生物學(xué)第四章-生物氫氣課件

第四章生物氫氣隨著能源危機、環(huán)境污染、溫室效應(yīng)等問題的加劇，各國政府對清潔、可再生能源的研究投入正在不斷增加。氫氣因其相對密度低，燃燒熱值高，在轉(zhuǎn)化為熱能或電能時只產(chǎn)生水蒸氣，不會產(chǎn)生有毒氣體和溫室氣體，是最清潔的環(huán)保能源，特別適用于交通運輸，同時也是航天航空的理想燃料。因此，在21世紀氫能經(jīng)濟所描繪的藍圖中，氫氣是未來最理想的終端能源載體，它的實現(xiàn)將會為人類文明帶來新的變革。第四章生物氫氣隨著能源危機、環(huán)境污染、溫室效14.1.1氫氣的性質(zhì)4.1氫氣的燃料特性在各種氣體中（包括空氣等混合氣體），氫氣的相對密度最小。標(biāo)準狀況下（常壓與0℃時），H2以無色、無味無臭的氣體存在，1L氫氣的質(zhì)量是0.0899g；在常壓下，溫度為-252.87℃時，氫氣可轉(zhuǎn)變成無色的液體；溫度為-259.1℃時，變成雪狀固體。由于氫鍵鍵能大，燃燒1g氫能釋放出142kJ的熱能，是汽油發(fā)熱量的3倍。與汽油、天然氣、煤油相比，氫的質(zhì)量特別輕，攜帶、運送方便，因而是航天、航空等高速飛行交通工具最合適的燃料。4.1.1氫氣的性質(zhì)4.1氫氣的燃料特性在各種氣體2氫與氧氣反應(yīng)的火焰溫度可高達2500℃，因此也常是切割或者焊接鋼鐵材料的最佳燃料。氫氣可以被金屬氫化物、碳基吸附劑以及金屬-有機配位子結(jié)構(gòu)等多孔性且具有非常大表面積的材料大量吸附。當(dāng)外界加熱或加壓時，吸附于這些材料中的氫氣釋放出來，這是目前開發(fā)新型氫氣儲運方法的理論基礎(chǔ)。氫與氧氣反應(yīng)的火焰溫度可高達2500℃，因此也常是切割34.1.2氫的特性在大自然中，氫主要以化合態(tài)的形式存在于水、石油、煤炭、天然氣、各種生命有機體及其有機產(chǎn)物中。地球表面約71%為水所覆蓋，儲水量很大，其中海洋的總體積約為13.7億km3，因此，水是氫的大“倉庫”，以原子百分比表示，水中含有11%的氫。生物體及其所產(chǎn)生的各種有機物中也含有大量的氫，而地球上有機物歸根結(jié)底來源于光合作用，其中蘊藏的氫來源于水。由于氫氣燃燒后仍然形成水，所以，水和有機物是氫氣“取之不盡、用之不竭”的源泉，關(guān)鍵是用什么樣的方法從水中或來源于光合作用的各種有機物中制取氫氣。4.1.2氫的特性在大自然中，氫主要以化合態(tài)的形式存4生物制氫技術(shù)可以在常溫、常壓、能耗低、環(huán)境友好的條件下，從水或各種有機物中制取氫氣，這一技術(shù)將有望取代目前主要來源于鋼鐵廠、焦化廠、氯堿廠等的副產(chǎn)品回收純化及煤、烴類、天然氣和生物質(zhì)的水蒸氣重整技術(shù)。正因為如此，對生物制氫技術(shù)的研究正在受到人們普遍關(guān)注。2005年以來，有關(guān)生物制氫方面的論文數(shù)量和專利數(shù)量在急劇增加，這說明了生物制氫技術(shù)的研究步伐正在大大加快。生物制氫技術(shù)可以在常溫、常壓、能耗低、環(huán)境友好的條件下54.2生物制氫原理自Nakamura于1937年首次發(fā)現(xiàn)微生物的產(chǎn)氫現(xiàn)象，到目前為止已報道有20多個屬的細菌種類及真核生物綠藻具有產(chǎn)氫能力。其中，產(chǎn)氫細菌分屬兼性厭氧或厭氧發(fā)酵細菌、光合細菌、固氮菌和藍細菌四大類。依據(jù)產(chǎn)氫能力，目前備受關(guān)注的微生物產(chǎn)氫代謝途徑主要有三種：以厭氧或兼性厭氧微生物為主體的暗發(fā)酵產(chǎn)氫，它以各種廢棄生物質(zhì)為原料、工藝條件要求簡單、產(chǎn)氫速度最快，因此，暗發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)的研究進展最快，離規(guī)模化生產(chǎn)的距離最近；4.2生物制氫原理自Nakamura于1937年首次6以紫色光合細菌為主體的光發(fā)酵產(chǎn)氫，是暗發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳補充，既能在暗發(fā)酵產(chǎn)氫的基礎(chǔ)上，進一步提高底物向氫氣的轉(zhuǎn)化效率，又能消除暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程中積累的有機酸對環(huán)境危害的隱患，暗、光發(fā)酵偶聯(lián)制氫技術(shù)有望成為由廢棄物或廢水制氫的清潔生產(chǎn)工藝；藍細菌和綠藻進行裂解水制氫，盡管目前生物裂解水制氫技術(shù)在效率上仍處于劣勢，但其以水為制氫底物，在原料上具有優(yōu)勢。雖然，許多固氮菌也具有產(chǎn)氫能力，但是因為這類微生物產(chǎn)氫時需要的ATP來源于氧化有機物，而這些微生物氧化有機物產(chǎn)生ATP的效率非常低，所以，相對于以上其他產(chǎn)氫微生物，其產(chǎn)氫速率低，應(yīng)用前景不是很好。以紫色光合細菌為主體的光發(fā)酵產(chǎn)氫，是暗發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳補充74.2.1生物制氫的微生物學(xué)——依據(jù)產(chǎn)氫代謝途徑及產(chǎn)氫機理不同，我們將分別介紹光解水產(chǎn)氫的微藻和藍細菌、光發(fā)酵產(chǎn)氫的紫色光合細菌及暗發(fā)酵產(chǎn)氫的厭氧或兼性厭氧微生物。4.2.1.1光解水產(chǎn)氫的微生物近年，隨著對綠藻光水解制氫技術(shù)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了許多能夠用于生物制氫的綠藻，主要包括淡水微藻和海水微藻。萊茵衣藻是一種研究生物制氫的模式微藻，另外，斜生柵藻、海洋綠藻、亞心形扁藻和小球藻等都具有產(chǎn)氫的能力。4.2.1生物制氫的微生物學(xué)——依據(jù)產(chǎn)氫代謝途徑及產(chǎn)氫機理8能夠產(chǎn)生氫氣的藍細菌有固氮菌魚腥藻、海洋藍細菌顫藻、絲狀藍藻等和非固氮菌如聚球藻、黏桿藍細菌等。研究表明，魚腥藻屬藍細菌生成氫氣的能力遠遠高于其他藍細菌屬，其中，絲狀異型胞藍細菌和多變魚腥藍細菌都具有強大的產(chǎn)氫能力，因而受到人們的廣泛關(guān)注。

