合表征。4.16SrDNA測序與宏基因組的優(yōu)勢和局限性4.116SrDNA測序的優(yōu)勢①16srRNA基因是核糖體翻譯mRNA的亞基和必要部件，廣泛存在于細(xì)菌和古菌中，其他常用Marker基因，并不是在所有活體微生物中存在。②16SrRNA基因包含高度保守區(qū)適合設(shè)計PCR通用引物，用于目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增。V1-V3和V1-V4提供屬水平測序解決方案，比其他區(qū)域更能獲得精確的微生物物種注釋和評估。③研究優(yōu)良引物，可以高度特異地擴(kuò)增細(xì)菌。④完善的參考序列數(shù)據(jù)庫和分類，更好地進(jìn)行序列間的比較和分類學(xué)的比對。⑤成本低廉、成熟且簡單化的分析流程。16SrDNA測序的局限性①通過PCR擴(kuò)增測序rRNAMarkers,由于PCR相關(guān)的各種偏向性，可能漏檢OTUs或分類；在引物和擴(kuò)增問題上，可能導(dǎo)致在一個群落內(nèi)，微生物多樣性降低。②16SrRNA測序高估菌群多樣性或物種豐度，因為人為測序?qū)е碌臏y序錯誤、擴(kuò)增子拼接錯誤、序列OTU劃分歸屬錯誤且在大多數(shù)微生物中，16S位點(diǎn)在遠(yuǎn)緣類群間的轉(zhuǎn)移或16S拷貝數(shù)的變異。另外，這種高估往往很難識別。③擴(kuò)增子測序更關(guān)心微生物群落物種分類的組成，并不能夠直接分析與物種分類相關(guān)的生物學(xué)功能。④擴(kuò)增子測序僅能分析分類信息遺傳標(biāo)記已知且可擴(kuò)增類群。分析新型或高度變化的微生物存在一定困難（例如：病毒和真菌）。⑤16SrRNA測序方法缺少金標(biāo)準(zhǔn)：質(zhì)量控制、過濾和統(tǒng)計分析的指導(dǎo)指南。宏基因組的優(yōu)勢（WhyMetagenomics）宏基因組與二代測序在實(shí)現(xiàn)中緊密相關(guān)，其特征是每個樣本的核甘酸測序深度。對樣本的深入了解從什么是高豐度的”或者最重要的是什么？”的傳統(tǒng)思維，轉(zhuǎn)變成存在和潛在重要的什么？可能影響情況和結(jié)果的是什么？ ”科學(xué)家和公眾正在接受這樣一個事實(shí)，即人類是超級有機(jī)體，同時擁有人類基因組和微生物基因組，后者的規(guī)模和多樣性要大得多，是個人健康的關(guān)鍵。現(xiàn)在是研究人類及其相關(guān)微生物群之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系以及這種關(guān)系如何調(diào)節(jié)或影響雙方的時候。這些觀點(diǎn)可以擴(kuò)展到動植物界，并從整體上擴(kuò)展到地球的生物群落。根據(jù)其性質(zhì)，地球上所有生物群落的進(jìn)化和功能都受到微生物（浮游生物、生物膜或與宿主相關(guān)的）與周圍物理環(huán)境之間無數(shù)相互作用的影響。宏基因組學(xué)的一般定義是在給定的環(huán)境中，基于采樣，對微生物群體基因組的遺傳信息進(jìn)行不依賴于培養(yǎng)方式的獨(dú)立分析。它的重點(diǎn)是通過測序收集遺傳信息，測序可以針對DNA、RNA或兩者。后續(xù)的分析可僅集中于序列保存、系統(tǒng)發(fā)育、系統(tǒng)基因組、功能或遺傳多樣性代表基因，包括尚未注釋的基因。宏基因組能夠證實(shí)的假設(shè)、解決的問題和實(shí)現(xiàn)目標(biāo)是無止境多樣化的。宏基因組實(shí)驗初步設(shè)計是基于待分析材料”的性質(zhì)及其主要作用。宏基因組的局限性核酸提取的全面性和文庫的構(gòu)建質(zhì)量決定宏基因組分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性；宏基因組是解決宏觀分子生態(tài)學(xué)或微生態(tài)學(xué)的有力工具，但發(fā)掘到感興趣的目標(biāo)基因如何進(jìn)行后續(xù)表達(dá)研究或驗證存在一定阻礙；目前集中在原核生物的研究較為集中，真核生物的研究相對較少。生物信息分析中，目前很難或甚至不可能組裝非常長的Contigs,因此，很難或不可能確定非常復(fù)雜微生物群落或包含多個密切相關(guān)物種的微生物群落中單個物種的高質(zhì)量復(fù)雜基因組。rDNA測序與宏基因組技術(shù)差異不同方法學(xué)闡述的問題基于功能的宏基因組針對從環(huán)境中分離的總DNA進(jìn)行宏基因組分析可以使用兩種概念上不同的策略來進(jìn)行，第一種是所謂的功能性宏基因組，它評估人們感興趣的生化和代謝活動，其基礎(chǔ)是通過克隆將群落DNA的隨機(jī)大型片段插入并保持在載體 （Cosmids、Fosmids等）中，以生成一個表達(dá)文庫，然后篩選與特定底物靶向反應(yīng)的物質(zhì)。在這種情況下，允許選擇生態(tài)系統(tǒng)用于分析識別具有所需特征酶 ；功能基因組學(xué)被成功地應(yīng)用于鑒定不同的抗生素、水解酶、抗生素抗性基因和許多其它功能基于功能的宏基因組局限性功能活性的范圍僅限于可用篩選系統(tǒng)識別的活性；并非所有的基因，特別是那些來自系統(tǒng)發(fā)育上較遠(yuǎn)的未培養(yǎng)生物體的基因，都能在大腸桿菌等標(biāo)準(zhǔn)宿主中高效表達(dá)；宏基因組文庫有一個大小限制?；跍y序的宏基因組功能性宏基因組學(xué)的替代方法是基于測序的宏基因組學(xué)，它涉及對整個環(huán)境DNA進(jìn)行大規(guī)模測序，隨后通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因搜索和功能注釋，通常是通過與已知序列的同源性比較。該策略更加有效，因為它提供了由宏基因組展示的所有潛在微生物的信息