酶免疫分析技術(shù)課件

目錄

概述

1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的應(yīng)用和注意事項(xiàng)3其他酶標(biāo)記免疫測定技術(shù)

4返回總目錄目錄概述1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的應(yīng)12酶免疫分析技術(shù)的分類克隆酶供體免疫測定酶免疫分析技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫測定技術(shù)均相酶免疫測定非均相酶免疫測定酶放大免疫測定技術(shù)液相酶免疫測定固相酶免疫測定2酶免疫分析技術(shù)的分類克隆酶供體免疫測定酶免疫分析技術(shù)酶免疫第一節(jié)概述一、基本原理

酶免疫分析技術(shù)的原理是利用酶標(biāo)記抗體(抗原)形成酶標(biāo)抗體(抗原)結(jié)合物，此結(jié)合物既保留抗體(抗原)的免疫活性，又保留了酶對(duì)底物的催化活性。酶標(biāo)抗體(抗原)與相應(yīng)抗原(抗體)進(jìn)行反應(yīng)后，酶催化相應(yīng)的底物顯色，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)來判定結(jié)果。第一節(jié)概述一、基本原理酶免疫分析技術(shù)的原理是利用3二、酶和酶底物標(biāo)記酶的要求：

①活性高，純度高②作用專一性強(qiáng)③性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)④測定方法簡便易行、敏感、精確⑤酶和底物對(duì)人體無害⑥酶和底物價(jià)廉易得二、酶和酶底物標(biāo)記酶的要求：4（一）辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）

2.糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心3.RZ值：403nm(輔基)與275nm(主酶)OD值之比4.RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要1.ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶（一）辣根過氧化物酶（horseradishpe5

DH2十H2O2—D十2H20HRP催化的反應(yīng)式為：DH2為供氫體，習(xí)慣稱為底物，H2O2為受氫體HRP對(duì)受氫體的專一性很高，作用底物有多種。HRP催化的反應(yīng)式為：DH2為供氫體，習(xí)慣稱為底物，H2O26鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA

2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTSHRP常用底物鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA7OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，有致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長4928（二）堿性磷酸酶

（alkalinephosphatase，AP)

是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌提取

AP的底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

（二）堿性磷酸酶是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌提取AP的9（三）β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）

源于大腸埃希菌，常用于均相酶免疫測定。β-Gal的底物

4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測量。（三）β-半乳糖苷酶源于大腸埃希菌，常用于均相酶免疫測定。10（四）其他酶在商品試劑中，經(jīng)常應(yīng)用的酶還有葡萄糖氧化酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、溶菌酶、青霉素酶、脲酶、蘋果酸脫氫酶等。（四）其他酶在商品試劑中，經(jīng)常應(yīng)用的酶還有葡萄糖氧化酶11三、酶標(biāo)抗體(抗原)的制備制備要求：抗原要求純度高、抗原性強(qiáng)?？贵w則要求特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)、易于分離純化和批量生產(chǎn)。三、酶標(biāo)抗體(抗原)的制備制備要求：抗原要求純度高、抗原性強(qiáng)12（一）常用的標(biāo)記方法標(biāo)記方法要求：①方法簡單，產(chǎn)率高②不影響酶和抗體(抗原)的生物活性③所得酶結(jié)合物穩(wěn)定，本身不發(fā)生聚合④較少形成酶與酶、抗體與抗體或抗原與抗原的聚合物（一）常用的標(biāo)記方法標(biāo)記方法要求：①方法簡單，產(chǎn)率高131．過碘酸鈉氧化法

僅用于HRP的標(biāo)記。可與抗體蛋白的游離氨基結(jié)合，形成HRP-CH2-NH-IgG。此法酶標(biāo)記物產(chǎn)率較高，但純化后仍有少量游離IgG，部分結(jié)合物可能聚合，抗體的活性可能有所降低。1．過碘酸鈉氧化法僅用于HRP的標(biāo)記?？膳c抗體蛋白142．戊二醛交聯(lián)法

戊二醛分子中有兩個(gè)相同的醛基，可分別與酶和抗體（抗原）分子上的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)記效率比一步法高，酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一。2．戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個(gè)相同的醛基，可分別15（二）酶標(biāo)記物的純化與鑒定

1．酶標(biāo)記物的純化標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)溶液中的游離酶、游離抗體(抗原)、酶聚合物及抗體(抗原)聚合物，避免游離酶增加非特異顯色以及游離抗體(抗原)的競爭作用。常用的純化方法有葡聚糖凝膠層析法和飽和硫酸銨沉淀法等。（二）酶標(biāo)記物的純化與鑒定1．酶標(biāo)記物的純化標(biāo)記完成16

2.酶標(biāo)記物的鑒定（1）免疫活性鑒定：常用免疫電泳或雙向免疫擴(kuò)散法，出現(xiàn)沉淀線表示結(jié)合物中的抗體(抗原)具有免疫活性。（2）酶標(biāo)記率測定：用分光光度法分別測定結(jié)合物中酶和抗體(抗原)蛋白的含量，然后按公式計(jì)算其標(biāo)記率。2.酶標(biāo)記物的鑒定（1）免疫活性鑒定：常用免疫電泳或雙向免17四、固相載體

（一）固相載體的要求①結(jié)合抗體(抗原)的容量大，結(jié)合穩(wěn)定；②可結(jié)合抗原或抗體及親和素或鏈霉親和素等大分子；③固相化后分子仍應(yīng)保持活性；④固相化方法應(yīng)簡便、快速。四、固相載體（一）固相載體的要求①結(jié)合抗體(抗原)的容量大18（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應(yīng)板、小試管和小珠三種。2．微顆粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。3.微孔慮膜是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜和玻璃纖維素膜等。（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成19微量反應(yīng)板返回章目錄微量反應(yīng)板返回章目錄20第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、基本原理