目前研究比較深入的放氫藍細菌主要有魚腥藻屬，念珠藻屬的幾種異型胞藍細菌如絲狀異型胞藍細菌、多變魚腥藍細菌和念珠藻，個別膠州灣聚球菌屬和集胞藻屬的藍細菌種類，它們的產(chǎn)氫速率為0.17—4.2μmolH2/(mgchla·h)。綠藻研究的種類也非常少，最常見的是萊茵衣藻，其最高速度低于2mL/(L·h)能夠產(chǎn)生氫氣的藍細菌有固氮菌魚腥藻、海洋藍細菌顫藻、絲9藍細菌或綠藻都具有兩個光合作用系統(tǒng)，其中，光合作用系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）能吸收光能分解水，產(chǎn)生質(zhì)子和電子，并同時產(chǎn)生氧氣。在厭氧條件下，所產(chǎn)生的電子會被傳遞給鐵氧還蛋白，然后分別由固氮酶或氫酶將電子傳遞給質(zhì)子進一步形成氫氣。但產(chǎn)氫的過程同時也是產(chǎn)氧的過程，而氧氣的存在會是固氮酶或氫酶的活性下降，所以在一般培養(yǎng)條件下，藍細菌或綠藻的產(chǎn)氫效率非常低，甚至不能產(chǎn)氫。研究者們希望通過傳統(tǒng)育種或基因工程的方法，來提高綠藻或藍細菌的光裂解水產(chǎn)氫效率。藍細菌或綠藻都具有兩個光合作用系統(tǒng)，其中，光合作用系統(tǒng)104.2.1.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物發(fā)酵產(chǎn)氫微生物可以在發(fā)酵過程中分解有機物產(chǎn)生氫氣、二氧化碳和各種有機酸。它包括梭菌科中的梭菌屬，丁酸芽孢桿菌屬，腸桿菌科的埃希氏菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬，瘤胃球菌屬，脫硫弧菌屬，檸檬酸桿菌屬，醋微菌屬，以及芽孢桿菌屬和乳桿菌屬的某些種。其中，研究比較多的是專性厭氧的梭菌科和兼性厭氧的腸桿科的微生物。不同種類的微生物對同一有機底物的產(chǎn)氫能力不同，通常嚴格厭氧菌高于兼性厭氧菌。隨著研究的廣泛開展，不斷有新的具有高效產(chǎn)氫能力的菌株被分離。4.2.1.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物發(fā)酵產(chǎn)氫微生物可以在11通過基因工程改造產(chǎn)氫微生物的代謝途徑將有助于提高它們的產(chǎn)氫能力。除了分離純化出來的純菌用于生物制氫，近幾年來，優(yōu)化選育后的混合菌群產(chǎn)氫更受關(guān)注。4.2.1.3光發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物在光照條件下，紫色硫細菌（莢硫菌屬和著色菌屬）利用無機物H2S，紫色非硫細菌（紅螺菌屬和紅細菌屬）利用有機物（各種有機物）作為質(zhì)子和電子供體產(chǎn)氫，由于這類反應(yīng)在厭氧條件下進行，類似于發(fā)酵過程，所以這種產(chǎn)氫方式常被稱為光發(fā)酵產(chǎn)氫。通過基因工程改造產(chǎn)氫微生物的代謝途徑將有助于提高它們的12紫色硫細菌和紫色非硫細菌具有PSⅠ,并由PSⅠ通過光合磷酸化提供給光發(fā)酵產(chǎn)氫的驅(qū)動力ATP，但這些微生物不具有PSⅡ，不能裂解水，所以不存在同時產(chǎn)氧氣的現(xiàn)象。目前常用來產(chǎn)氫的光合細菌種類主要有：深紅紅螺菌，沼澤紅假單胞菌，類球紅細菌，莢膜紅細菌等。由于光發(fā)酵產(chǎn)氫依賴于固氮酶催化，因此，銨抑制現(xiàn)象也是阻礙光發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。目前，科學(xué)家們更注重采用誘變、分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)手段相結(jié)合的辦法來選育產(chǎn)氫速率快、底物轉(zhuǎn)化效率高、光能利用效率高、利用底物或者有機廢棄物范圍廣、對銨離子的耐受能力高的優(yōu)良產(chǎn)氫菌株。紫色硫細菌和紫色非硫細菌具有PSⅠ,并由PSⅠ通過光合13同樣針對產(chǎn)氫光合細菌對光能的利用率比較低的現(xiàn)象，除了對吸氫酶進行敲除外，對其捕光系統(tǒng)的改造也是一個趨勢。研究發(fā)現(xiàn)能進行光發(fā)酵產(chǎn)氫的許多微生物在黑暗厭氧條件下也能進行發(fā)酵產(chǎn)氫。4.2.2生物制氫的關(guān)鍵性酶

光解水、厭氧發(fā)酵及光發(fā)酵產(chǎn)氫過程都涉及許多不同的代謝途徑，許多酶參與這些產(chǎn)氫代謝的催化，其中，固氮酶和氫酶是生物制氫的兩個最關(guān)鍵的酶。不同微生物類群或者利用氫酶產(chǎn)氫、或者利用固氮酶產(chǎn)氫：同是光裂解水產(chǎn)氫，微藻依靠氫酶產(chǎn)氫，藍細菌主要依靠固氮酶產(chǎn)氫，黑暗厭氧發(fā)酵微生物依賴氫酶產(chǎn)氫，而光發(fā)酵細菌依賴固氮酶產(chǎn)氫。同樣針對產(chǎn)氫光合細菌對光能的利用率比較低的現(xiàn)象，除了對14固氮酶是一種多功能的氧化還原酶，主要成分是鉬鐵蛋白和鐵蛋白，存在于能夠發(fā)生固氮作用的原核生物如固氮菌和光合細菌（包括藍細菌）中，該酶能夠把空氣中的N2轉(zhuǎn)化生成NH3或氨基酸，反應(yīng)式為：N2+8e-+8H++16ATP2NH4++16ADP+16Pi。固氮酶催化的還原反應(yīng)至少需要4個條件：鉬鐵蛋白、鐵蛋白、ATP電子供體和厭氧條件。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)無N2存在、還原底物只有H+時，固氮酶將所有電子用于還原H+生成氫氣，反應(yīng)式為：2e+2H++4ATPH2+4ADP+4Pi。4.2.2.1固氮酶固氮酶是一種多功能的氧化還原酶，主要成分是鉬15固氮酶還原分子氮為氨，也可以還原氮氣以外的叁鍵化合物，包括氰化物、乙炔及氮氧化物和質(zhì)子。乙炔還原為乙烯常被用來測定離體或整體的固氮酶活性。質(zhì)子還原的反應(yīng)就是光合產(chǎn)氫的生物學(xué)依據(jù)。由于固氮反應(yīng)需要消耗大量能量，固氮酶的合成和調(diào)控受嚴格控制：首先，固氮酶的活性對氧氣非常敏感。另外，固氮酶的合成和活性還受體內(nèi)體外氮源的豐富程度影響，當(dāng)?shù)闯渥銜r，固氮酶也是受抑制的，甚至基本不會表達，只有在氮饑餓時固氮酶才會高效表達。最后，固氮酶本身的活性還受到翻譯后修飾的調(diào)控。固氮酶還原分子氮為氨，也可以還原氮氣以外的叁鍵化合164.2.2.2氫酶氫酶是另一種參與產(chǎn)氫代謝的關(guān)鍵性酶，它催化氫氣與質(zhì)子相互轉(zhuǎn)化的反應(yīng)：H22H++2e-。