基因工程的應(yīng)用與進(jìn)展課件

基因工程的進(jìn)展與應(yīng)用

基因工程的內(nèi)容第一部分基因工程基本技術(shù)第二部分基因工程的進(jìn)展和應(yīng)用第一部分基因工程基本技術(shù)-復(fù)習(xí)一、基因工程的目的二、基因工程的基本步驟三、基因工程表達(dá)體系1.原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.真核表達(dá)系統(tǒng)根據(jù)不同的目的選擇不同的策略和技術(shù)路線(xiàn)提醒大家注意的問(wèn)題Ⅱ基因工程的基本過(guò)程及研究策略1、目的基因的制備2、載體DNA選擇及其改造3、體外DNA重組4、重組DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染5、重組體的篩選鑒定與克隆擴(kuò)增6、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)基因工程過(guò)程示意圖①?gòu)募?xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因/使其表達(dá)③③二、基因工程的基本過(guò)程及研究策略1、目的基因的制備2、載體DNA選擇及其改造3、體外DNA重組4、重組DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染5、重組體的篩選鑒定與克隆擴(kuò)增6、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)RT-PCR克隆載體克隆載體表達(dá)載體表達(dá)載體二、基因工程的基本過(guò)程及研究策略1、目的基因的制備2、載體DNA選擇及其改造3、體外DNA重組4、重組DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染5、重組體的篩選鑒定與克隆擴(kuò)增6、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)二、基因工程的基本過(guò)程及研究策略1、目的基因的制備2、載體DNA選擇及其改造3、體外DNA重組4、重組DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染5、重組體的篩選鑒定與克隆擴(kuò)增6、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)化（transformation）：把以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA，在一定條件下引入受體細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)染（transfection）：以噬菌體或病毒構(gòu)建的重組DNA引入受體細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)化子：又稱(chēng)工程菌，即接受了重組DNA的受體菌。重組DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染二、基因工程的基本過(guò)程及研究策略1、目的基因的制備2、載體DNA選擇及其改造3、體外DNA重組4、重組DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染5、重組體的篩選鑒定與克隆擴(kuò)增6、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)平板篩選酶切、電泳篩選PCR篩選核酸雜交DNA測(cè)序免疫學(xué)檢測(cè)法

Westernblot常用篩選/鑒定陽(yáng)性重組體的方法初步篩選精確鑒定重組體的篩選鑒定與克隆擴(kuò)增

經(jīng)上述方法篩選、鑒定的陽(yáng)性重組子克隆擴(kuò)增表達(dá)功能性蛋白產(chǎn)物獲得大量拷貝的DNA片段制備探針等第一部分基因工程基本技術(shù)-復(fù)習(xí)一、基因工程的目的二、基因工程的基本過(guò)程及研究策略三、基因工程表達(dá)體系1.原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.真核表達(dá)系統(tǒng)基因工程表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)酵母細(xì)胞系統(tǒng)昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)幾種常見(jiàn)的原核細(xì)胞表達(dá)載體融合型表達(dá)載體非融合型表達(dá)分泌型表達(dá)基因工程表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)酵母細(xì)胞系統(tǒng)昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)載體

適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。真核載體根據(jù)受體不同，又可分為幾種：據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為3種：酵母表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZα物理圖譜—非分泌表達(dá)

啟動(dòng)外源基因的啟動(dòng)子：PGAP,PTEF1MCS：EcoRI等鑒定的標(biāo)志：

myc表位：能與抗myc的抗體結(jié)合6個(gè)組氨酸：能與組氨酸的抗體結(jié)合終止密碼：Stop終止子：AOX1，CYC1TT抗生素篩選標(biāo)志：Zeocin復(fù)制起始位點(diǎn)：PUCori

真核表達(dá)體系

適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。真核載體根據(jù)受體不同，又可分為幾種：據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為3種：酵母表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1.非病毒性載體：真核復(fù)制信號(hào)、啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄單位及質(zhì)粒片段組成,不需要包裝細(xì)胞。如：pSV系列、pCDNA3等

(二）載體的類(lèi)型哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體2.病毒型載體

外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重組DNA隨病毒顆粒而復(fù)制(多需輔助病毒或包裝細(xì)胞的存在)。如：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等病毒型載體的類(lèi)型整合型整合入宿主染色體，隨染色體復(fù)制而復(fù)制可持續(xù)表達(dá)外援基因安全性低：插入誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體游離型不整合生物安全性高瞬時(shí)表達(dá)