將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后，通過酶對(duì)底物催化的顯色反應(yīng)程度，對(duì)標(biāo)本中抗原或抗體進(jìn)行定性或定量。第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、基本原理將已知21二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的類型（一）雙抗體夾心法檢測抗原將己知抗體包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗原與固相表面的抗體結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合成分。然后再與抗原特異的酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗原的含量。1.原理二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的類型（一）雙抗體夾心法檢測抗原22

E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法檢測抗原E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法檢測23（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加待檢標(biāo)本,溫育，洗滌。（3）加酶標(biāo)抗體，洗滌。（4）加底物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。2．技術(shù)要點(diǎn)（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。2．技術(shù)要點(diǎn)24（+）1、已知抗體包被載體3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物顯色2、加待檢抗原4、加酶作用的底物不顯色洗滌洗滌洗滌洗滌1、已知抗體包被載體2、加待檢物（無抗原）3、加酶標(biāo)抗體（-）YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原（+）1、已知抗體包3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的2、加待25

雙抗體夾心法中，應(yīng)注意類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。如果待檢標(biāo)本中含有RF，可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。使用抗體的F(ab’)2或Fab片段作為酶標(biāo)抗體可消除RF的干擾。3．注意事項(xiàng)雙抗體夾心法中，應(yīng)注意類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。如果26（二）雙位點(diǎn)一步法檢測抗原

即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同表位的單克隆抗體，分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。測定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)，兩種抗體互不干擾，經(jīng)一次溫育和洗滌后，即可加入底物進(jìn)行顯色測定。1．原理（二）雙位點(diǎn)一步法檢測抗原即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用27

EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體雙位點(diǎn)一步法檢測抗原EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體雙位點(diǎn)一步法檢測抗283.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYYYEYYEYY（+）3.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無抗原）和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYY（-）YYY洗滌洗滌雙位點(diǎn)一步法測抗原3.加酶作用的底物2.加待檢抗原洗滌1.已知抗體包YYYYE29

如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測定。2．注意事項(xiàng)如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（h30（三）競爭法檢測抗原

酶標(biāo)抗原和待檢抗原對(duì)固相特異性抗體具有相同的結(jié)合力，二者競爭結(jié)合固相特異性抗體。免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與標(biāo)本中待檢抗原含量呈反比。待檢抗原量越多，酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合越少，底物顯色反應(yīng)越淺；反之則顯色越深，即底物顯色與待檢標(biāo)本中抗原含量呈反比。

1．原理（三）競爭法檢測抗原酶標(biāo)抗原和待檢抗原對(duì)固相特異性抗31酶標(biāo)抗原

EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競爭法檢測抗原酶標(biāo)抗原EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競爭法檢測抗原32（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）待測管中加待檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，待檢標(biāo)本中如果含有抗原，則與酶標(biāo)抗原競爭固結(jié)合相抗體，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。對(duì)照管中只加酶標(biāo)抗原，溫育，洗滌。（3）加底物顯色。對(duì)照管中顏色深，待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。2．技術(shù)要點(diǎn)（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。2．技術(shù)要點(diǎn)333.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被載體YYYYYY（+）EYYYE3.加酶作用的底物顯色2.加待檢物（無抗原）和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被于載體表面YYYYYY（-）EYYYEEEEEEE洗滌洗滌競爭法測抗原3.加酶作用的底物2.加待檢抗原洗滌1.已知抗體包YYYYY34（四）間接法檢測抗體將已知抗原吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體與之結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。1．原理（四）間接法檢測抗體將已知抗原吸附于固相載體上，待檢35

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE間接法檢測抗體固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE間接法檢測抗體36（1）將特異性抗原包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加稀釋的受檢血清，洗滌。（3）加酶標(biāo)二抗，洗滌。（4）加底物顯色，顏色深度代表標(biāo)本中待檢抗體的量。

2．技術(shù)要點(diǎn)（1）將特異性抗原包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。2．技術(shù)要點(diǎn)374.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體（+）YYY3.加酶標(biāo)二抗洗滌YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無抗體）洗滌1.已知抗原包被載體（-）3.加酶標(biāo)二抗洗滌YEYEYE洗滌洗滌間接法測抗體4.加酶作用的底物2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包（+）YY38（五）雙抗原夾心法檢測抗體