氫酶存在于原核和真核生物中，按催化反應(yīng)的結(jié)果可分為放氫酶和吸氫酶兩種。氫酶是Fe-S蛋白，在它們的活性中心一般有兩個金屬原子。根據(jù)活性中心的金屬組成類型可以分為三類：活動中心由一個Fe原子和一個Ni原子組成的[NiFe]氫酶；由兩個Fe原子組成的[FeFe]氫酶；近年只在一些甲烷菌中發(fā)現(xiàn)的不含有Fe-S簇和Ni原子的無Fe-S簇氫酶或[Fe]氫酶，它的功能是生成氫氣的甲基四氫蝶呤脫氫酶。4.2.2.2氫酶氫酶是另一種參與產(chǎn)氫代謝174.2.3生物制氫的產(chǎn)氫機理藍細菌和綠藻的產(chǎn)氫具有兩個獨立但協(xié)調(diào)起作用的光合作用中心，即接收太陽能分解水產(chǎn)生H+、電子和O2的光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）以及產(chǎn)生還原劑用來固定CO2的光合系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）。PSⅡ產(chǎn)生的電子經(jīng)由PSⅠ再由鐵氧還蛋白攜帶至氫酶（綠藻）或固氮酶（藍細菌），在厭氧條件下，H+在氫酶或固氮酶的催化作用下形成H2，同時，電子也可能經(jīng)由鐵氧化還原蛋白傳遞至NAD(P)+，形成NAD(P)H用于固定二氧化氮，生成碳水化合物（圖4.1）。4.2.3.1藍細菌和綠藻的光解水產(chǎn)氫機理4.2.3生物制氫的產(chǎn)氫機理藍細菌和綠藻的18H+H+低高CH2OATP合成酶H+ATPNAD(P)H+ATP+CO2PSⅠe-FdFpNAD(P)HPCe-H+H+Cytb6fH+太陽光太陽光氫酶e-H+H2PSⅡH2OH++O2e-H+QQH2圖4.1微藻光解水產(chǎn)氫過程電子傳遞示意圖H+H+低高CH2OATP合成酶H+ATPNAD(P)H+A19綠色植物由于沒有氫酶或固氮酶，所以不能產(chǎn)生氫氣，這是藻類和綠色植物光合作用過程的重要區(qū)別所在。因此除氫氣的形成外，綠藻的作用機理和綠色植物光合作用機理相似，綠色植物的光合作用規(guī)律和研究結(jié)論可以用于藻類新陳代謝過程分析。藍細菌和微藻均可光裂解水產(chǎn)生氫氣，它們的產(chǎn)氫機制也基本相似，需要強調(diào)的是，微藻在光照和厭氧條件下的產(chǎn)氫由氫酶催化，但藍細菌的產(chǎn)氫主要由固氮酶催化。微藻的氫酶屬于[FeFe]氫酶，為雙向氫酶。綠色植物由于沒有氫酶或固氮酶，所以不能產(chǎn)生氫氣，這是204.2.3.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫產(chǎn)氫微生物能夠根據(jù)自身的生理代謝特征，通過發(fā)酵作用，在逐步分解有機底物的過程中產(chǎn)生分子氫。目前發(fā)現(xiàn)細菌黑暗厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氫途徑主要分為三種：丙酮酸脫氫途徑甲酸裂解途徑NADH+H+產(chǎn)氫途徑4.2.3.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫產(chǎn)氫微生物能夠根據(jù)自身的生21梭狀芽孢桿菌類專性厭氧微生物主要為丙酮酸脫氫發(fā)酵型產(chǎn)氫細菌，直接產(chǎn)氫過程發(fā)生于丙酮酸脫羧作用中，丙酮酸首先在丙酮酸脫氫酶的作用下脫羧，形成硫胺素焦磷酸-酶的復(fù)合物，將電子轉(zhuǎn)移給鐵氧還蛋白，形成還原態(tài)的鐵氧還蛋白（Fdred）,然后在氫酶的作用下被重新氧化成氧化態(tài)的鐵氧還蛋白（Fdox）,并產(chǎn)生分子氫；腸桿菌類兼性厭氧微生物屬于甲酸裂解型發(fā)酵產(chǎn)氫菌，直接產(chǎn)氫過程也發(fā)生于丙酮酸脫梭過程中，丙酮酸脫羧后形成的甲酸（也包括厭氧環(huán)境中CO2和H2生成的甲酸），通過鐵氧還蛋白和氫酶作用分解為CO2和H2。

NADH+H+產(chǎn)氫途徑的產(chǎn)氫能力取決于NADH+H+的剩余量和轉(zhuǎn)化率。梭狀芽孢桿菌類專性厭氧微生物主要為丙酮酸脫氫發(fā)酵型產(chǎn)22CH3COCOOH丙酮酸脫氫酶CO2CH3—C—TPP—EOHHSCoATPP-ECH3COSCoA2Fe3+2Fe2+8FeFd2H+H2ACH3COCOOHHCOOHHSCoA丙酮酸甲酸裂解酶CH3COSCoACO22Fe2+2Fe3+FdH22H+圖4.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫途徑BA.梭桿菌屬的丙酮酸脫氫途徑；B.腸桿菌的甲酸裂解途徑CH3COCOOH丙酮酸脫氫酶CO2CH3—C—TPP—EO23在暗發(fā)酵產(chǎn)氫中，通常是將復(fù)雜的糖類水解后生成單糖，單糖通過丙酮酸途徑實現(xiàn)分解，產(chǎn)生氫氣的同時伴隨著一些低分子有機酸和醇類產(chǎn)生。也正是因為大量的有機酸或醇類產(chǎn)生，使得單糖轉(zhuǎn)化成氫氣的理論值也較低。微生物的糖降解經(jīng)過丙酮酸主要有EMP途徑、HMP途徑、ED途徑、PK途徑。丙酮酸經(jīng)發(fā)酵后轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等。根據(jù)丙酮酸的不同去路，可以將各種發(fā)酵產(chǎn)氫途徑分為丁酸型發(fā)酵、乙酸型發(fā)酵、丁醇型發(fā)酵、混合型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑。其中，梭狀芽孢桿菌屬主要為丁酸型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑；腸桿菌主要為混合型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑；丙酮-丁醇梭菌和拜氏梭菌主要為丁醇型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑；梭菌屬中部分細菌、瘤胃球菌屬、在暗發(fā)酵產(chǎn)氫中，通常是將復(fù)雜的糖類水解后生成單糖，單24擬桿菌屬等主要為乙醇型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑。可溶性糖類，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉等的發(fā)酵以丁酸型發(fā)酵為主，這是一種經(jīng)典的發(fā)酵產(chǎn)氫方式，發(fā)酵產(chǎn)生的末端產(chǎn)物主要為丁酸、乙酸、H2、CO2和少量的丙酸，如圖4.3所示。一些糖類在發(fā)酵過程中，經(jīng)EMP途徑產(chǎn)生的NADH+H+通過與一定比例的丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等發(fā)酵過程相偶聯(lián)而氧化為NAD+，來保證代謝過程中的NADH/NAD+的平衡。為了避免NADH+H+的積累從而保證代謝的正常進行，發(fā)酵細菌可以通過釋放H2的方式將過量的NADH+H+氧化，反應(yīng)式為：NADH+H+NAD++