腺病毒載體、痘苗病毒載體

基因工程的內(nèi)容第一部分基因工程基本技術(shù)第二部分基因工程的進(jìn)展和應(yīng)用一、噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其應(yīng)用三、基因敲出動(dòng)物及其應(yīng)用

（一）噬菌體展示技術(shù)的建立和原理（二）常用的噬菌體展示技術(shù)（三）噬菌體展示技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用第一節(jié)、噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用（一）噬菌體展示技術(shù)的建立和原理噬菌體展示技術(shù)的建立和發(fā)展

1985年Smith首次將EcoRI內(nèi)切酶的部分基因片段與菌體的PIII基因融合使外源基因展示在噬菌體1988年P(guān)armley將已知的抗原決定簇與pIII融合呈現(xiàn)在噬菌體的表面，可特異地被抗體選擇出來(lái)，提出了通過(guò)構(gòu)建隨機(jī)肽庫(kù)可以了解抗體識(shí)別的抗原決定簇。1989年winter研究組和Lernerd研究組同時(shí)創(chuàng)立了噬茵體抗體庫(kù)技術(shù)噬菌體展示技術(shù)的基本原理

噬菌體表面展示技術(shù)是一種將外源蛋白分子或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達(dá)，展示在噬菌體顆粒的表面700bp外源性基因在噬菌體上的展示外源基因（二）常用的噬菌體展示技術(shù)根據(jù)所用的噬菌體分類(lèi)絲狀噬菌體展示系統(tǒng)λ噬茵體展示系統(tǒng)T4噬茵體展示系統(tǒng)根據(jù)用途分類(lèi)噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)噬菌體cDNA文庫(kù)技術(shù)1.噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)(1).噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)：展示在噬菌體表面含有各種可能氨基酸排列序列的肽庫(kù)

12肽庫(kù)常用的隨機(jī)肽庫(kù)7肽庫(kù)（Ph.D.-7）12肽庫(kù)（Ph.D.-12）7環(huán)肽庫(kù)（Ph.D.-C7C）肽庫(kù)表達(dá)的隨機(jī)肽均在噬菌體次要包膜蛋白pⅢ的N端，故每一個(gè)病毒粒子可以表達(dá)5個(gè)拷貝。

Ph.D.-7和Ph.D.-12肽庫(kù)表達(dá)的展示肽就是展示肽本身，不含有其它額外氨基酸

Ph.D.-C7C表達(dá)的展示肽前含有丙氨酸和半胱氨酸。所有的肽庫(kù)在展示肽和pⅢ之間的連接肽，是由甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸組成。(2)用靶分子篩選

基于抗體與抗原、受體與配體、酶和底物結(jié)合的特異性，將靶分子包被在96孔板上，從隨機(jī)肽庫(kù)中快速篩選到能結(jié)合靶分子的多肽。3.用途：為藥物開(kāi)發(fā)的強(qiáng)有力工具

抗原表位的篩選蛋白相互作用篩選酶的底物和拮抗劑的篩選受體的激活劑和拮抗劑的篩選2.噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)

（antibodyphagedisplay)1989年winter研究組和Lernerd建立的原理抗體基因（Fab/ScFv）與噬菌體外殼蛋白基因相連在輔助噬菌體存在的情況下,抗體片段展示在噬菌體上ScFv型抗體Fab型抗體

ScFv型抗體

噬菌體抗體庫(kù)的類(lèi)型

1．天然抗體庫(kù)：抗體基因來(lái)自非免疫個(gè)體B細(xì)胞的mRNA，針對(duì)各種抗原，和低2．免疫抗體庫(kù)：抗體基因來(lái)自免疫個(gè)體B細(xì)胞的mRNA，針對(duì)特異性抗原，親和力強(qiáng)3.噬菌體cDNA文庫(kù)cDNA噬菌體庫(kù)的建立

逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA連接EcoRI適配子

XhoI酶切與噬菌體載體重組體外包裝cDNA表達(dá)文庫(kù)（三）噬菌體展示技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用1.噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)在人源性抗體制備中的應(yīng)用2.噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)在藥物研制中的應(yīng)用3.cDNA文庫(kù)技術(shù)在腫瘤標(biāo)志物研究中的應(yīng)用4.其他（新基因發(fā)現(xiàn)、疫苗研制等）1.噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)在人源性抗體制備中的應(yīng)用

