DB15T 2727-2022牛冠狀病毒腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB41內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB15/T2727—2022牛冠狀病毒腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范Technicalspecificationfordiagnosisofbovinecoronavirusdiarrhea2022-07-292022-07-292022-08-29內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC19）歸口。本文件主要起草人：徐曉靜、謝夢(mèng)圓、王建龍、常繼濤、馬立峰、郭宇、黃海碧、陳堅(jiān)、劉景龍。牛冠狀病毒腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了牛冠狀病毒腹瀉的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)方法、操作程序和判定標(biāo)準(zhǔn)。（戶（戶（GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。BCoV：牛冠狀病毒（Bovinecoronavirus）CPE：致細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect）DMEM：最低營(yíng)養(yǎng)需要培養(yǎng)基（DuLbecco’sModifiedEagleMedium）FBS：胎牛血清（FetalBovineSerumHRT-18細(xì)胞：人直腸腫瘤18細(xì)胞（HumanRectaltumor-18cell）PBS：磷酸鹽緩沖鹽水（PhosphateBufferSaline）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）TCID50：半數(shù)組織培養(yǎng)物感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）5生物安全措施樣品處理的生物安全措施符合GB19489的規(guī)定。樣品采集的生物安全措施符合GB/T27401的規(guī)定。6病原牛冠狀病毒屬冠狀病毒科，乙型冠狀病毒屬，病毒顆粒為球狀，直徑通常在80nm～120nm，具有囊膜和棒狀纖突，核衣殼螺旋狀對(duì)稱?；蚪M為單股正鏈RNA。7臨床診斷流行病學(xué)7日齡的犢牛易感，其他日齡犢牛及成年牛也可感染。傳染源病牛是本病自然流行的主要傳染源，犢牛一旦感染，可排出大量病毒粒子。經(jīng)消化道、呼吸道及接觸傳播。冬春季節(jié)多發(fā)，腹瀉通常在同一牛場(chǎng)連續(xù)發(fā)生。臨床癥狀體溫低，少數(shù)犢牛出現(xiàn)發(fā)熱、臥地不起等癥狀，嚴(yán)重的犢牛會(huì)出現(xiàn)昏迷甚至死亡。成年牛常突然暴發(fā)，排出深褐色帶血稀糞，伴有產(chǎn)奶下降、沉郁及厭食等癥狀。病理變化結(jié)果判定符合6.1、6.2、6.3，可判定為牛冠狀病毒腹瀉疑似病例。8實(shí)驗(yàn)室診斷主要儀器設(shè)備T25CO296PCRPCR管、電泳儀、凝膠成像儀、酶標(biāo)儀。主要試劑PBS2DMEMHRT-18PCRTaqDNAMarker、TAEA。樣品采集與處理將棉拭子伸入肛門內(nèi)刮取新鮮糞便，也可無(wú)菌采集地上剛排出的新鮮糞便。分別放入裝有3mLPBS的采樣管中，編號(hào)并記錄相關(guān)信息。漩渦振蕩器充分振蕩，12000r/min4℃離心5min～8min，取上清編號(hào)備用。取病死牛小腸及內(nèi)容物等，置于無(wú)菌密封袋或采樣杯內(nèi)。稱取1g樣品置于研缽，充分研磨后加5mLPBS混勻，8000r/min4℃離心5min，取上清編號(hào)備用。一次性采血管采集血液2mL～4mL，犢牛采用頸靜脈采血，成年牛采用尾靜脈采血。室溫靜置30min，3000r/min～4000r/min離心5min～10min。分離血清編號(hào)備用。樣品運(yùn)輸與保存采集的樣品應(yīng)低溫運(yùn)送，盡量12h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。2℃～824-70PBS制成14303000r/min離心30min，15000r/min離心30min40000r/min～50000r/min4h～5h1～22%HRT-181～2×106個(gè)毫T255%CO237℃培養(yǎng)24h～48h1:53000r/min4℃離心10min，用0.22μm20μg/mL～30μg/mL，37131037℃吸附1h20min15μg/mL～25μg/mL胰5%CO237℃靜置培養(yǎng)。4d～5d8070CPE3盲傳將第代無(wú)CPEr/min4℃離心5CPE5～7CPE，達(dá)到80-701～2×106個(gè)961001/置于5%CO23724。用DMEM℃水浴感作1200μL9645%CO237PCRPCRRNA將采集的樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行處理，按RNA提取試劑盒方法提取核酸。在-20℃條件下可短時(shí)間保存，若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件，避免反復(fù)凍融。根據(jù)BCoVBCoV-N-F：GCAATCCAGTAGTAGAGCGT；BCoV-N-R：CTTAGTGGCATCCTTGCCAA。