將已知抗原包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相表面的抗原、酶標(biāo)抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。同雙抗體夾心法。1．原理2．技術(shù)要點(diǎn)（五）雙抗原夾心法檢測抗體將已知抗原包被固相載體，39E固相抗體標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE雙抗原夾心法檢測抗體E固相抗體標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE雙抗原夾心法檢測抗體404.加酶作用的底物不顯色（+）（-）4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌YEYYYYEYEYEYEYE2.加待檢物（無抗體）洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌EEE洗滌洗滌雙抗原夾心法測抗體4.加酶作用的底物（+）（-）4.加酶作用的底物2.加待檢抗41（六）競爭法檢測抗體同競爭法結(jié)合抗原。HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法，但其測定具體模式有區(qū)別。1．原理（六）競爭法檢測抗體同競爭法結(jié)合抗原。HBcAb和HBeAb42（1）競爭法檢測HBcAb：①將HBcAg包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)特異性抗體，溫育，洗滌。③加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。2．技術(shù)要點(diǎn)（1）競爭法檢測HBcAb：2．技術(shù)要點(diǎn)43固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競爭法檢測HBc443.加酶作用的底物顯色3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體（+）YYYEYYYE2.加待檢物（無抗體）和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體（-）YYYEYYYEEEEEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBcAb3.加酶作用的底物3.加酶作用的底物2.加待檢抗體洗滌1.已45（2）競爭法檢測HBeAb：①將HBeAb包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和HBeAg，溫育，洗滌。③加入酶標(biāo)HBeAb，溫育，洗滌。④加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。（2）競爭法檢測HBeAb：46固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體底物EEE競爭法檢測HBeAb固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體底物EEE競爭法檢測HBe47（+）（-）4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYYYE4.加酶作用的底物顯色2.加待檢物（無抗體）和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYEYEYEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBeAb（+）（-）4.加酶作用的底物2.加待檢抗體洗滌1.已知HB48（七）捕獲法檢測抗體將抗人IgM抗體吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中的IgM類抗體多被固相抗體捕獲。加入特異抗原與固相抗體捕獲的IgM類抗體結(jié)合，再加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。最后根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢IgM抗體的含量。1．原理（七）捕獲法檢測抗體將抗人IgM抗體吸附于固相載體上49（1）將抗人IgMμ鏈抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加人待檢標(biāo)本，溫育，洗滌。（3）加入特異性抗原，溫育，洗滌。（4）加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，溫育，洗滌。（5）加入底物，溫育一定時(shí)間，顯色，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。2．技術(shù)要點(diǎn)（1）將抗人IgMμ鏈抗體包被于固相反應(yīng)板上，2．技術(shù)要點(diǎn)50固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EE固相捕獲法檢測lgM抗體固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EE固相捕獲法檢測515.加酶作用的底物不顯色5.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體（IgM）洗滌1.已知抗人IgM抗體包被載體YYYYYYYYYYYY4.加酶標(biāo)抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYYEYYYYYYEYY2.加待檢物（無特異性IgM）洗滌1.已知抗人IgM抗體包被載體YYYYYYYYYY4.加酶標(biāo)抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYY（+）（-）洗滌洗滌捕獲法5.加酶作用的底物5.加酶作用的底物2.加待檢抗體（IgM）52采用固相捕獲法檢測IgM類抗體時(shí)要注意的是RF（IgM類）及其它非特異IgM的干擾。RF（IgM類）能與固相抗人μ鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體（動(dòng)物IgG）反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。

3．注意事項(xiàng)采用固相捕獲法檢測IgM類抗體時(shí)要注意的是RF（Ig53非特異IgM由于其在第一步溫育中，可與特異IgM競爭與固相抗體結(jié)合，所以會(huì)影響測定的靈敏度。因此，使用本法測IgM，必須對(duì)臨床樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。非特異IgM由于其在第一步溫育中，可與特異IgM54三、最適工作濃度的選擇（一）間接法檢測抗體（1）用100ng/ml人IgG進(jìn)行包被，洗滌。（2）將酶標(biāo)抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，溫育，洗滌。（3）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度（A）值在1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。1．酶標(biāo)抗抗體工作濃度的選擇三、最適工作濃度的選擇（一）間接法檢測抗體（1）用100ng55（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后包被，洗滌。（2）將強(qiáng)陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋，加樣，溫育，洗滌。（3）加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，溫育，洗滌。2．棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后包被，洗滌。2．棋盤滴定法56（4）加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。（5）選擇強(qiáng)陽性參考血清的A值為0.8左右，陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀釋度作為工作濃度。（4）加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。57參考血清各抗原稀釋度的吸光度值（A）1:501:1001:2001:4001:800強(qiáng)陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.660.05稀釋液0.090.020.020.020.04間接ELISA法包被抗原最適工作濃度的選擇參考各抗原稀釋度的吸光度值（A）1:501:1001:20058（二）雙抗體夾心法檢測抗原（1）抗體用包被緩沖液稀釋至濃度為10、1和0.1μg/ml，分別在ELISA板上進(jìn)行包被，洗滌。（2）在一個(gè)橫行各包被孔中加入強(qiáng)陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對(duì)照液，溫育，洗滌。（二）雙抗體夾心法檢測抗原（1）抗體用包被緩沖液稀釋至濃度為59（3）將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成三個(gè)濃度，例如1:1000、1:5000和1:25000。溫育，洗滌。（4）加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后，讀取A值。（5）以強(qiáng)陽性抗原的A值在0.8左右、陰性參考的A值小于0.1的條件作最適條件，據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度。（3）將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成三個(gè)濃度，例如1:10060包被抗體的濃度酶標(biāo)抗體稀釋度各抗原的吸光度值（A）強(qiáng)陽性（25ng/ml）弱陽性（1.5ng/ml）陰性10μg/ml1:10001.170.150.091:50000.460.0301:250000.12001μg/ml1:1000＞20.250.101:50000.910.120.011:250000.250.0100.1μg/ml1:10000.420.130.131:50000.110.030.021:250000.0300返回章目錄夾心ELISA包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇包被抗體的濃度酶標(biāo)抗體稀釋度各抗原的吸光度值（A）強(qiáng)陽性（261第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的應(yīng)用和注意事項(xiàng)一、應(yīng)用1．病原體及其抗體測定廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。2．蛋白質(zhì)測定各種免疫球蛋白、補(bǔ)體組分、腫瘤標(biāo)志物各種血漿蛋白質(zhì)、同工酶等。第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、應(yīng)用1．病原體及其抗體測定623．非肽類激素測定如T3、T4、雌激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素等。4．藥物和毒品測定如地高辛、苯巴比妥、慶大霉素、嗎啡等。3．非肽類激素測定如T3、T4、雌激素、絨毛膜631．加樣應(yīng)力求準(zhǔn)確，并注意不可濺出和產(chǎn)生氣泡。2．溫育注意反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致，以防止“邊緣效應(yīng)”。3．洗滌手工洗板是在每次溫育后，將反應(yīng)液吸出或甩干，然后用緩沖液洗滌2或3次，拍干。使用洗板機(jī)洗滌次數(shù)要適當(dāng)增加。二、注意事項(xiàng)1．加樣應(yīng)力求準(zhǔn)確，并注意不可濺出和產(chǎn)生氣泡。二、注意事644．顯色根據(jù)試劑盒說明操作即可。5．比色要注意波長的選擇。操作中應(yīng)注意避免出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題。返回章目錄返回章目錄65第四節(jié)其他酶標(biāo)記免疫測定技術(shù)一、均相酶免疫測定法、固相模免疫測定法等基本原理酶標(biāo)抗原和非標(biāo)記抗原具有相同的與限量抗體競爭結(jié)合的能力，而酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合形成酶標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物后，其中的酶活性將被減弱或增強(qiáng)。（一）均相酶免疫測定法第四節(jié)其他酶標(biāo)記免疫測定技術(shù)一、均相酶免疫測定法、固相模免66因此，不需對(duì)反應(yīng)液中結(jié)合和游離的酶標(biāo)抗原進(jìn)行分離，直接測定反應(yīng)系統(tǒng)中總酶活性的變化即可推算出被測樣品中抗原的含量。因此，不需對(duì)反應(yīng)液中結(jié)合和游離的酶標(biāo)抗原67（二）非均相液相酶免疫測定法基本原理：將酶標(biāo)抗原、待檢抗原與特異性抗體同時(shí)混合（平衡法），或先將待檢抗原與特異性抗體混合反應(yīng)一定時(shí)間后，再加入酶標(biāo)抗原（非平衡法），抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，加入二抗，經(jīng)離心沉淀后，將游離的酶標(biāo)記物與結(jié)合的酶標(biāo)記物（酶標(biāo)抗原-抗體-二抗復(fù)合物）分離，棄上清液，測定沉淀物中酶的活性。待檢抗原量與沉淀物中酶的活性成反比。（二）非均相液相酶免疫測定法基本原理：將酶標(biāo)抗原、待檢抗原與68（三）固相膜免疫測定法1.斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)基本原理與常規(guī)ELISA相同，不同之處在于Dot-ELISA使用吸附蛋白質(zhì)能力很強(qiáng)的NC