在醫(yī)學(xué)微生物研究領(lǐng)域:抗HSV、抗HCV、抗?jié)h坦病毒、抗狂犬病毒在寄生蟲(chóng)病研究領(lǐng)域:抗日本血吸蟲(chóng)腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病研究領(lǐng)域利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)制備人源性TAT-Fab抗體

TAT：tetanusanti-toxin破傷風(fēng)抗毒素

破傷風(fēng)是由破傷風(fēng)桿菌侵入人體傷口后生長(zhǎng)繁殖后引起的急性感染性疾病。主要致病物質(zhì)是破傷風(fēng)毒素有效的防治方法是及時(shí)注射精制破傷風(fēng)抗毒素（TAT）或人破傷風(fēng)免疫球蛋白（TIG）精制破傷風(fēng)抗毒素（TAT）：

馬血清免疫球蛋白制品，過(guò)敏反應(yīng)人破傷風(fēng)免疫球蛋白（TIG）：

血源來(lái)源困難，病原微生物的污染噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)人源性、無(wú)污染主要工作1.建立人Fab噬菌體抗體庫(kù)2.用破傷風(fēng)毒素從噬菌體抗體庫(kù)中獲得TAT-FAb噬菌體及其基因3.在細(xì)菌中表達(dá)4.TAT-Fab片段生物功能的檢測(cè)人Ig輕鏈基因庫(kù)構(gòu)建和鑒定

庫(kù)容為7.3×105650bp輕鏈基因重組載體的鑒定人Fab抗體基因庫(kù)構(gòu)建及鑒定庫(kù)容為5×104重鏈Fd基因重組載體的鑒定人Fab抗體在噬菌體上的展示E.coliVCSM13Fab重組噬菌粒載體人Fab抗體在噬菌體上的展示展示人源TAT-Fab抗體噬菌體的篩選和富集五輪“吸附-洗脫-富集”后滴度為1.3×106pfu/ml人Ig輕鏈基因庫(kù)構(gòu)建和鑒定

庫(kù)容為7.3×105650bp輕鏈基因重組載體的鑒定人Fab抗體基因庫(kù)構(gòu)建及鑒定庫(kù)容為5×104重鏈Fd基因重組載體的鑒定人Fab抗體在噬菌體上的展示E.coliVCSM13Fab重組噬菌粒載體人Fab抗體在噬菌體上的展示展示人源TAT-Fab抗體噬菌體的篩選和富集五輪“吸附-洗脫-富集”后滴度為1.3×106pfu/ml

產(chǎn)率=篩選后的噬菌體滴度/篩選前的噬菌體滴度×100%

篩選輪數(shù)篩選前的噬菌體滴度（PFU/ml）篩選后的噬菌體滴度（PFU/ml）產(chǎn)率（%）11.69×10111.0×103

5.0×10-721.0×1012

7.0×106

7.0×10-433.7×1012

4.0×1061.1×10-543.0×1012

1.0×1063.3×10-5

54.0×10121.3×106

3.25×10-5TAT-Fab噬菌體的篩選和富集可溶性人源TAT-Fab抗體在大腸桿菌的表達(dá)及鑒定

可溶性人源TAT-Fab抗體鑒定SDSWesternblot非還原非還原2.隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)在生物

醫(yī)學(xué)和藥物研制中的應(yīng)用

抗原表位的篩選蛋白相互作用篩選酶的底物和拮抗劑的篩選受體的激活劑和拮抗劑的篩選

(1)

CD137配體肽的篩選

DNAsequencePeptidesequenceCD137從隨機(jī)肽庫(kù)中篩選CD137肽配體的篩選隨機(jī)肽庫(kù)隨機(jī)肽庫(kù)從7肽隨機(jī)肽庫(kù)中篩選CD137肽配體的篩選：對(duì)23個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序從12肽隨機(jī)肽庫(kù)中篩選CD137配體

對(duì)39個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序從7肽隨機(jī)肽庫(kù)中篩選CD137肽配體：對(duì)23個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序xHxHxxxHxxxxsequence（70%）DHWHKLTHMAGT9DHWHTSLHLSRP3DHLHTTMHPPGG6DHLHSHLHWVKV1DHYHLATHPLLT1DHIHEKRHEKLL2EHVHTYFHPPSP4從12肽隨機(jī)肽庫(kù)中篩選CD137肽配體