按25μL反應(yīng)體系配制。2μL1μL，OnestepTaq12.5μL，RNase-FreeH2O8.5μL。21μL，Taq酶12.5μL，RNase-FreeH2O8.5μL。一步法：50℃30min；95℃15min；94℃1min，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。兩步法：95℃15min；94℃1min，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。8.5.3.5電泳檢測(cè)5μL～8μLPCRDNAMarker，于1×TAE8.5.3.6測(cè)序分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后測(cè)序，于NCBI中Blast分析是否為BCoVN基因。ELISA待檢糞便樣品按牛冠狀病毒抗原診斷ELISA試劑盒操作方法進(jìn)行樣品檢測(cè)。可看到直徑為80nm～120nm的病毒顆粒，外周突起排列成“皇冠”狀，即判定樣品為BcoV陽(yáng)性。當(dāng)正常對(duì)照組孔內(nèi)細(xì)胞單層生長(zhǎng)良好，證明試驗(yàn)成立；可根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算中和指數(shù)（見附錄B），待檢血清的中和指數(shù)大于50(Log＞1.7)，即可判定為陽(yáng)性；10～49(Log=1～1.6)為可疑；小于10(Log＜1)為陰性。PCR測(cè)序分析Blast比對(duì)為BCoVN基因，即判定為陽(yáng)性。8.5.5.4測(cè)序分析Blast比對(duì)為BCoVN基因，即判定為陽(yáng)性。8.5.5.4ELISA按ELISA試劑盒結(jié)果進(jìn)行判定，樣品結(jié)果符合陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)即判定為陽(yáng)性。血清學(xué)檢測(cè)采用中和試驗(yàn)（固定病毒-稀釋血清法）進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。發(fā)病初期和發(fā)病后2周各檢測(cè)1次。于1.5mL離心管中加入DMEM培養(yǎng)基，每管100μL；取56℃，30min滅活的血清100μL加入管內(nèi)，從第一個(gè)管開始做10倍連續(xù)稀釋，從最后一管內(nèi)棄去100μL液體。感作每個(gè)不同稀釋度的血清內(nèi)均加入100μLBCoV病毒液，充分混勻，37℃水浴感作1h。接種取200μL感作后的液體分別加至已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋梯度接種4孔；同時(shí)設(shè)血清毒性對(duì)照（細(xì)胞內(nèi)加最低稀釋度的血清）、1:10稀釋的BcoV陽(yáng)性血清對(duì)照、1:5稀釋的陰性血清對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照各4孔及BCoV病毒液回歸對(duì)照100～10-3的4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度各4孔。將細(xì)胞板置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察5d～7d，觀察并記錄各孔CPE。CPEReed-Muench（見附錄BCoV1:5發(fā)病初期和發(fā)病后2周中和試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，且發(fā)病后2周抗體效價(jià)達(dá)發(fā)病初期的4倍，即判定為牛冠狀病毒感染。9綜合判定疑似符合6.1、6.2、6.3，可判定為牛冠狀病毒腹瀉疑似病例。確診符合6.16.2PCRELISA檢測(cè)）符合6.1、6.2、6.3，同時(shí)符合7.6.6，可確診牛冠狀病毒腹瀉。附錄A（PBSNaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g蒸餾水定容至800mL，HCl調(diào)其pH至7.4左右，加蒸餾水定容至1000mL，121℃15min高壓滅菌。DMEM培基 44.5mLFBS 5mL青鏈素(10000U/mL) 500μL混合均勻后，4℃密封保存，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。DMEM培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基胰酶青鏈霉素(10000U/mL)44.5mL0.25g/mL500μL混合均勻后，4℃密封保存，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。A.450×TAE三羥甲基氨基甲烷（Tris）EDTA-2Na冰乙酸242g37.2g57.1mL942.9mLTris和EDTA-2Na溶于800mL1moL/LNaOH調(diào)pH8.31000mL501×TAE附錄B（規(guī)范性）中和試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算方法中和指數(shù)=待檢血清組TCID50/對(duì)照組TCID50待檢血清的中和指數(shù)大于50(Log＞1.7)，即可判定為陽(yáng)性；10～49(Log=1～1.6)為可疑；小于10(L