基因缺失疫苗研制課件

傳統(tǒng)疫苗：不能區(qū)分自然感染野毒和疫苗免疫豬基因缺失疫苗：缺失主要毒力基因（TK）和非必需糖蛋白基因（gG或gE），使臨床上實現(xiàn)區(qū)分自然感染野毒豬和疫苗免疫豬成為可能。以鄂A株為親本的

TK-/gG-/Lacz+、TK-/gE-

雙基因缺失弱毒活疫苗和gG-、gE-單基因缺失滅活疫苗為臨床上區(qū)分PrV自然感染豬和疫苗免疫豬,達到最終根除該病提供了有效的工具。利用體外表達被缺失的糖蛋白基因作抗原，建立鑒別診斷方法，為逐步淘汰自然感染豬，建立健康豬群，最終實現(xiàn)消滅偽狂犬病的目的。基因缺失疫苗研制基因工程突變株的構(gòu)建及疫苗研制

從PrVEa株基因組DNA文庫篩選含TK基因的文庫片段

缺失TK基因?qū)acZ基因表達盒插入gG基因使其失活將LacZ基因表達盒插入gE基因使其失活

與Ea株野毒基因組重組

TK-缺失突變株與Ea株野毒基因組重組

gG-/LacZ+突變株TK-/gG-/LacZ+缺失突變株gE-/LacZ+突變株TK-/gE-/LacZ+缺失突變株

基因缺失活疫苗研制油乳劑滅活苗

動物試驗動物試驗

田間中試田間中試重組已構(gòu)建的基因工程突變株

TK-/LacZ+

TK-

gG-/LacZ+

TK-/gG-/LacZ+

gE-/LacZ+

TK-/gE-TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗株對小白鼠毒力的測定

病毒毒株試驗動物數(shù)量LD50

TK-/gG-/LacZ+

Balb/c小鼠60>10-1.0/0.1mL

鄂A強毒株6010-25/0.1mLBartha株6010-1.0/0.1mL與Bartha株相比，TK-/gG-/LacZ+缺失株對小白鼠的毒力更低TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗株對妊娠母豬的安全性試驗

接種劑量試驗動物數(shù)產(chǎn)仔成績數(shù)活仔數(shù)死胎數(shù)流產(chǎn)數(shù)107.0TCID50

2222200106.0TCID50

2202000105.0TCID50

2232300對照組

3303000將TK-/gG-/LacZ+疫苗毒株作10倍系列稀釋，即10-1、10-2、10-3滴度，接種妊娠40-90天的母豬，觀察其產(chǎn)仔成績，以確定該疫苗對妊娠母豬及胎兒的影響。試驗結(jié)果說明，107.0—105.0TCID50的劑量接種后，母豬均能正常產(chǎn)仔，對胎兒均不造成損害，所產(chǎn)仔豬無死胎、木乃伊胎，與非接種疫苗對照組之間的差異也不顯著（P>0.05）。

TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失株對1日齡仔豬的安全性

接種劑量(TCID50)動物數(shù)(頭)接種前(℃)接種后（天）體溫變化(℃)

123456107.0106.0105.0對照755439.3±0.1839.4±0.2439.8±0.1839.3±0.2839.1±0.2438.4±0.1938.8±0.2739.3±0.2839.5±0.3439.2±0.2239.9±0.1939.0±0.2139.4±0.3539.4±0.2439.5±0.2138.7±0.1939.9±0.3439.4±0.2740±0.1939.3±0.1840.0±0.2639.2±0.1939.1±0.2839.6±0.2039.6±0.2839.3±0.2139.5±0.2439.9±0.18將TK-/gG-/LacZ+疫苗株病毒按原液、10-1、10-2、10-3稀釋度，接種1日齡仔豬，觀察其精神狀態(tài)、測量體溫，觀察21天，確定其安全性.這幾組接種疫苗的仔豬至21日齡時全部存活，無一死亡；各劑量組之間、各劑量組與對照組之間引起仔豬的體溫變化差異不顯著（P>0.05），而且不導(dǎo)致發(fā)熱反應(yīng)（≥40℃）。不同劑量TK-/gG-/LacZ+突變株免疫

21天后攻毒的體溫變化

接種劑量組攻毒前體溫動物數(shù)(頭)攻毒后（天）的體溫變化

123456107.0106.0105.0對照組38.9±0.3139.0±0.2839.0±0.2838.9±0.19755439.0±0.2039.2±0.1739.5±0.1939.7±0.2139.4±0.1939.5±0.1940.2±0.1939.6±0.2439.3±0.2539.3±0.2839.1±0.2139.6±0.1939.5±0.3939.7±0.2439.1±0.1939.9±0.2839.2±0.2639.6±0.1639.5±0.2739.7±0.2939.3±0.1939.2±0.2739.5±0.2439.3±0.27TK-/LacZ+突變株的構(gòu)建TK-突變株與野毒株所形成空斑的比較左圖為Ea株親本形成的空斑右圖為Ea株TK缺失突變株形成的空斑gG-/LacZ+突變株的構(gòu)建gG-/LacZ+突變株形成的藍斑TK-/gE-突變株的構(gòu)建

TK-/gG-/LacZ+突變株形成的藍斑偽狂犬病TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗生物學(xué)特性動物實驗遺傳穩(wěn)定性安全性與免疫效果免疫劑量與免疫程序中試與區(qū)域試驗已通過了農(nóng)業(yè)部生物安全性評價申報了新獸藥證書，按照新獸藥證書的要求，完成了TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗株與其它

毒株在不同細胞上的生長滴度

毒株細胞類型培養(yǎng)條件TCID50

鄂A強毒株IBRS-2大扁瓶，靜止培養(yǎng)，37℃

10-7.0/0.1mL

TK-/gG-/LacZ+

IBRS-2大扁瓶，靜止培養(yǎng)，37℃10-7.0/0.1mL

雞胚成纖維細胞1萬毫升瓶，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)

10-5.33/0.1mL

Bartha株IBRS-2大扁瓶，靜止培養(yǎng)，37℃10-6.0/0.1mL

在豬源細胞（IBRS-2）中，該疫苗毒株與親本毒株（鄂A株）增殖滴度未發(fā)生改變，Bartha株增殖能力較低?；蛉笔е暝陔u胚成纖維細胞增殖滴度為10-5.33/0.1mL

。TK-/gE-/LacZ+突變株形成的藍斑TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失疫苗的研制按常規(guī)方法制備雞胚成纖維單層細胞，將TK-/gG-/LacZ+雙基因缺失突變株按所加培養(yǎng)液1：10的比例接種到雞胚成纖維單層細胞，吸附1小時后，加入培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，出現(xiàn)細胞病變后凍融細胞收毒。經(jīng)測定，TCID50為10-5.3/0.1ml。理論上，1ml病毒液可以作為13個免疫劑量。該疫苗株的增殖滴度已能滿足大規(guī)模生產(chǎn)疫苗時對抗原量的要求。將1ml病毒培養(yǎng)液加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo劑后按《獸用生物制品學(xué)》的要求進行凍干、抽真空、加塞等過程，制成凍干活毒疫苗，用于實驗室檢測和部分田間試驗。凍干活疫苗置-20℃保存，每隔2個月抽樣測定疫苗活病毒的含量，未發(fā)生明顯變化，疫苗可保存12個月以上。

該疫苗的獨特效果

可用于新生仔豬的超前免疫，安全性高可用于緊急預(yù)防注射，16-24h左右產(chǎn)生極顯著的治療效果產(chǎn)生的抗體水平高、作用時間快、安全性高、免疫效果好等方面都超過國外的同類產(chǎn)品。通過在全國100萬頭份的臨床應(yīng)用充分證實了這一效果的確實性和可靠性與國外同類產(chǎn)品的技術(shù)參數(shù)比較使用疫苗免疫劑量動物數(shù)免疫后1個月中