對(duì)39個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序

CD137肽配體對(duì)CD137和CD137L結(jié)合作用的抑制效應(yīng)細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)ELISA(2)CD28在噬菌體上的展示及其在類(lèi)肽藥物篩選中的應(yīng)用TCellAPCanergyCD28BlockadeB7CD28TCRAntigen阻斷劑（類(lèi)肽）CD28在噬菌體上的展示及功能測(cè)定以噬菌體展示的CD28為靶標(biāo)篩選CD28結(jié)合類(lèi)肽CD28在噬菌體上的展示及功能測(cè)定CD28基因的獲得CD28重組噬菌體載體的構(gòu)建重組載體的酶切鑒定CD28噬菌體結(jié)合抗-CD28抗體結(jié)合的能力-抗原性CD28噬菌體結(jié)合天然配體-B7的能力CD28噬菌體抗原性和生物活性的檢測(cè)ABCDJurkatcellJurkatcell+CD28phageJurkatcell+1:10dilutionCD28phageJurkatcell+blankphageRajicellRajicell+1:10dilutionCD28phageRajicell+CD28phageRajicell+blankphageABCDCD28噬菌體生物活性的檢測(cè)T細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

CD28拮抗性類(lèi)肽的篩選CD28拮抗性類(lèi)肽的體外功能檢測(cè)ABCCD28拮抗性類(lèi)肽對(duì)GVHD的抑制效應(yīng)clinicalsymptomscoresurvivalrateABCDA：GVHDgroupliver；B：therapygroupliver

C：GVHDgroupcolon；D：therapygroupcolon

基因工程的內(nèi)容第一部分基因工程基本技術(shù)第二部分基因工程的進(jìn)展和應(yīng)用一、噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用

二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其應(yīng)用三、基因敲出動(dòng)物及其應(yīng)用

第二節(jié)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因克隆動(dòng)物及其應(yīng)用

一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

(一）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物概念轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指將特定的外源基因?qū)珓?dòng)物受精卵或胚胎，使之穩(wěn)定整合于動(dòng)物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類(lèi)動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所有的細(xì)胞均整合有外源基因，并具有將外源基因遺傳給子代的能力，若動(dòng)物只有部分組織細(xì)胞整合有外源基因，則稱(chēng)為嵌合體動(dòng)物，這類(lèi)動(dòng)物只有在整合了外源基因的“部分組織細(xì)胞”恰為生殖細(xì)胞時(shí)，才能將其攜帶的外源基因遺傳給子代。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方法的建立1982年美國(guó)華盛頓大學(xué)Palmiter等將大鼠生長(zhǎng)激素基因?qū)胄“资蟮氖芫牙?，再將這一受精卵植入借腹懷孕的母鼠體內(nèi)，生下一個(gè)比正常體格大一倍的“超級(jí)小鼠”。按照轉(zhuǎn)基因小鼠的思路，人們已經(jīng)成功的獲得了轉(zhuǎn)基因大鼠、雞、山羊、綿羊、豬、兔、牛、蛙、魚(yú)等。含外源基因的載體基因微注射移植受精卵小鼠出生轉(zhuǎn)基因鼠的檢測(cè)繁殖后代（二）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的命名

(1)符號(hào)：TgN(CD8Ge)23Jwg一個(gè)轉(zhuǎn)基因符號(hào)由以下幾部分組成：TgX(YYYYYY)＃＃＃＃＃Zzz，TgX=方式；(YYYYYY)=插入片段標(biāo)示；＃＃＃＃＃=實(shí)驗(yàn)室指定序號(hào)；Zzz=實(shí)驗(yàn)室注冊(cè)代號(hào)；(2)方式：C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg轉(zhuǎn)基因符號(hào)通常冠以Tg字頭。隨后的一個(gè)字母（X）表示DNA插入的方式：H代表同源重組；R代表經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的插入；

N代表非同源插入。（3）插入片段標(biāo)示An匿名序列；Ge基因組；Im插入突變；Nc非編碼序列；Rp報(bào)告基因；Sn合成序列；Et增強(qiáng)子捕獲裝置；Pt啟動(dòng)子捕獲裝置。

C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg舉例

C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg：來(lái)源于美國(guó)杰克遜研究所（J）的C57BL/6品系小鼠被轉(zhuǎn)入人的CD8基因組（Ge）；轉(zhuǎn)基因在JonW.Gordon(Jwg)實(shí)驗(yàn)室完成，獲取于一系列顯微注射后得到的序號(hào)為23的小鼠。