膜為固相載體，底物經(jīng)酶反應(yīng)后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。（三）固相膜免疫測定法1.斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)基本原理69斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)斑點(diǎn)-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)702.免疫印跡試驗(yàn)原理抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動(dòng)。將在凝膠中已經(jīng)分離的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至NC腹上，選用低電壓(100v)和高電流(1～2A)，通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。2.免疫印跡試驗(yàn)原理抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰71印有蛋白條帶的NC膜依次與特異性抗體和酶標(biāo)二抗作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。陽性反應(yīng)的條帶染色清晰，根據(jù)SDS時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。印有蛋白條帶的NC膜依次與特異性抗體和酶72免疫印跡試驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)73免疫印跡試驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)743.重組免疫結(jié)合試驗(yàn)基本原理與免疫印跡試驗(yàn)相似，不同之處是特異性抗原不通過電泳分離轉(zhuǎn)印，而是直接分條加在固相膜上。RIBA已用于血清抗HCV抗體的測定和分析。3.重組免疫結(jié)合試驗(yàn)基本原理與免疫印跡試驗(yàn)相似，不同75二、生物素-親和素標(biāo)記技術(shù)在

ELISA中的應(yīng)用（一）生物素和親和素的特點(diǎn)

結(jié)構(gòu)中的咪唑酮環(huán)是與親和素結(jié)合的主要部位，四氫噻吩環(huán)戊酸側(cè)鏈末端羧基是與抗體和酶等蛋白質(zhì)結(jié)合的主要部位。1．生物素(biotin，B)二、生物素-親和素標(biāo)記技術(shù)在（一）生物素和親和素的特點(diǎn)76利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾后可制成各種活性基團(tuán)的衍生物(活化生物素)，以適合與各種生物大分子結(jié)合的需要。利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾后可制成各種活性基團(tuán)的77富含色氨酸，借助色氨酸殘基與生物素的咪唑酮環(huán)結(jié)合。親和素與生物素之間的親和力極強(qiáng)，比抗原與抗體的親和力至少高1萬倍，且具有高度特異性和穩(wěn)定性。2．親和素(avidin，A)富含色氨酸，借助色氨酸殘基與生物素的咪唑酮環(huán)結(jié)合。親78

酸性氨基酸含量較多，其等電點(diǎn)為pH值6.0，而且不帶任何糖基，在檢測中出現(xiàn)的非特異性結(jié)合明顯少于卵白親和素，正逐漸取代卵白親和素。3．鏈霉親和素(streptavidin，SA)酸性氨基酸含量較多，其等電點(diǎn)為pH值79生物素-親和素技術(shù)在ELISA中的應(yīng)用類型反應(yīng)層次直接法間接法BA-ELISAAg-（Ab-B）-A＊Ag-（Ab-B）-A-B＊Ag-（Ab-B）-AB＊CAg-Ab1-（Ab2-B）-A＊Ag-Ab1-（Ab2-B）-A-B＊Ag-Ab1-（Ab2-B）-AB＊CBAB-ELISAABC-ELISAA＊為標(biāo)記親和素B＊為標(biāo)記生物素生物素-親和素技術(shù)在ELISA中的應(yīng)用類型反應(yīng)層次直接法間接80基本原理：直接BA-ELISA是以酶標(biāo)親合素直接連接生物素化抗體。間接BA-ELISA采用生物素化的二抗，可進(jìn)一步提高檢測靈敏度。BA-ELISA中親和素與酶的共價(jià)結(jié)合對(duì)酶的活性有一定程度的損傷。1.BA-ELISA基本原理：直接BA-ELISA是以酶標(biāo)親合素直接連接生81BA-ELISA檢測抗原BA-ELISA檢測抗原82