H2，此反應(yīng)是在NADH鐵氧還蛋白氧化還原酶、鐵氧還蛋白氫化酶作用下完成，其末端產(chǎn)物主要是丙酸和乙酸，氣體產(chǎn)物非常少，一些學(xué)者把這種制氫稱作為丙酸型發(fā)酵制氫。擬桿菌屬等主要為乙醇型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑?？扇苄蕴穷?，如葡萄糖、蔗25葡萄糖丙酮酸NADHNAD乙酰CoA丁縮醛CoAFdoxFdredNADHNADH2HSCoACO2乙酰磷酸乙酸丁酸圖4.3丁酸型發(fā)酵途徑葡萄糖丙酮酸NADHNAD乙酰CoA丁縮醛CoAFdoxFd26乙醇型產(chǎn)氫途徑與傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵不同，傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵沒有氫氣產(chǎn)生，而乙醇型產(chǎn)氫途徑產(chǎn)生乙醇和乙酸的同時有氫氣產(chǎn)生，主要末端發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇、乙酸、H2、CO2和少量丁酸，如圖4.4所示。乙醇葡萄糖丙酮酸NADHNAD乙酰CoA乙醛FdoxFdredNADHNADH2HSCoACO2HSCoANADHNAD圖4.4乙醇型發(fā)酵途徑乙醇型產(chǎn)氫途徑與傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵不同，傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵沒274.2.3.3光合細菌制氫在產(chǎn)氫光合細菌中，外源性有機物，特別是各種有機酸作為電子供體，通過EMP和TCA循環(huán)生成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、CO2以及電子，這些電子通過胞內(nèi)的電子傳遞鏈傳至光反應(yīng)中心，低能態(tài)的電子在光反應(yīng)中心受到光的激發(fā)，生成高能態(tài)的電子。高能態(tài)的電子一部分離開電子傳遞鏈被傳遞給鐵氧還蛋白，鐵氧還蛋白則又將電子傳給固氮酶；另一部分的電子則在電子傳遞中傳遞，通過光合磷酸化途徑并生成ATP。在光照條件下，固氮酶利用ATP、質(zhì)子和電子生產(chǎn)氫氣，氫酶主要起吸氫作用，以回收部分能量。光合細菌產(chǎn)氫的機理和途徑見圖4.5.4.2.3.3光合細菌制氫在產(chǎn)氫光合細菌中，外源28光收集系統(tǒng)和光反應(yīng)中心鐵醌泛琨e-e-鐵氧化蛋白鐵還原蛋白細胞色素c細胞色素be-e-e-ATPADP+Pi碳源代謝系統(tǒng)（EMP，TCA等）底物電子供體e-H++CO2ATPADP+Pi固氮酶氫酶H2e-圖4.5光合細菌產(chǎn)氫的機理和途徑光收集系統(tǒng)鐵醌e-e-鐵氧化蛋白鐵還原蛋白細胞色素c細胞色素29光合細菌所固有的只有一個光合作用中心的特殊簡單結(jié)構(gòu)，決定了它所固有的相對較高的光轉(zhuǎn)化效率，以及提高光轉(zhuǎn)化效率的巨大潛力。由于固氮酶的表達及活性受銨抑制調(diào)控，因此，光發(fā)酵產(chǎn)氫也同樣受銨離子濃度的影響。在光發(fā)酵產(chǎn)氫的過程中同時伴隨著吸氫現(xiàn)象，在發(fā)酵過程中，吸氫活性增加，固氮酶活性較弱，產(chǎn)氫量減少。對各類微生物的產(chǎn)氫機理的解析，將對優(yōu)化生物產(chǎn)氫工藝條件，包括光能、溫度、pH、氣相組成和培養(yǎng)基營養(yǎng)組成等具有很好的指導(dǎo)作用，也將為通過代謝工程提高微生物的產(chǎn)氫效率奠定基礎(chǔ)。光合細菌所固有的只有一個光合作用中心的特殊簡單結(jié)構(gòu)，30藍細菌和微藻的光解水產(chǎn)氫以水作為唯一的質(zhì)子與電子的供體。盡管與其他生物產(chǎn)氫途徑相比，目前生物裂解水制氫技術(shù)在效率上仍處于劣勢，但其以水為制氫底物，在原料成本上具有優(yōu)勢，因此，光解水產(chǎn)氫技術(shù)一直是人類希望實現(xiàn)的目標(biāo)。厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫與光合細菌發(fā)酵產(chǎn)氫都需要有機物作為產(chǎn)氫原料。許多暗發(fā)酵產(chǎn)氫微生物都能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉產(chǎn)氫，有的暗發(fā)酵微生物還能利用五碳糖、木聚糖產(chǎn)氫，還有些微生物能利用纖維素產(chǎn)氫。研究表明不同微生物利用同一種原料，或者同一種微生物利用不同的原料，其產(chǎn)氫效率或產(chǎn)氫速度也會有差異。一些厭氧發(fā)酵微生物也可以利用纖維素類物質(zhì)產(chǎn)氫。4.3生物制氫原料藍細菌和微藻的光解水產(chǎn)氫以水作為唯一的質(zhì)子與電子的供31雖然許多光合細菌也能利用單糖產(chǎn)氫進行還有些微生物能利用纖維素產(chǎn)氫。研究表明不同微生物利用同一種原料，或者同一種微生物利用不同的原料，其產(chǎn)氫效率或產(chǎn)氫速度也會有差異。一些厭氧發(fā)酵微生物也可以利用纖維素類物質(zhì)產(chǎn)氫。雖然許多光合細菌也能利用單糖產(chǎn)氫進行光發(fā)酵產(chǎn)氫，有的還可以利用蔗糖、果糖產(chǎn)氫，但利用糖類的產(chǎn)氫效率一般低于以有機酸為底物的產(chǎn)氫效率。所以，各種有機酸，特別是三羧酸循環(huán)中的各種有機酸，是大多數(shù)光合細菌進行光發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳原料。