萬古霉素產(chǎn)生菌的分離及育種課件

一株萬古霉素產(chǎn)生菌的分離及育種文獻(xiàn)來源：廈門大學(xué)學(xué)報(bào)文獻(xiàn)作者：王明茲、黃翠蓮、吳瑩瑩萬古霉素的產(chǎn)生菌的選育技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)對象：一類稀有放線菌——擬無枝酸菌基本原理：

運(yùn)用分子育種中的基因組重排技術(shù)技術(shù)選育萬古霉素高產(chǎn)菌實(shí)驗(yàn)方法得出結(jié)論技術(shù)路線圖

萬古霉素（vancomycin）是由McCormick等于1955年從一株東方擬無枝酸菌（A.orientalis）的發(fā)酵液中分離得到的一種糖肽類抗生素。它能夠抑制革蘭氏陽性菌的生長，而對厭氧菌和革蘭氏陰性菌無效。1958年獲FDA批準(zhǔn)上市.它是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）等引起的嚴(yán)重或致命感染的重要藥物，對多重耐藥性腸球菌感染性疾病也有突出療效.隨著對鏈霉菌的廣泛篩選，大量生物活性物質(zhì)被重復(fù)發(fā)現(xiàn)，從鏈霉菌得到新的生物活性物質(zhì)的幾率逐漸下降．因此，那些用常規(guī)方法較難分離到的稀有放線菌逐漸被重視，獲得這些新型菌株可避免對產(chǎn)生已知生物活性物質(zhì)的常見菌株的重復(fù)分離。稀有放線菌的分離成為獲取新抗生素的重要途徑之一，也是獲得新種屬和新物質(zhì)的重要手段．

通過利用菌株的形態(tài)特征、生理生化特性和分子生物方法從土壤中分離萬古霉素產(chǎn)生菌，并采用育種技術(shù)選育具備工業(yè)化潛力的萬古霉素高產(chǎn)菌株，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)材料1.萬古霉素產(chǎn)生菌：東方擬無枝酸菌ＸＭ０３０１由本實(shí)驗(yàn)從廈門集美土樣中分離．2.指示菌：枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心．3.培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌：ＬＢ培養(yǎng)基。擬無枝酸菌分離培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基（含有萬古霉素５０ｍｇ／Ｌ、重鉻酸鉀５０ｍｇ／Ｌ和制霉菌素５０ｍｇ／Ｌ），ＸＭ０３０１發(fā)酵培養(yǎng)基結(jié)果

通過利用制霉菌素、重鉻酸鉀和萬古霉素分別抑制真菌、細(xì)菌和鏈霉菌等雜菌生長，高效地富集稀有放線菌，從來自廈門集美的２號土樣中分離出XM0301，在高氏培養(yǎng)基上為草帽型放射狀菌落，白色孢子。

3.生物活性鑒定采用抑菌圈法，分別以枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，測定分離菌株發(fā)酵液抗菌活性．

綜合培養(yǎng)、形態(tài)、生理和生化等特征，初步判定篩選的XM0301為擬無枝酸菌屬，進(jìn)一步測定其16SrDNA序列［NCBI登錄號為DQ990889］，與無枝酸菌屬相似性達(dá)100％，比對分析結(jié)果表明XM0301為一株東方擬無枝酸菌。4.產(chǎn)物鑒定根據(jù)Ｄｉａｎａ等方法修改設(shè)計(jì)ＨＰＬＣ條件，以Ｓｉｇｍａ公司鹽酸萬古霉素為標(biāo)樣分別采用保留值法和內(nèi)標(biāo)法對XM0301發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC測定．通過ＨＰＬＣ分析，ＸＭ０３０１發(fā)酵液主要產(chǎn)物保留時(shí)間為6.2min左右（圖Ｂ），與萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間一樣（圖Ａ）．進(jìn)一步采用內(nèi)標(biāo)法比較分析，在XM0301發(fā)酵液中添加萬古霉素為內(nèi)標(biāo)后，6.2min峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其他各峰基本不變，XM0301的主要產(chǎn)物為萬古霉素，含量為860μｇ/mL（Ｂ、Ｃ）.實(shí)驗(yàn)步驟二獲得高產(chǎn)菌株

通過育種技術(shù)提高萬古霉素產(chǎn)生菌株的產(chǎn)量和產(chǎn)率，是獲得更大經(jīng)濟(jì)效益的另一途徑．本文采取原生質(zhì)體誘變和基因組改組（基因組重排）技術(shù)選育萬古霉素高產(chǎn)菌株。基因組改組技術(shù)是結(jié)合經(jīng)典誘變育種和原生質(zhì)體融合技術(shù)發(fā)展起來的一種育種新手段，在誘變產(chǎn)生遺傳多質(zhì)性的基礎(chǔ)上，通過多親本原生質(zhì)體融合，使帶有不同基因位點(diǎn)正向突變的數(shù)個親本雜交，基因重組產(chǎn)生新的復(fù)合子，然后進(jìn)行篩選，最后獲得具有多重正向進(jìn)化標(biāo)記的高效菌株．ＸＭ０３０１原生質(zhì)體誘變

參考Kieser等方法修改：調(diào)整原生質(zhì)體濃度，確定合適的誘變劑量，加入NTG誘變。采用離心法終止誘變反應(yīng)。篩選高產(chǎn)菌株-濃度梯度法

用雙層法制成濃度梯度平板，在高濃度區(qū)域長出的菌落具備抗生素高產(chǎn)性能。最終從原生質(zhì)體誘變再生平板上隨機(jī)分離了10464個突變菌株．2.基因組改組（基因組重排）原生質(zhì)體融合

選擇誘變高產(chǎn)菌株為親本進(jìn)行基因組改組，各親本菌株制備原生質(zhì)體，分別用紫外或加熱滅活親本原生質(zhì)體后等比例混合各親本原生質(zhì)體，用PEG作為融合劑，室溫下融合，Ｐ液梯度稀釋后再生，分離再生改組菌落，測定各菌株活性篩選高產(chǎn)菌株．高通量篩選模型-瓊脂平板活性圈法

首先準(zhǔn)備一塊玻璃板，用含有枯草芽孢桿菌的瓊脂在玻璃框上制備平板，然后將含有相應(yīng)的突變菌株發(fā)酵液的牛津杯放置在瓊脂平板上，培養(yǎng)。

最后測定各樣品抑菌圈大?。ㄟ^比較各樣品抑菌圈大小，可以快速篩選出產(chǎn)量提高的高產(chǎn)突變菌株．完整的篩選過程參見下圖：萬古霉素產(chǎn)生菌育種篩選流程圖研究結(jié)果

利用稀有放線菌分離培養(yǎng)基高效地富集稀有放線菌．并從采自集美的土樣中分離了產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌，同時(shí)也有多株其他非鏈霉菌屬放線菌。

對分離的XM0301先進(jìn)行原生質(zhì)體誘變，然后通過基因組改組，快速定向進(jìn)化，最終獲得萬古霉素產(chǎn)量達(dá)到4210μg/mL的菌株。第一輪基因組改組后隨機(jī)分離288個菌株，產(chǎn)