BA-ELISA檢測抗體BA-ELISA檢測抗體83基本原理：直接BAB-ELISA是以游離的親合素作為橋聯(lián)劑，利用親合素的多價(jià)性，將生物素化抗體和酶標(biāo)生物素連接起來，以檢測反應(yīng)分子。間接BAB-ELISA是在加入抗體后，再用生物素化的二抗，使反應(yīng)增加一個(gè)層次，從而使靈敏度進(jìn)一步提高。2．BAB-ELISA基本原理：直接BAB-ELISA是以游離的親合素作為84

BAB-ELISABAB-ELISA85基本原理：親合素與酶標(biāo)生物素結(jié)合形成親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)。當(dāng)其與生物素化抗體(直接ABC-ELISA)或生物素化二抗(間接ABC-ELISA)相遇時(shí)，ABC中未飽和的親合素結(jié)合部位可與抗體上的生物素結(jié)合，使抗原抗體反應(yīng)體系與ABC體系連成一體。通過依次的相互連接作用，形成一個(gè)具有多級(jí)放大作用的晶格樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使檢測敏感性明顯提高。3．ABC-ELISA基本原理：親合素與酶標(biāo)生物素結(jié)合形成親合素-生物素-過氧化物86返回章目錄ABC-ELISA返回章目錄ABC-ELISA87小結(jié)

酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗原或抗體作為主要試劑的免疫檢測方法，在抗原與抗體的特異性反應(yīng)完成后，通過酶對(duì)底物的催化作用提高反應(yīng)的敏感性。酶免疫分析技術(shù)可分為酶免疫組織化學(xué)技術(shù)和酶免疫測定兩大類,后者根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合與游離的酶標(biāo)記物而分為均相和非均相兩種類型。

小結(jié)酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗原或抗體作為主要88最常用的技術(shù)是以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,其原理可分為夾心法、競爭法、間接法和捕獲法等。返回章目錄最常用的技術(shù)是以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶89展望

酶免疫技術(shù)是三大經(jīng)典標(biāo)記免疫技術(shù)之一，是以酶標(biāo)記抗體或抗原為主要試劑的一種標(biāo)記免疫分析技術(shù)。隨著相關(guān)新技術(shù)的不斷問世，如雜交瘤單克隆抗體、生物素一親和素放大系統(tǒng)的應(yīng)用以及與化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的偶聯(lián)等，明顯地提高了分析和測定方法的特異性、靈敏度及其自動(dòng)化程度，使酶免疫分析技術(shù)不斷更新，應(yīng)用范圍不斷拓寬。展望酶免疫技術(shù)是三大經(jīng)典標(biāo)記免疫技術(shù)之一，是以90當(dāng)前，酶免疫技術(shù)己與形式各異、各具特點(diǎn)和用途的定位、定量和超微量測定的標(biāo)記免疫技術(shù)融合發(fā)展，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用。

返回章目錄當(dāng)前，酶免疫技術(shù)己與形式各異、各具特點(diǎn)和用途的91THANKYOUFORYOURATTENTION!返回總目錄THANKYOU返回總目錄92目錄

概述

1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的應(yīng)用和注意事項(xiàng)3其他酶標(biāo)記免疫測定技術(shù)

4返回總目錄目錄概述1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的應(yīng)9394酶免疫分析技術(shù)的分類克隆酶供體免疫測定酶免疫分析技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫測定技術(shù)均相酶免疫測定非均相酶免疫測定酶放大免疫測定技術(shù)液相酶免疫測定固相酶免疫測定2酶免疫分析技術(shù)的分類克隆酶供體免疫測定酶免疫分析技術(shù)酶免疫第一節(jié)概述一、基本原理

酶免疫分析技術(shù)的原理是利用酶標(biāo)記抗體(抗原)形成酶標(biāo)抗體(抗原)結(jié)合物，此結(jié)合物既保留抗體(抗原)的免疫活性，又保留了酶對(duì)底物的催化活性。酶標(biāo)抗體(抗原)與相應(yīng)抗原(抗體)進(jìn)行反應(yīng)后，酶催化相應(yīng)的底物顯色，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)來判定結(jié)果。第一節(jié)概述一、基本原理酶免疫分析技術(shù)的原理是利用95二、酶和酶底物標(biāo)記酶的要求：

①活性高，純度高②作用專一性強(qiáng)③性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)④測定方法簡便易行、敏感、精確⑤酶和底物對(duì)人體無害⑥酶和底物價(jià)廉易得二、酶和酶底物標(biāo)記酶的要求：96（一）辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）

2.糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心3.RZ值：403nm(輔基)與275nm(主酶)OD值之比4.RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要1.ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶（一）辣根過氧化物酶（horseradishpe97

DH2十H2O2—D十2H20HRP催化的反應(yīng)式為：DH2為供氫體，習(xí)慣稱為底物，H2O2為受氫體HRP對(duì)受氫體的專一性很高，作用底物有多種。HRP催化的反應(yīng)式為：DH2為供氫體，習(xí)慣稱為底物，H2O298鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA

2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTSHRP常用底物鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA99OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，有致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492100（二）堿性磷酸酶

（alkalinephosphatase，AP)

是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌提取

AP的底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

（二）堿性磷酸酶是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌提取AP的101（三）β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）

源于大腸埃希菌，常用于均相酶免疫測定。β-Gal的底物

4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測量。（三）β-半乳糖苷酶源于大腸埃希菌，常用于均相酶免疫測定。102（四）其他酶在商品試劑中，經(jīng)常應(yīng)用的酶還有葡萄糖氧化酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、溶菌酶、青霉素酶、脲酶、蘋果酸脫氫酶等。（四）其他酶在商品試劑中，經(jīng)常應(yīng)用的酶還有葡萄糖氧化酶103三、酶標(biāo)抗體(抗原)的制備制備要求：抗原要求純度高、抗原性強(qiáng)?？贵w則要求特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)、易于分離純化和批量生產(chǎn)。三、酶標(biāo)抗體(抗原)的制備制備要求：抗原要求純度高、抗原性強(qiáng)104（一）常用的標(biāo)記方法標(biāo)記方法要求：①方法簡單，產(chǎn)率高②不影響酶和抗體(抗原)的生物活性③所得酶結(jié)合物穩(wěn)定，本身不發(fā)生聚合④較少形成酶與酶、抗體與抗體或抗原與抗原的聚合物（一）常用的標(biāo)記方法標(biāo)記方法要求：①方法簡單，產(chǎn)率高1051．過碘酸鈉氧化法

僅用于HRP的標(biāo)記?？膳c抗體蛋白的游離氨基結(jié)合，形成HRP-CH2-NH-IgG。此法酶標(biāo)記物產(chǎn)率較高，但純化后仍有少量游離IgG，部分結(jié)合物可能聚合，抗體的活性可能有所降低。1．過碘酸鈉氧化法僅用于HRP的標(biāo)記?？膳c抗體蛋白1062．戊二醛交聯(lián)法

戊二醛分子中有兩個(gè)相同的醛基，可分別與酶和抗體（抗原）分子上的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)記效率比一步法高，酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一。2．戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個(gè)相同的醛基，可分別107（二）酶標(biāo)記物的純化與鑒定

1．酶標(biāo)記物的純化標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)溶液中的游離酶、游離抗體(抗原)、酶聚合物及抗體(抗原)聚合物，避免游離酶增加非特異顯色以及游離抗體(抗原)的競爭作用。常用的純化方法有葡聚糖凝膠層析法和飽和硫酸銨沉淀法等。（二）酶標(biāo)記物的純化與鑒定1．酶標(biāo)記物的純化標(biāo)記完成108

2.酶標(biāo)記物的鑒定（1）免疫活性鑒定：常用免疫電泳或雙向免疫擴(kuò)散法，出現(xiàn)沉淀線表示結(jié)合物中的抗體(抗原)具有免疫活性。（2）酶標(biāo)記率測定：用分光光度法分別測定結(jié)合物中酶和抗體(抗原)蛋白的含量，然后按公式計(jì)算其標(biāo)記率。2.酶標(biāo)記物的鑒定（1）免疫活性鑒定：常用免疫電泳或雙向免109四、固相載體

（一）固相載體的要求①結(jié)合抗體(抗原)的容量大，結(jié)合穩(wěn)定；②可結(jié)合抗原或抗體及親和素或鏈霉親和素等大分子；③固相化后分子仍應(yīng)保持活性；④固相化方法應(yīng)簡便、快速。四、固相載體（一）固相載體的要求①結(jié)合抗體(抗原)的容量大110（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應(yīng)板、小試管和小珠三種。2．微顆粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。3.微孔慮膜是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜和玻璃纖維素膜等。（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成111微量反應(yīng)板返回章目錄微量反應(yīng)板返回章目錄112第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、基本原理

將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后，通過酶對(duì)底物催化的顯色反應(yīng)程度，對(duì)標(biāo)本中抗原或抗體進(jìn)行定性或定量。第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、基本原理將已知113二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的類型（一）雙抗體夾心法檢測抗原將己知抗體包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗原與固相表面的抗體結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合成分。然后再與抗原特異的酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗原的含量。1.原理二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的類型（一）雙抗體夾心法檢測抗原114

E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法檢測抗原E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法檢測115（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加待檢標(biāo)本,溫育，洗滌。（3）加酶標(biāo)抗體，洗滌。（4）加底物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。2．技術(shù)要點(diǎn)（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。2．技術(shù)要點(diǎn)116（+）1、已知抗體包被載體3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物顯色2、加待檢抗原4、加酶作用的底物不顯色洗滌洗滌洗滌洗滌1、已知抗體包被載體2、加待檢物（無抗原）3、加酶標(biāo)抗體（-）YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原（+）1、已知抗體包3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的2、加待117

雙抗體夾心法中，應(yīng)注意類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。如果待檢標(biāo)本中含有RF，可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。使用抗體的F(ab’)2或Fab片段作為酶標(biāo)抗體可消除RF的干擾。3．注意事項(xiàng)雙抗體夾心法中，應(yīng)注意類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。如果118（二）雙位點(diǎn)一步法檢測抗原

即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同表位的單克隆抗體，分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。測定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)，兩種抗體互不干擾，經(jīng)一次溫育和洗滌后，即可加入底物進(jìn)行顯色測定。1．原理（二）雙位點(diǎn)一步法檢測抗原即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用119

EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體雙位點(diǎn)一步法檢測抗原EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體雙位點(diǎn)一步法檢測抗1203.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYYYEYYEYY（+）3.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無抗原）和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知抗體包被載體YYYYEYYEYY（-）YYY洗滌洗滌雙位點(diǎn)一步法測抗原3.加酶作用的底物2.加待檢抗原洗滌1.已知抗體包YYYYE121

如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測定。2．注意事項(xiàng)如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（h122（三）競爭法檢測抗原

酶標(biāo)抗原和待檢抗原對(duì)固相特異性抗體具有相同的結(jié)合力，二者競爭結(jié)合固相特異性抗體。免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與標(biāo)本中待檢抗原含量呈反比。待檢抗原量越多，酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合越少，底物顯色反應(yīng)越淺；反之則顯色越深，即底物顯色與待檢標(biāo)本中抗原含量呈反比。

1．原理（三）競爭法檢測抗原酶標(biāo)抗原和待檢抗原對(duì)固相特異性抗123酶標(biāo)抗原

EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競爭法檢測抗原酶標(biāo)抗原EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競爭法檢測抗原124（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）待測管中加待檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，待檢標(biāo)本中如果含有抗原，則與酶標(biāo)抗原競爭固結(jié)合相抗體，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。對(duì)照管中只加酶標(biāo)抗原，溫育，洗滌。（3）加底物顯色。對(duì)照管中顏色深，待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。2．技術(shù)要點(diǎn)（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。2．技術(shù)要點(diǎn)1253.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗原和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被載體YYYYYY（+）EYYYE3.加酶作用的底物顯色2.加待檢物（無抗原）和酶標(biāo)抗原洗滌1.已知抗體包被于載體表面YYYYYY（-）EYYYEEEEEEE洗滌洗滌競爭法測抗原3.加酶作用的底物2.加待檢抗原洗滌1.已知抗體包YYYYY126（四）間接法檢測抗體將已知抗原吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體與之結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。1．原理（四）間接法檢測抗體將已知抗原吸附于固相載體上，待檢127

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE間接法檢測抗體固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE間接法檢測抗體128（1）將特異性抗原包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加稀釋的受檢血清，洗滌。（3）加酶標(biāo)二抗，洗滌。（4）加底物顯色，顏色深度代表標(biāo)本中待檢抗體的量。

2．技術(shù)要點(diǎn)（1）將特異性抗原包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。2．技術(shù)要點(diǎn)1294.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體（+）YYY3.加酶標(biāo)二抗洗滌YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物不顯色2.加待檢物（無抗體）洗滌1.已知抗原包被載體（-）3.加酶標(biāo)二抗洗滌YEYEYE洗滌洗滌間接法測抗體4.加酶作用的底物2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包（+）YY130（五）雙抗原夾心法檢測抗體

將已知抗原包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相表面的抗原、酶標(biāo)抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。同雙抗體夾心法。1．原理2．技術(shù)要點(diǎn)（五）雙抗原夾心法檢測抗體將已知抗原包被固相載體，131E固相抗體標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE雙抗原夾心法檢測抗體E固相抗體標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE雙抗原夾心法檢測抗體1324.加酶作用的底物不顯色（+）（-）4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌YEYYYYEYEYEYEYE2.加待檢物（無抗體）洗滌1.已知抗原包被載體3.加酶標(biāo)抗原洗滌EEE洗滌洗滌雙抗原夾心法測抗體4.加酶作用的底物（+）（-）4.加酶作用的底物2.加待檢抗133（六）競爭法檢測抗體同競爭法結(jié)合抗原。HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法，但其測定具體模式有區(qū)別。1．原理（六）競爭法檢測抗體同競爭法結(jié)合抗原。HBcAb和HBeAb134（1）競爭法檢測HBcAb：①將HBcAg包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)特異性抗體，溫育，洗滌。③加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。2．技術(shù)要點(diǎn)（1）競爭法檢測HBcAb：2．技術(shù)要點(diǎn)135固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競爭法檢測HBc1363.加酶作用的底物顯色3.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體（+）YYYEYYYE2.加待檢物（無抗體）和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包被載體（-）YYYEYYYEEEEEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBcAb3.加酶作用的底物3.加酶作用的底物2.加待檢抗體洗滌1.已137（2）競爭法檢測HBeAb：①將HBeAb包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和HBeAg，溫育，洗滌。③加入酶標(biāo)HBeAb，溫育，洗滌。④加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。（2）競爭法檢測HBeAb：138固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體底物EEE競爭法檢測HBeAb固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體底物EEE競爭法檢測HBe139（+）（-）4.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYYYE4.加酶作用的底物顯色2.加待檢物（無抗體）和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包被載體YYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYEYEYEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBeAb（+）（-）4.加酶作用的底物2.加待檢抗體洗滌1.已知HB140（七）捕獲法檢測抗體將抗人IgM抗體吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中的IgM類抗體多被固相抗體捕獲。加入特異抗原與固相抗體捕獲的IgM類抗體結(jié)合，再加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。最后根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢IgM抗體的含量。1．原理（七）捕獲法檢測抗體將抗人IgM抗體吸附于固相載體上141（1）將抗人IgMμ鏈抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加人待檢標(biāo)本，溫育，洗滌。（3）加入特異性抗原，溫育，洗滌。（4）加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，溫育，洗滌。（5）加入底物，溫育一定時(shí)間，顯色，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。2．技術(shù)要點(diǎn)（1）將抗人IgMμ鏈抗體包被于固相反應(yīng)板上，2．技術(shù)要點(diǎn)142固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EE固相捕獲法檢測lgM抗體固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EE固相捕獲法檢測1435.加酶作用的底物不顯色5.加酶作用的底物顯色2.加待檢抗體（IgM）洗滌1.已知抗人IgM抗體包被載體YYYYYYYYYYYY4.加酶標(biāo)抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYYEYYYYYYEYY2.加待檢物（無特異性IgM）洗滌1.已知抗人IgM抗體包被載體YYYYYYYYYY4.加酶標(biāo)抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYY（+）（-）洗滌洗滌捕獲法5.加酶作用的底物5.加酶作用的底物2.加待檢抗體（IgM）144采用固相捕獲法檢測IgM類抗體時(shí)要注意的是RF（IgM類）及其它非特異IgM的干擾。RF（IgM類）能與固相抗人μ鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體（動(dòng)物IgG）反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。

3．注意事項(xiàng)采用固相捕獲法檢測IgM類抗體時(shí)要注意的是RF（Ig145非特異IgM由于其在第一步溫育中，可與特異IgM競爭與固相抗體結(jié)合，所以會(huì)影響測定的靈敏度。因此，使用本法測IgM，必須對(duì)臨床樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。非特異IgM由于其在第一步溫育中，可與特異IgM146三、最適工作濃度的選擇（一）間接法檢測抗體（1）用100ng/ml人IgG進(jìn)行包被，洗滌。（2）將酶標(biāo)抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，溫育，洗滌。（3）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度（A）值在1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。1．酶標(biāo)抗抗體工作濃度的選擇三、最適工作濃度的選擇（一）間接法檢測抗體（1）用100ng147（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后包被，洗滌。（2）將強(qiáng)陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋，加樣，溫育，洗滌。（3）加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，溫育，洗滌。2．棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后包被，洗滌。2．棋盤滴定法148（4）加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。（5）選擇強(qiáng)陽性參考血清的A值為0.8左右，陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀釋度作為工作濃度。（4）加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。149參考血清各抗原稀釋度的吸光度值（A）1:501:1001:2001:4001:800強(qiáng)陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.660.05稀釋液0.090.020.020.020.04間接ELISA法包被抗原最適工作濃度的選擇參考各抗原稀釋度的吸光度值（A）1:501:1001:200150（二）雙抗體夾心法檢測抗原（1）抗體用包被緩沖液稀釋至濃度為10、1和0.1μg/ml，分別在ELISA板上進(jìn)行包被，洗滌。（2）在一個(gè)橫行各包被孔中加入強(qiáng)陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對(duì)照液，溫育，洗滌。（二）雙抗體夾心法檢測抗原（1）抗體用包被緩沖液稀釋至濃度為151（3）將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成三個(gè)濃度，例如1:1000、1:5000和1:25000。溫育，洗滌。（4）加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后，讀取A值。（5）以強(qiáng)陽性抗原的A值在0.8左右、陰性參考的A值小于0.1的條件作最適條件，據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度。（3）將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成三個(gè)濃度，例如1:100152包被抗體的濃度酶標(biāo)抗體稀釋度各抗原的吸光度值（A）強(qiáng)陽性（25ng/ml）弱陽性（1.5ng/ml）陰性10μg/ml1:10001.170.150.091:50000.460.0301:250000.12001μg/ml1:1000＞20.250.101:50000.910.120.011:250000.250.0100.1μg/ml1:10000.420.130.131:50000.110.030.021:250000.0300返回章目錄夾心ELISA包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇包被抗體的濃度酶標(biāo)抗體稀釋度各抗原的吸光度值（A）強(qiáng)陽性（2153第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的應(yīng)用和注意事項(xiàng)一、應(yīng)用1．病原體及其抗體測定廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。2．蛋白質(zhì)測定各種免疫球蛋白、補(bǔ)體組分、腫瘤標(biāo)志物各種血漿蛋白質(zhì)、同工酶等。第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、應(yīng)用1．病原體及其抗體測定1543．非肽類激素測定如T3、T4、雌激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素等。4．藥物和毒品測定如地高辛、苯巴比妥、慶大霉素、嗎啡等。3．非肽類激素測定如T3、T4、雌激素、絨毛膜1551．加樣應(yīng)力求準(zhǔn)確，并注意不可濺出和產(chǎn)生氣泡。2．溫育注意反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致，以防止“邊緣效應(yīng)”。3．洗滌手工洗板是在每次溫育后，將反應(yīng)液吸出或甩干，然后用緩沖液洗滌2或3次，拍干。使用洗板機(jī)洗滌次數(shù)要適當(dāng)增加。二、注意事項(xiàng)1．加樣應(yīng)力求準(zhǔn)確，并注意不可濺出和產(chǎn)生氣泡。二、注意事1564．顯色根據(jù)試劑盒說明操作即可。5．比色要注意波長的選擇。操作中應(yīng)注意避免出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問題。返回章目錄返回章目錄157第四節(jié)其他酶標(biāo)記免疫測定技術(shù)一、均相酶免疫測定法、固相模免疫測定法等基本原理酶標(biāo)抗原和非標(biāo)記抗原具有相同的與限量抗體競爭結(jié)合的能力，而酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合形成酶標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物后，其中的酶活性將被減弱或增強(qiáng)。（一）均相酶免疫測定法第四節(jié)其他酶標(biāo)記免疫測定技術(shù)一、均相酶免疫測定法、固相模免158因此，不需對(duì)反應(yīng)液中結(jié)合和游離的酶標(biāo)抗原進(jìn)行分離，直接測定反應(yīng)系統(tǒng)中總酶活性的變化即可推算出被測樣品中抗原的含量。因此，不需對(duì)反應(yīng)液中結(jié)合和游離的酶標(biāo)抗原159（二）非均相液相酶免疫測定法基本原理：將酶標(biāo)抗原、待檢抗原與特異性抗體同時(shí)混合（平衡法），或先將待檢抗原與特異性抗體混合反應(yīng)一定時(shí)間后，再加入酶標(biāo)抗原（非平衡法），抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后，加入二抗，經(jīng)離心沉淀后，將游離的酶標(biāo)記物與結(jié)合的酶標(biāo)記物（酶標(biāo)抗原-抗體-二抗復(fù)合物）分離，棄上清液，測定沉淀物中酶的活性。待檢抗原量與沉淀物中酶的活性成反比。（二）非均相液相酶免疫測定法基本原理：將酶標(biāo)抗原、待檢抗原與160（三）固相膜免疫測定法1.斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)基本原理與常規(guī)ELISA相同，不同之處在于Dot-ELISA使用吸附蛋白質(zhì)能力很強(qiáng)的NC

膜為固相載體，底物經(jīng)酶反應(yīng)后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。（三）固相膜免疫測定法1.