但許多微生物只能利用上面所描述底物中的一部分進行產(chǎn)氫，所以，通過馴化或選育來增加產(chǎn)氫微生物的底物范圍，也是目前生物產(chǎn)氫技術(shù)研究中的方向之一。雖然許多光合細菌也能利用單糖產(chǎn)氫進行還有些微生物能利32為了降低制氫成本，也為了生物制氫技術(shù)同時能治理環(huán)境，近年來許多研究者都在嘗試利用各種廢棄生物質(zhì)，包括農(nóng)業(yè)廢棄物、生活垃圾或者有機廢水進行生物產(chǎn)氫。已經(jīng)嘗試過用于厭氧暗發(fā)酵生物制氫的廢棄原料有：各種作物秸稈（纖維素）、食品加工廢水、橄欖油加工廢水、牛奶加工廢水、釀酒廢水、檸檬酸生產(chǎn)廢水、糖蜜廢水、櫥余垃圾以及城市固體廢棄物或者污泥處理廠的污泥等。光合細菌的光發(fā)酵產(chǎn)氫底物也可以來源于各種廢水。如果將光發(fā)酵產(chǎn)氫與暗發(fā)酵產(chǎn)氫進行偶聯(lián)，那么可以更有效地利用各種組成復(fù)雜的有機廢水產(chǎn)氫。由此可見，光合細菌既可以將工業(yè)有機酸廢水和工業(yè)發(fā)酵廢水直接轉(zhuǎn)化為清潔能源，同時又可以降低廢水中COD，具有減少環(huán)境污染和產(chǎn)生氫能的雙重作用，這將是很有前景的研究方向。為了降低制氫成本，也為了生物制氫技術(shù)同時能治理環(huán)境，334.4生物制氫工藝（自學(xué)）4.5生物制氫實踐目前有關(guān)生物制氫技術(shù)的研究多處于實驗室研究階段，而且，目前生物制氫的產(chǎn)氫成本尚無法與工業(yè)廢氣回收制氫競爭。利用暗發(fā)酵速度較快，產(chǎn)量較多，能廣泛利用廢棄生物質(zhì)和工業(yè)有機廢水發(fā)酵產(chǎn)氫。如“生物制氫-產(chǎn)甲烷發(fā)酵-交叉流好氧”為主體的高濃度有機廢水生物制氫和廢水處理綜合工藝系統(tǒng)。預(yù)處理廢棄物暗發(fā)酵氣體分離氫氣二氧化碳暗發(fā)酵液再次發(fā)酵再次產(chǎn)氫或產(chǎn)甲烷圖4.生物產(chǎn)氫中試主要工業(yè)流程4.4生物制氫工藝（自學(xué)）4.5生物制氫實踐目前34生物制氫將廢棄物資源化、能源化和環(huán)?；跒橐惑w，具有環(huán)節(jié)國家能源緊張同時減少環(huán)境污染的雙重作用，是非常有發(fā)展前途的生物技術(shù)。但是，生物制氫技術(shù)從實驗室研究走向大規(guī)模應(yīng)用還有許多基礎(chǔ)理論問題和工程技術(shù)問題需要解決。今后的研究重點應(yīng)主要集中在：繼續(xù)篩選自然界中具有高效發(fā)酵產(chǎn)氫活性的微生物；尋找最佳的產(chǎn)氫條件，提高固氮酶、雙向氫酶和其他負責(zé)調(diào)控產(chǎn)氫效率的重要功能酶的催化活性及抗逆性；利用定點突變、基因敲除、代謝途徑的改變等分子生物學(xué)和遺傳學(xué)技術(shù)手段，得到高效率產(chǎn)氫的工程菌株。生物制氫將廢棄物資源化、能源化和環(huán)保化融為一體，具有35作業(yè)：1.簡述微生物制氫種類、途徑。2.微生物制氫關(guān)鍵酶有哪些？作業(yè)：36第四章生物氫氣隨著能源危機、環(huán)境污染、溫室效應(yīng)等問題的加劇，各國政府對清潔、可再生能源的研究投入正在不斷增加。氫氣因其相對密度低，燃燒熱值高，在轉(zhuǎn)化為熱能或電能時只產(chǎn)生水蒸氣，不會產(chǎn)生有毒氣體和溫室氣體，是最清潔的環(huán)保能源，特別適用于交通運輸，同時也是航天航空的理想燃料。因此，在21世紀氫能經(jīng)濟所描繪的藍圖中，氫氣是未來最理想的終端能源載體，它的實現(xiàn)將會為人類文明帶來新的變革。第四章生物氫氣隨著能源危機、環(huán)境污染、溫室效374.1.1氫氣的性質(zhì)4.1氫氣的燃料特性在各種氣體中（包括空氣等混合氣體），氫氣的相對密度最小。標(biāo)準狀況下（常壓與0℃時），H2以無色、無味無臭的氣體存在，1L氫氣的質(zhì)量是0.0899g；在常壓下，溫度為-252.87℃時，氫氣可轉(zhuǎn)變成無色的液體；溫度為-259.1℃時，變成雪狀固體。由于氫鍵鍵能大，燃燒1g氫能釋放出142kJ的熱能，是汽油發(fā)熱量的3倍。與汽油、天然氣、煤油相比，氫的質(zhì)量特別輕，攜帶、運送方便，因而是航天、航空等高速飛行交通工具最合適的燃料。4.1.1氫氣的性質(zhì)4.1氫氣的燃料特性在各種氣體38氫與氧氣反應(yīng)的火焰溫度可高達2500℃，因此也常是切割或者焊接鋼鐵材料的最佳燃料。氫氣可以被金屬氫化物、碳基吸附劑以及金屬-有機配位子結(jié)構(gòu)等多孔性且具有非常大表面積的材料大量吸附。當(dāng)外界加熱或加壓時，吸附于這些材料中的氫氣釋放出來，這是目前開發(fā)新型氫氣儲運方法的理論基礎(chǔ)。氫與氧氣反應(yīng)的火焰溫度可高達2500℃，因此也常是切割394.1.2氫的特性在大自然中，氫主要以化合態(tài)的形式存在于水、石油、煤炭、天然氣、各種生命有機體及其有機產(chǎn)物中。地球表面約71%為水所覆蓋，儲水量很大，其中海洋的總體積約為13.7億km3，因此，水是氫的大“倉庫”，以原子百分比表示，水中含有11%的氫。生物體及其所產(chǎn)生的各種有機物中也含有大量的氫，而地球上有機物歸根結(jié)底來源于光合作用，其中蘊藏的氫來源于水。由于氫氣燃燒后仍然形成水，所以，水和有機物是氫氣“取之不盡、用之不竭”的源泉，關(guān)鍵是用什么樣的方法從水中或來源于光合作用的各種有機物中制取氫氣。4.1.2氫的特性在大自然中，氫主要以化合態(tài)的形式存40生物制氫技術(shù)可以在常溫、常壓、能耗低、環(huán)境友好的條件下，從水或各種有機物中制取氫氣，這一技術(shù)將有望取代目前主要來源于鋼鐵廠、焦化廠、氯堿廠等的副產(chǎn)品回收純化及煤、烴類、天然氣和生物質(zhì)的水蒸氣重整技術(shù)。正因為如此，對生物制氫技術(shù)的研究正在受到人們普遍關(guān)注。2005年以來，有關(guān)生物制氫方面的論文數(shù)量和專利數(shù)量在急劇增加，這說明了生物制氫技術(shù)的研究步伐正在大大加快。生物制氫技術(shù)可以在常溫、常壓、能耗低、環(huán)境友好的條件下414.2生物制氫原理自Nakamura于1937年首次發(fā)現(xiàn)微生物的產(chǎn)氫現(xiàn)象，到目前為止已報道有20多個屬的細菌種類及真核生物綠藻具有產(chǎn)氫能力。