固相膜免疫測(cè)定

第十二第十二章固相膜免疫測(cè)定

隨著免疫學(xué)技術(shù)和相關(guān)生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)方法上派生出了多種類(lèi)型的固相膜免疫快速檢測(cè)試驗(yàn)。該類(lèi)試驗(yàn)的最大特點(diǎn)是不需要大型設(shè)備，對(duì)檢測(cè)人員稍加培訓(xùn)即能掌握操作要求和判定標(biāo)準(zhǔn)。

第一節(jié)概述

標(biāo)記免疫測(cè)定放射免疫測(cè)定1960’酶免疫測(cè)定1970’熒光免疫測(cè)定1980’－1990’化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定1990’－膜固相免疫測(cè)定1990’－一、免疫測(cè)定分類(lèi)免疫濁度測(cè)定Ag+AbAgAb+Ab標(biāo)記免疫測(cè)定

Ag+Ab*AgAb*+Ab*

（B）（F）二、免疫測(cè)定原理利用抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)本中微量物質(zhì)抗原+抗體抗原抗體復(fù)合物

Ag+Ab

Ag*Ab三、固相免疫測(cè)定B與F分離

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*AbAb四、固相膜的特點(diǎn)多孔性

毛細(xì)管作用非共價(jià)鍵高度吸附抗體或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作簡(jiǎn)便五、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜六、固相膜的技術(shù)要求孔徑：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強(qiáng)，以μg/cm2表示均一性第二節(jié)免疫金標(biāo)記技術(shù)

免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)

主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)。這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱(chēng)之為免疫金銀染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）。一、膠體金制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱(chēng)金溶膠（goldsolution）。

膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)

（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量膠體金（ColloidalGold）

15~60nm優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)膠體金結(jié)合物（Conjugate）膜固相免疫測(cè)定的特點(diǎn)第三節(jié)膜載體免疫測(cè)定的種類(lèi)與原理優(yōu)點(diǎn)不足之處簡(jiǎn)便，快速敏感度略低，價(jià)格略高（與ELISA比）單份測(cè)定精密度較差，質(zhì)控困難保存期長(zhǎng)（優(yōu)質(zhì)試劑）穩(wěn)定性較差（普通試劑）可測(cè)定物范圍廣（主要為定性試驗(yàn)）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標(biāo)志心肌標(biāo)志濫用藥物固相微孔膜測(cè)定種類(lèi)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫層析試驗(yàn)（immunochromatographyassay,ICA）斑點(diǎn)ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

一、免疫滲濾測(cè)定(IFA)IFA——雙抗體夾心法測(cè)抗原ABIFA——結(jié)果判斷二、免疫層析測(cè)定（ICA）ICA試劑條樣品墊結(jié)合物墊NC膜吸水墊ICA——雙抗體夾心法測(cè)抗原ICA——間接法測(cè)抗體ICA結(jié)果觀察

陽(yáng)性陰性無(wú)效IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個(gè)月室溫一年操作步驟3~51觀察時(shí)間3min3~20min陽(yáng)性反應(yīng)顏色濃度操作結(jié)束顏色不變顏色逐漸加深I(lǐng)FA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）GIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測(cè)抗體）陽(yáng)性陰性固相膜固相抗原待測(cè)抗體金標(biāo)記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體快速檢測(cè)（滲濾法）原理圖GIFA技術(shù)的發(fā)展第一代

1988HIVCHEK（DuPont）單點(diǎn)，5~10分鐘，血清，金標(biāo)試劑瓶裝凍干品改進(jìn)抗原HIV1+2，提高敏感度和特異性，縮短反應(yīng)時(shí)間，減少步驟，樣品多樣化。第八代INSTANTCHEKHIV1+22點(diǎn)（測(cè)試+控制）金標(biāo)試劑：?jiǎn)稳朔?、液體樣品：血清、血漿、全血、尿液第九~十二代

研制中單一試劑ICA技術(shù)的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒標(biāo)記ICAUnipath公司CLEARVIEW立明衣原體彩色膠乳標(biāo)記ICAROCHECardiacReaderTnT定量0.1~3ng/ml

合成TnT質(zhì)控點(diǎn)IFA肌紅蛋白雙孔法

S：測(cè)定孔

C：定量質(zhì)控

100μg/LIFA微量白蛋白單孔法

T：測(cè)定孔

C1：定量質(zhì)控30mg/LC2：定量質(zhì)控200mg/L

結(jié)果判定：（-）<30（+）30~100、（++）100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）參考值：30μg/L肝癌診斷值：>400μg/L結(jié)果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1測(cè)定線(xiàn)對(duì)照線(xiàn)半定量測(cè)定三、斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)

——Dot-ELISA四、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)

——

ELISPOT20世紀(jì)80年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌B細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌T細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。ELISPOT檢測(cè)原理

細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過(guò)CTL公司生產(chǎn)的ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。ELISPOT分析儀解決以下問(wèn)題哪些斑點(diǎn)是抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)具有進(jìn)一步分析價(jià)值），哪些是無(wú)關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)沒(méi)有T細(xì)胞研究?jī)r(jià)值）斑點(diǎn)大小的意義在對(duì)不同細(xì)胞因子計(jì)數(shù)和分析時(shí)，如何定義斑點(diǎn)最大和最小尺寸如何從單個(gè)細(xì)胞基礎(chǔ)上分析實(shí)驗(yàn)精確度有多高？如果一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子，在多大程度上會(huì)干擾分析結(jié)果？幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能使結(jié)果更有意義？ELISAPOTELISPOT結(jié)果判斷五、免疫印跡法——Westernblot法原理Westernblot——抗原表位可能被破壞而漏檢六、放射免疫沉淀試驗(yàn)原理放射免疫沉淀試