(三)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本原理和方法1.基本原理將改建后的目的基因用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵，然后將此受精卵再植入受體動(dòng)物的輸卵管中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。外源目的基因的分離重組載體的構(gòu)建重組DNA導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞胚胎移植技術(shù)鑒定及篩選目的基因整合率及表達(dá)效率的檢測(cè)2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù)3.重組DNA導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎

干細(xì)胞或體細(xì)胞的方法

顯微注射法胚胎干細(xì)胞法逆轉(zhuǎn)錄病毒法精子載體法體細(xì)胞核移植法受體介導(dǎo)法（1）采取受精卵自然排卵的受精卵或以激素誘發(fā)的排卵（2）向受精卵雄性原核注入DNA溶液通過(guò)微分干涉顯微鏡觀(guān)察受精卵，會(huì)看到兩個(gè)大的原核。兩個(gè)核不久即可融合，接著核膜消失。雄性原核要比雌性原核能容納更多的DNA溶液，一般是向雄性原核注入DNA溶液。（3）向假妊雌小鼠移植假妊雌小鼠的制作將操作卵移植至輸卵管（4）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)受精卵顯微注射法

胚胎干細(xì)胞顯微注射法法

胚胎干細(xì)胞是在人（哺乳動(dòng)物）胚胎發(fā)育早期—囊胚（受精后約5—7天）中未分化的細(xì)胞。囊胚含有約140個(gè)細(xì)胞，外表是一層扁平細(xì)胞，稱(chēng)滋養(yǎng)層，可發(fā)育成胚胎的支持組織如胎盤(pán)等。中心的腔稱(chēng)囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)的細(xì)胞群，稱(chēng)內(nèi)細(xì)胞群，這些未分化的細(xì)胞可進(jìn)一步分裂、分化，發(fā)育成個(gè)體。由于內(nèi)細(xì)胞群可以發(fā)育成完整的個(gè)體，因而這些細(xì)胞被認(rèn)為具有全能性。當(dāng)內(nèi)細(xì)胞群在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)，我們稱(chēng)之為胚胎干細(xì)胞。

利用胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過(guò)程1.3-5天的孕鼠2.分離胚細(xì)胞3.轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4.分離內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)5.收集干細(xì)胞克隆6.酶處理解散細(xì)胞7.培養(yǎng)干細(xì)胞8.轉(zhuǎn)染干細(xì)胞9.植入代孕母鼠體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒法步驟：1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建2.選擇和培養(yǎng)包裝細(xì)胞系3.重組病毒DNA導(dǎo)入包裝細(xì)胞4.收集重組病毒顆粒5.感染胚細(xì)胞，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化

此法是目前制備轉(zhuǎn)基因雞最有效和最成功的方法。精子載體法精子載體法是精子和外源DNA混合培養(yǎng)時(shí)，外源DNA可直接進(jìn)入精子的頭部，通過(guò)受精將外源基因引入動(dòng)物細(xì)胞中外源DNA導(dǎo)入精細(xì)胞的方法有DNA與精子共育法、電穿孔導(dǎo)入法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。受體介導(dǎo)法