其中，產(chǎn)氫細菌分屬兼性厭氧或厭氧發(fā)酵細菌、光合細菌、固氮菌和藍細菌四大類。依據(jù)產(chǎn)氫能力，目前備受關(guān)注的微生物產(chǎn)氫代謝途徑主要有三種：以厭氧或兼性厭氧微生物為主體的暗發(fā)酵產(chǎn)氫，它以各種廢棄生物質(zhì)為原料、工藝條件要求簡單、產(chǎn)氫速度最快，因此，暗發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)的研究進展最快，離規(guī)模化生產(chǎn)的距離最近；4.2生物制氫原理自Nakamura于1937年首次42以紫色光合細菌為主體的光發(fā)酵產(chǎn)氫，是暗發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳補充，既能在暗發(fā)酵產(chǎn)氫的基礎(chǔ)上，進一步提高底物向氫氣的轉(zhuǎn)化效率，又能消除暗發(fā)酵產(chǎn)氫過程中積累的有機酸對環(huán)境危害的隱患，暗、光發(fā)酵偶聯(lián)制氫技術(shù)有望成為由廢棄物或廢水制氫的清潔生產(chǎn)工藝；藍細菌和綠藻進行裂解水制氫，盡管目前生物裂解水制氫技術(shù)在效率上仍處于劣勢，但其以水為制氫底物，在原料上具有優(yōu)勢。雖然，許多固氮菌也具有產(chǎn)氫能力，但是因為這類微生物產(chǎn)氫時需要的ATP來源于氧化有機物，而這些微生物氧化有機物產(chǎn)生ATP的效率非常低，所以，相對于以上其他產(chǎn)氫微生物，其產(chǎn)氫速率低，應(yīng)用前景不是很好。以紫色光合細菌為主體的光發(fā)酵產(chǎn)氫，是暗發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳補充434.2.1生物制氫的微生物學(xué)——依據(jù)產(chǎn)氫代謝途徑及產(chǎn)氫機理不同，我們將分別介紹光解水產(chǎn)氫的微藻和藍細菌、光發(fā)酵產(chǎn)氫的紫色光合細菌及暗發(fā)酵產(chǎn)氫的厭氧或兼性厭氧微生物。4.2.1.1光解水產(chǎn)氫的微生物近年，隨著對綠藻光水解制氫技術(shù)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了許多能夠用于生物制氫的綠藻，主要包括淡水微藻和海水微藻。萊茵衣藻是一種研究生物制氫的模式微藻，另外，斜生柵藻、海洋綠藻、亞心形扁藻和小球藻等都具有產(chǎn)氫的能力。4.2.1生物制氫的微生物學(xué)——依據(jù)產(chǎn)氫代謝途徑及產(chǎn)氫機理44能夠產(chǎn)生氫氣的藍細菌有固氮菌魚腥藻、海洋藍細菌顫藻、絲狀藍藻等和非固氮菌如聚球藻、黏桿藍細菌等。研究表明，魚腥藻屬藍細菌生成氫氣的能力遠遠高于其他藍細菌屬，其中，絲狀異型胞藍細菌和多變魚腥藍細菌都具有強大的產(chǎn)氫能力，因而受到人們的廣泛關(guān)注。

目前研究比較深入的放氫藍細菌主要有魚腥藻屬，念珠藻屬的幾種異型胞藍細菌如絲狀異型胞藍細菌、多變魚腥藍細菌和念珠藻，個別膠州灣聚球菌屬和集胞藻屬的藍細菌種類，它們的產(chǎn)氫速率為0.17—4.2μmolH2/(mgchla·h)。綠藻研究的種類也非常少，最常見的是萊茵衣藻，其最高速度低于2mL/(L·h)能夠產(chǎn)生氫氣的藍細菌有固氮菌魚腥藻、海洋藍細菌顫藻、絲45藍細菌或綠藻都具有兩個光合作用系統(tǒng)，其中，光合作用系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）能吸收光能分解水，產(chǎn)生質(zhì)子和電子，并同時產(chǎn)生氧氣。在厭氧條件下，所產(chǎn)生的電子會被傳遞給鐵氧還蛋白，然后分別由固氮酶或氫酶將電子傳遞給質(zhì)子進一步形成氫氣。但產(chǎn)氫的過程同時也是產(chǎn)氧的過程，而氧氣的存在會是固氮酶或氫酶的活性下降，所以在一般培養(yǎng)條件下，藍細菌或綠藻的產(chǎn)氫效率非常低，甚至不能產(chǎn)氫。研究者們希望通過傳統(tǒng)育種或基因工程的方法，來提高綠藻或藍細菌的光裂解水產(chǎn)氫效率。藍細菌或綠藻都具有兩個光合作用系統(tǒng)，其中，光合作用系統(tǒng)464.2.1.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物發(fā)酵產(chǎn)氫微生物可以在發(fā)酵過程中分解有機物產(chǎn)生氫氣、二氧化碳和各種有機酸。它包括梭菌科中的梭菌屬，丁酸芽孢桿菌屬，腸桿菌科的埃希氏菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬，瘤胃球菌屬，脫硫弧菌屬，檸檬酸桿菌屬，醋微菌屬，以及芽孢桿菌屬和乳桿菌屬的某些種。其中，研究比較多的是專性厭氧的梭菌科和兼性厭氧的腸桿科的微生物。不同種類的微生物對同一有機底物的產(chǎn)氫能力不同，通常嚴格厭氧菌高于兼性厭氧菌。隨著研究的廣泛開展，不斷有新的具有高效產(chǎn)氫能力的菌株被分離。4.2.1.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物發(fā)酵產(chǎn)氫微生物可以在47通過基因工程改造產(chǎn)氫微生物的代謝途徑將有助于提高它們的產(chǎn)氫能力。除了分離純化出來的純菌用于生物制氫，近幾年來，優(yōu)化選育后的混合菌群產(chǎn)氫更受關(guān)注。4.2.1.3光發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物在光照條件下，紫色硫細菌（莢硫菌屬和著色菌屬）利用無機物H2S，紫色非硫細菌（紅螺菌屬和紅細菌屬）利用有機物（各種有機物）作為質(zhì)子和電子供體產(chǎn)氫，由于這類反應(yīng)在厭氧條件下進行，類似于發(fā)酵過程，所以這種產(chǎn)氫方式常被稱為光發(fā)酵產(chǎn)氫。通過基因工程改造產(chǎn)氫微生物的代謝途徑將有助于提高它們的48紫色硫細菌和紫色非硫細菌具有PSⅠ,并由PSⅠ通過光合磷酸化提供給光發(fā)酵產(chǎn)氫的驅(qū)動力ATP，但這些微生物不具有PSⅡ，不能裂解水，所以不存在同時產(chǎn)氧氣的現(xiàn)象。目前常用來產(chǎn)氫的光合細菌種類主要有：深紅紅螺菌，沼澤紅假單胞菌，類球紅細菌，莢膜紅細菌等。由于光發(fā)酵產(chǎn)氫依賴于固氮酶催化，因此，銨抑制現(xiàn)象也是阻礙光發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。目前，科學(xué)家們更注重采用誘變、分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)手段相結(jié)合的辦法來選育產(chǎn)氫速率快、底物轉(zhuǎn)化效率高、光能利用效率高、利用底物或者有機廢棄物范圍廣、對銨離子的耐受能力高的優(yōu)良產(chǎn)氫菌株。紫色硫細菌和紫色非硫細菌具有PSⅠ,并由PSⅠ通過光合49同樣針對產(chǎn)氫光合細菌對光能的利用率比較低的現(xiàn)象，除了對吸氫酶進行敲除外，對其捕光系統(tǒng)的改造也是一個趨勢。研究發(fā)現(xiàn)能進行光發(fā)酵產(chǎn)氫的許多微生物在黑暗厭氧條件下也能進行發(fā)酵產(chǎn)氫。4.2.2生物制氫的關(guān)鍵性酶

光解水、厭氧發(fā)酵及光發(fā)酵產(chǎn)氫過程都涉及許多不同的代謝途徑，許多酶參與這些產(chǎn)氫代謝的催化，其中，固氮酶和氫酶是生物制氫的兩個最關(guān)鍵的酶。不同微生物類群或者利用氫酶產(chǎn)氫、或者利用固氮酶產(chǎn)氫：同是光裂解水產(chǎn)氫，微藻依靠氫酶產(chǎn)氫，藍細菌主要依靠固氮酶產(chǎn)氫，黑暗厭氧發(fā)酵微生物依賴氫酶產(chǎn)氫，而光發(fā)酵細菌依賴固氮酶產(chǎn)氫。同樣針對產(chǎn)氫光合細菌對光能的利用率比較低的現(xiàn)象，除了對50固氮酶是一種多功能的氧化還原酶，主要成分是鉬鐵蛋白和鐵蛋白，存在于能夠發(fā)生固氮作用的原核生物如固氮菌和光合細菌（包括藍細菌）中，該酶能夠把空氣中的N2轉(zhuǎn)化生成NH3或氨基酸，反應(yīng)式為：N2+8e-+8H++16ATP2NH4++16ADP+16Pi。固氮酶催化的還原反應(yīng)至少需要4個條件：鉬鐵蛋白、鐵蛋白、ATP電子供體和厭氧條件。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)無N2存在、還原底物只有H+時，固氮酶將所有電子用于還原H+生成氫氣，反應(yīng)式為：2e+2H++4ATPH2+4ADP+4Pi。4.2.2.1固氮酶固氮酶是一種多功能的氧化還原酶，主要成分是鉬51固氮酶還原分子氮為氨，也可以還原氮氣以外的叁鍵化合物，包括氰化物、乙炔及氮氧化物和質(zhì)子。乙炔還原為乙烯常被用來測定離體或整體的固氮酶活性。質(zhì)子還原的反應(yīng)就是光合產(chǎn)氫的生物學(xué)依據(jù)。由于固氮反應(yīng)需要消耗大量能量，固氮酶的合成和調(diào)控受嚴格控制：首先，固氮酶的活性對氧氣非常敏感。另外，固氮酶的合成和活性還受體內(nèi)體外氮源的豐富程度影響，當(dāng)?shù)闯渥銜r，固氮酶也是受抑制的，甚至基本不會表達，只有在氮饑餓時固氮酶才會高效表達。最后，固氮酶本身的活性還受到翻譯后修飾的調(diào)控。固氮酶還原分子氮為氨，也可以還原氮氣以外的叁鍵化合524.2.2.2氫酶氫酶是另一種參與產(chǎn)氫代謝的關(guān)鍵性酶，它催化氫氣與質(zhì)子相互轉(zhuǎn)化的反應(yīng)：H22H++2e-。氫酶存在于原核和真核生物中，按催化反應(yīng)的結(jié)果可分為放氫酶和吸氫酶兩種。氫酶是Fe-S蛋白，在它們的活性中心一般有兩個金屬原子。根據(jù)活性中心的金屬組成類型可以分為三類：活動中心由一個Fe原子和一個Ni原子組成的[NiFe]氫酶；由兩個Fe原子組成的[FeFe]氫酶；近年只在一些甲烷菌中發(fā)現(xiàn)的不含有Fe-S簇和Ni原子的無Fe-S簇氫酶或[Fe]氫酶，它的功能是生成氫氣的甲基四氫蝶呤脫氫酶。4.2.2.2氫酶氫酶是另一種參與產(chǎn)氫代謝534.2.3生物制氫的產(chǎn)氫機理藍細菌和綠藻的產(chǎn)氫具有兩個獨立但協(xié)調(diào)起作用的光合作用中心，即接收太陽能分解水產(chǎn)生H+、電子和O2的光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）以及產(chǎn)生還原劑用來固定CO2的光合系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）。PSⅡ產(chǎn)生的電子經(jīng)由PSⅠ再由鐵氧還蛋白攜帶至氫酶（綠藻）或固氮酶（藍細菌），在厭氧條件下，H+在氫酶或固氮酶的催化作用下形成H2，同時，電子也可能經(jīng)由鐵氧化還原蛋白傳遞至NAD(P)+，形成NAD(P)H用于固定二氧化氮，生成碳水化合物（圖4.1）。4.2.3.1藍細菌和綠藻的光解水產(chǎn)氫機理4.2.3生物制氫的產(chǎn)氫機理藍細菌和綠藻的54H+H+低高CH2OATP合成酶H+ATPNAD(P)H+ATP+CO2PSⅠe-FdFpNAD(P)HPCe-H+H+Cytb6fH+太陽光太陽光氫酶e-H+H2PSⅡH2OH++O2e-H+QQH2圖4.1微藻光解水產(chǎn)氫過程電子傳遞示意圖H+H+低高CH2OATP合成酶H+ATPNAD(P)H+A55綠色植物由于沒有氫酶或固氮酶，所以不能產(chǎn)生氫氣，這是藻類和綠色植物光合作用過程的重要區(qū)別所在。因此除氫氣的形成外，綠藻的作用機理和綠色植物光合作用機理相似，綠色植物的光合作用規(guī)律和研究結(jié)論可以用于藻類新陳代謝過程分析。藍細菌和微藻均可光裂解水產(chǎn)生氫氣，它們的產(chǎn)氫機制也基本相似，需要強調(diào)的是，微藻在光照和厭氧條件下的產(chǎn)氫由氫酶催化，但藍細菌的產(chǎn)氫主要由固氮酶催化。微藻的氫酶屬于[FeFe]氫酶，為雙向氫酶。綠色植物由于沒有氫酶或固氮酶，所以不能產(chǎn)生氫氣，這是564.2.3.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫產(chǎn)氫微生物能夠根據(jù)自身的生理代謝特征，通過發(fā)酵作用，在逐步分解有機底物的過程中產(chǎn)生分子氫。目前發(fā)現(xiàn)細菌黑暗厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氫途徑主要分為三種：丙酮酸脫氫途徑甲酸裂解途徑NADH+H+產(chǎn)氫途徑4.2.3.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫產(chǎn)氫微生物能夠根據(jù)自身的生57梭狀芽孢桿菌類專性厭氧微生物主要為丙酮酸脫氫發(fā)酵型產(chǎn)氫細菌，直接產(chǎn)氫過程發(fā)生于丙酮酸脫羧作用中，丙酮酸首先在丙酮酸脫氫酶的作用下脫羧，形成硫胺素焦磷酸-酶的復(fù)合物，將電子轉(zhuǎn)移給鐵氧還蛋白，形成還原態(tài)的鐵氧還蛋白（Fdred）,然后在氫酶的作用下被重新氧化成氧化態(tài)的鐵氧還蛋白（Fdox）,并產(chǎn)生分子氫；腸桿菌類兼性厭氧微生物屬于甲酸裂解型發(fā)酵產(chǎn)氫菌，直接產(chǎn)氫過程也發(fā)生于丙酮酸脫梭過程中，丙酮酸脫羧后形成的甲酸（也包括厭氧環(huán)境中CO2和H2生成的甲酸），通過鐵氧還蛋白和氫酶作用分解為CO2和H2。

NADH+H+產(chǎn)氫途徑的產(chǎn)氫能力取決于NADH+H+的剩余量和轉(zhuǎn)化率。梭狀芽孢桿菌類專性厭氧微生物主要為丙酮酸脫氫發(fā)酵型產(chǎn)58CH3COCOOH丙酮酸脫氫酶CO2CH3—C—TPP—EOHHSCoATPP-ECH3COSCoA2Fe3+2Fe2+8FeFd2H+H2ACH3COCOOHHCOOHHSCoA丙酮酸甲酸裂解酶CH3COSCoACO22Fe2+2Fe3+FdH22H+圖4.2暗發(fā)酵產(chǎn)氫途徑BA.梭桿菌屬的丙酮酸脫氫途徑；B.腸桿菌的甲酸裂解途徑CH3COCOOH丙酮酸脫氫酶CO2CH3—C—TPP—EO59在暗發(fā)酵產(chǎn)氫中，通常是將復(fù)雜的糖類水解后生成單糖，單糖通過丙酮酸途徑實現(xiàn)分解，產(chǎn)生氫氣的同時伴隨著一些低分子有機酸和醇類產(chǎn)生。也正是因為大量的有機酸或醇類產(chǎn)生，使得單糖轉(zhuǎn)化成氫氣的理論值也較低。微生物的糖降解經(jīng)過丙酮酸主要有EMP途徑、HMP途徑、ED途徑、PK途徑。丙酮酸經(jīng)發(fā)酵后轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等。根據(jù)丙酮酸的不同去路，可以將各種發(fā)酵產(chǎn)氫途徑分為丁酸型發(fā)酵、乙酸型發(fā)酵、丁醇型發(fā)酵、混合型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑。其中，梭狀芽孢桿菌屬主要為丁酸型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑；腸桿菌主要為混合型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑；丙酮-丁醇梭菌和拜氏梭菌主要為丁醇型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑；梭菌屬中部分細菌、瘤胃球菌屬、在暗發(fā)酵產(chǎn)氫中，通常是將復(fù)雜的糖類水解后生成單糖，單60擬桿菌屬等主要為乙醇型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑?？扇苄蕴穷?，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉等的發(fā)酵以丁酸型發(fā)酵為主，這是一種經(jīng)典的發(fā)酵產(chǎn)氫方式，發(fā)酵產(chǎn)生的末端產(chǎn)物主要為丁酸、乙酸、H2、CO2和少量的丙酸，如圖4.3所示。一些糖類在發(fā)酵過程中，經(jīng)EMP途徑產(chǎn)生的NADH+H+通過與一定比例的丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等發(fā)酵過程相偶聯(lián)而氧化為NAD+，來保證代謝過程中的NADH/NAD+的平衡。為了避免NADH+H+的積累從而保證代謝的正常進行，發(fā)酵細菌可以通過釋放H2的方式將過量的NADH+H+氧化，反應(yīng)式為：NADH+H+NAD++

H2，此反應(yīng)是在NADH鐵氧還蛋白氧化還原酶、鐵氧還蛋白氫化酶作用下完成，其末端產(chǎn)物主要是丙酸和乙酸，氣體產(chǎn)物非常少，一些學(xué)者把這種制氫稱作為丙酸型發(fā)酵制氫。擬桿菌屬等主要為乙醇型發(fā)酵產(chǎn)氫途徑?？扇苄蕴穷悾缙咸烟恰⒄?1葡萄糖丙酮酸NADHNAD乙酰CoA丁縮醛CoAFdoxFdredNADHNADH2HSCoACO2乙酰磷酸乙酸丁酸圖4.3丁酸型發(fā)酵途徑葡萄糖丙酮酸NADHNAD乙酰CoA丁縮醛CoAFdoxFd62乙醇型產(chǎn)氫途徑與傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵不同，傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵沒有氫氣產(chǎn)生，而乙醇型產(chǎn)氫途徑產(chǎn)生乙醇和乙酸的同時有氫氣產(chǎn)生，主要末端發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇、乙酸、H2、CO2和少量丁酸，如圖4.4所示。乙醇葡萄糖丙酮酸NADHNAD乙酰CoA乙醛FdoxFdredNADHNADH2HSCoACO2HSCoANADHNAD圖4.4乙醇型發(fā)酵途徑乙醇型產(chǎn)氫途徑與傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵不同，傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵沒634.2.3.3光合細菌制氫在產(chǎn)氫光合細菌中，外源性有機物，特別是各種有機酸作為電子供體，通過EMP和TCA循環(huán)生成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、CO2以及電子，這些電子通過胞內(nèi)的電子傳遞鏈傳至光反應(yīng)中心，低能態(tài)的電子在光反應(yīng)中心受到光的激發(fā)，生成高能態(tài)的電子。高能態(tài)的電子一部分離開電子傳遞鏈被傳遞給鐵氧還蛋白，鐵氧還蛋白則又將電子傳給固氮酶；另一部分的電子則在電子傳遞中傳遞，通過光合磷酸化途徑并生成ATP。在光照條件下，固氮酶利用ATP、質(zhì)子和電子生產(chǎn)氫氣，氫酶主要起吸氫作用，以回收部分能量。光合細菌產(chǎn)氫的機理和途徑見圖4.5.4.2.3.3光合細菌制氫在產(chǎn)氫光合細菌中，外源64光收集系統(tǒng)和光反應(yīng)中心鐵醌泛琨e-e-鐵氧化蛋白鐵還原蛋白細胞色素c細胞色素be-e-e-ATPADP+Pi碳源代謝系統(tǒng)（EMP，TCA等）底物電子供體e-H++CO2ATPADP+Pi固氮酶氫酶H2e-圖4.5光合