是將外源DNA與受體分子連接后與胚胎細(xì)胞共培養(yǎng)，受體可以介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。1999年，Ivanava用受體介導(dǎo)法制作了轉(zhuǎn)基因鼠。(四）提高轉(zhuǎn)基因效率的策略1、對(duì)外源基因的整合機(jī)制進(jìn)行深入研究，避免基因的隨機(jī)整合，提高基因的表達(dá)效率。2、建立更完善的轉(zhuǎn)基因方法。利用胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)可以進(jìn)行基因表達(dá)的體外選擇，是提高轉(zhuǎn)基因效率的有效方法。3.探索有效的陽(yáng)性胚胎篩選方法。4.使用大的外源DNA片段。5.選擇表達(dá)效率高的啟動(dòng)子。6.其它DNA順序的影響。如順式調(diào)控區(qū)元件等。（四）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用（一）提高動(dòng)物優(yōu)良性狀、改善動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量（二）動(dòng)物抗病育種（三）生產(chǎn)藥用蛋白（四）生產(chǎn)人用營(yíng)養(yǎng)保健品（五）生產(chǎn)可用于人體器官移植的動(dòng)物器官（六）建立診斷、治療人類(lèi)疾病及新藥篩選的動(dòng)物模型二、克隆動(dòng)物（一）克隆動(dòng)物的概念動(dòng)物克隆是一種通過(guò)核移植過(guò)程進(jìn)行無(wú)性繁殖的技術(shù)。發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，或成年動(dòng)物的體細(xì)胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中之后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新發(fā)育成正常胚胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動(dòng)物個(gè)體。動(dòng)物克?。航?jīng)過(guò)核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過(guò)有性生殖過(guò)程，而是通過(guò)核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)，就叫做動(dòng)物克隆?？茖W(xué)家們已經(jīng)先后在綿羊、小鼠、牛、豬、山羊等動(dòng)物上獲得胚胎細(xì)胞核移植后代，目前，體細(xì)胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物種上均獲得了成功?？寺?dòng)物1997年，英國(guó)科學(xué)家Schnieke和Wilmut等通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)成功克隆了“多莉”。1997年6月Wilmut報(bào)道用胚胎細(xì)胞為核供體，獲得了表達(dá)治療人血友病的凝血因子IX轉(zhuǎn)基因克隆綿羊“波莉”。1999年，美國(guó)科學(xué)家Alexander克隆了３頭山羊，改變了它們的基因性狀，使它們的乳液內(nèi)含有一種對(duì)心臟病具有療效作用的蛋白質(zhì)。（二）克隆動(dòng)物的基本方法

供體體細(xì)胞的細(xì)胞核（三）克隆動(dòng)物的分類(lèi)1.按使用的細(xì)胞性質(zhì)不同克隆可分為：①胚性克隆用未分化的胚胎進(jìn)行胚胎細(xì)胞核移植、胚胎干細(xì)胞核移植、胚胎成纖維細(xì)胞核移植、胚胎分割或胚胎嵌合等操作培育出新個(gè)體。②無(wú)性克隆用已分化的體細(xì)胞進(jìn)行核移植培育出新個(gè)體，亦稱(chēng)體細(xì)胞克隆。當(dāng)前談?wù)摰目寺《嘀阁w細(xì)胞克隆。2.根據(jù)供核體細(xì)胞的不同，動(dòng)物克隆又可分為兩種類(lèi)型：

①同種體細(xì)胞克隆用相同物種體細(xì)胞進(jìn)行核移植；②異種體細(xì)胞克隆將一種動(dòng)物的體細(xì)胞核移植到另一種動(dòng)物的去核（遺傳物質(zhì)）卵母細(xì)胞中。3.

按研究目的不同，克隆可分為生殖性克隆與治療性克隆

生殖性克隆指無(wú)性繁殖新個(gè)體

治療性克隆指用克隆技術(shù)培育出某些組織器官用于醫(yī)療。（四）克隆動(dòng)物的應(yīng)用克隆技術(shù)已展示出廣闊的應(yīng)用前景，概括起來(lái)大致有以下四個(gè)方面：（1）培育優(yōu)良畜種和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；（2）生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；（3）生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞用于細(xì)胞和組織替代療法；（4）復(fù)制瀕危的動(dòng)物物種，保存和傳播動(dòng)物物種資源。技術(shù)優(yōu)點(diǎn)1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以提高生產(chǎn)能力。（瘦肉型豬）2.轉(zhuǎn)基因能增強(qiáng)抗病能力。（轉(zhuǎn)基因鮭魚(yú)）3.轉(zhuǎn)基因能生產(chǎn)生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。（轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)人血紅蛋白）技術(shù)的憂(yōu)患1.基因污染：人工組合的基因，可能會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)基因作物或家養(yǎng)動(dòng)物擴(kuò)展到其他栽培作物或自然界野生物種，并成為后者基因的一部分。這就是基因污染。2.基因武器運(yùn)用遺傳工程技術(shù)，按人們需要，在一些致病細(xì)菌或病毒中，接入能對(duì)抗普通疫苗或藥物的基因，產(chǎn)生具有顯著抗藥性的致病菌；或者在一些本來(lái)不會(huì)致病的微生物體內(nèi)接入致病基因，而制造出新的生物制劑。轉(zhuǎn)基因生物的危害.flv第三節(jié)基因敲除基因敲除(geneknockout):它是將一段外源DNA序列按照設(shè)計(jì)插入到生物體基因組的某個(gè)特定位置，并將該位置基因特意地破壞掉，從而研究由此引起的表型變化，了解該基因的生物學(xué)功能。是當(dāng)前生物工程研究中一項(xiàng)重要的科學(xué)技術(shù)?；蛱蕹夹g(shù)已經(jīng)是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究必不可少的技術(shù)。

在胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)上的基因打靶技術(shù)

2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)分別授予兩名美國(guó)人馬里奧·卡佩基、奧利弗·史密斯和一名英國(guó)人馬丁·埃文斯，以表彰他們?cè)凇盎虬邢颉奔夹g(shù)方面的突出貢獻(xiàn)。諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)發(fā)布的公報(bào)說(shuō)，三位科學(xué)家“在涉及胚胎干細(xì)胞和哺乳動(dòng)物ＤＮＡ重組方面有著一系列突破性發(fā)現(xiàn)”，為“基因靶向”技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。在“基因靶向”技術(shù)的幫助下，科學(xué)家可以使小鼠體內(nèi)的特定基因喪失功能。此類(lèi)“基因敲除”試驗(yàn)可以幫助人們了解基因在胚胎發(fā)育等多種現(xiàn)象中發(fā)揮何種作用。“基因靶向”技術(shù)為闡明人類(lèi)疾病的發(fā)生機(jī)理方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

一、基因敲除的原理基因敲除是上個(gè)世紀(jì)90年代出現(xiàn)的最新外源DNA導(dǎo)入技術(shù)?；蚯贸驹硎腔虻耐粗亟M。指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中。此法可產(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機(jī)體的基因突變。。

二、普通基因敲除和條件性基因敲除

（一）普通基因敲除和條件性基因敲除普通基因敲除(conventionalknockout)是將目標(biāo)基因用一段外源DNA序列(多數(shù)情況下是用于藥物篩選的新霉素(Neomycin)抗性基因)來(lái)取代，從而達(dá)到使目的基因失活的目的。用于Conventionalknockout的基因打靶質(zhì)粒構(gòu)建相對(duì)簡(jiǎn)單。

基因敲除基本步驟1.打靶基因載體的構(gòu)建把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，此重組載體即為打靶載體。2.ES細(xì)胞的獲得最近來(lái)自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干細(xì)胞系成功地用于基因敲除。c57BL/6小鼠種系等已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng)域，并以此為背景建立了許多成功的轉(zhuǎn)基因模型。3.基因打靶載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，進(jìn)行同源重組

將基因打靶載體通過(guò)一定的方式(常用電穿孔法)導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將打靶載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中從而得以表達(dá)。

4.用選擇性培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞

一般地，篩選使用正、負(fù)選擇法，比如用G418篩選所有能表達(dá)neo基因的細(xì)胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表達(dá)的細(xì)胞，剩下的細(xì)胞為命中的細(xì)胞。5.靶細(xì)胞導(dǎo)入囊胚后植入假孕母鼠體內(nèi)將篩選出來(lái)的靶細(xì)胞導(dǎo)入鼠的囊胚中再將此囊胚植人假孕母鼠體內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體小鼠6.嵌和型小鼠與正常小鼠雜交，篩選出基因敲除小鼠7.觀(guān)察生物學(xué)性狀，研究基因的功能通過(guò)觀(guān)察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對(duì)小鼠的生物學(xué)性狀的改變，達(dá)到研究目的基因的目的。（二）條件性基因敲除條件性基因敲除(Conditionalknockout)是在要敲除的一段目標(biāo)DNA序列的兩端各放置一個(gè)loxP(或Frt)序列，獲得帶有LoxP序列的轉(zhuǎn)基因鼠；然后與帶有組織特異性啟動(dòng)子和Cre重組酶(或Flp)的轉(zhuǎn)基因交配繁殖，利用組織特性性啟動(dòng)子的組織特異性，以在特定組織里把目標(biāo)基因剔除掉，從而研究目標(biāo)基因在不同組織，不同發(fā)育階段的功能作用。1.Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)

Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應(yīng)用，是條件性基因打靶、誘導(dǎo)性基因打靶、時(shí)空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心Cre重組酶Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶是一種由343個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，它是一種位點(diǎn)特異性重組酶，不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識(shí)別特異的DNA序列，即loxP位點(diǎn)，使loxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。Cre重組酶有70%的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的DNA底物，如線(xiàn)形、環(huán)狀甚至超螺旋DNA。LoxP（locusofX-overP1）序列LoxP（locusofX-overP1）序列：來(lái)源于P1噬菌體，是有兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過(guò)程中與DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下：5'-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTA