實(shí)驗(yàn)七八課件

實(shí)驗(yàn)七單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)八雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)指導(dǎo)老師：程燕概述沉淀反應(yīng)：可溶性抗原（如細(xì)菌浸出液、血清以及其他來源的蛋白質(zhì)、多糖等）與其相應(yīng)的抗體相遇后，在電解質(zhì)參與下，抗原抗體結(jié)合形成白色絮狀沉淀，出現(xiàn)白色沉淀線，此種現(xiàn)象稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)主要包括：1、環(huán)狀沉淀反應(yīng)：主要是用已知的抗體診斷未知的抗原（試管內(nèi)）。2、絮狀沉淀反應(yīng)：常用于毒素與抗毒素的滴定（試管內(nèi)或凹玻片上）。3、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散：指抗原抗體在瓊脂凝膠內(nèi)擴(kuò)散，特異性的抗原抗體相遇后，在凝膠內(nèi)的電解質(zhì)參與下發(fā)生沉淀，形成可見的沉淀線。這種反應(yīng)簡(jiǎn)稱瓊脂擴(kuò)散。（平皿或玻片上）

實(shí)驗(yàn)原理抗原抗體復(fù)合物的沉淀帶是一種特異性的半滲透性屏障。阻止免疫學(xué)性質(zhì)與其相似的抗原抗體分子通過，允許那些性質(zhì)不相似的分子繼續(xù)擴(kuò)散，所以：由不同抗原或不同抗體所形成的沉淀帶各有各的位置，從而可以分離和鑒定混合系統(tǒng)本實(shí)驗(yàn)中使用瓊脂凝膠形成構(gòu)架，1％-2%瓊脂所形成的構(gòu)架網(wǎng)孔較大，允許分子量在20萬以下甚至更大些的大分子物質(zhì)通過，絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體的分子量在20萬以下，因此可以在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，所受阻力較小?？乖c抗體在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處發(fā)生沉淀，此沉淀物因顆粒較大而不擴(kuò)散，故形成沉淀帶。實(shí)驗(yàn)七

單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆找环N抗原的定量測(cè)定方法觀察單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)形成的沉淀環(huán)了解沉淀環(huán)的直徑與抗原或抗體濃度的關(guān)系（二）實(shí)驗(yàn)原理單向瓊脂擴(kuò)散是一種定量檢測(cè)抗原的方法。在含有相應(yīng)特異性抗體的瓊脂板孔內(nèi)加入待測(cè)血清（抗原）?？贵w在瓊脂內(nèi)有一定濃度，抗原經(jīng)過一定時(shí)間擴(kuò)散，在適當(dāng)?shù)臐舛忍幣c抗體相遇結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的直徑大小與樣品中抗原濃度成正比。根據(jù)沉淀環(huán)的直徑從標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可算出抗原的含量。（三）實(shí)驗(yàn)材料2.5％生理鹽水瓊脂標(biāo)準(zhǔn)抗體（Ab）：羊抗兔IgG標(biāo)準(zhǔn)抗原（Ag）：兔IgG生理鹽水、待測(cè)抗原（待測(cè)Ag）恒溫培養(yǎng)箱、水浴箱、微量加樣器、打孔器、載玻片、吸管、濕盒、坐標(biāo)紙（四）實(shí)驗(yàn)步驟5、打孔：孔徑3mm，孔距10mm，挑取、封板。6、加樣及擴(kuò)散：各濃度參考血清及待檢血清按順序加入，每孔10ul，濕盒、37℃溫箱擴(kuò)散，24h。8、測(cè)量并計(jì)算：測(cè)量稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗原各沉淀環(huán)直徑，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)待檢抗原的沉淀環(huán)直徑，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)血清中IgG的實(shí)際含量。（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)八雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私怆p向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的原理和用途掌握抗體效價(jià)和特異性的測(cè)定方法觀察沉淀線的特征（二）實(shí)驗(yàn)原理將抗原和抗體分別加到含有電介質(zhì)的瓊脂板相應(yīng)孔內(nèi)，兩者各自向四周擴(kuò)散。如抗原抗體對(duì)應(yīng)，就在比例適當(dāng)處形成白色沉淀線。一對(duì)抗原抗體系統(tǒng)只能形成一條沉淀線。如果有多對(duì)抗原抗體系統(tǒng)，則因其分子大小不同，擴(kuò)散速度不同，可在瓊脂中出現(xiàn)多條沉淀線。根據(jù)沉淀線的形態(tài)和位置等可作如下三種分析：1.抗原或抗體的存在與否及其相對(duì)含量的估計(jì)2.抗原或抗體相對(duì)分子量的分析3.用于抗原性質(zhì)的分析1.抗原或抗體的存在與否及其相對(duì)含量的估計(jì)沉淀線的形成是根據(jù)兩者比例，沉淀線靠近抗原孔，則指示抗體含量較大；靠近抗體孔，則指示著抗原含量較多。不出現(xiàn)沉淀線則表明抗體或抗原的缺如或者抗體或抗原過剩。另外，如出現(xiàn)多條沉淀線，則說明抗原和抗體均不是單一的成分。因此，可用于鑒定抗原或抗體的純度。兩種受檢抗原的性質(zhì)可完全相同、部分相同或完全不同。3.用于抗原性質(zhì)的分析雙向瓊脂擴(kuò)散平板法

在瓊脂板上相距3～5mm打一對(duì)孔，或者打梅花孔、雙排孔、三角孔型等。在相對(duì)的孔中加入抗原或抗體，置室溫或37℃18～24h后，凝膠中各自擴(kuò)散的抗原和抗體可在濃度比例適當(dāng)處形成可見的沉淀線。（四）實(shí)驗(yàn)步驟1．制板：制備1.5%生理鹽水瓊脂，趁熱吸取溶化的瓊脂3.5ml均勻傾注于載玻片上，使厚度3-4mm，自然冷卻。2．打孔：根據(jù)要求按模板打孔。一般多打成梅花形孔。挑出孔內(nèi)瓊脂，注意不要挑破孔緣并封底。3．加樣：每孔加樣10μl。4．?dāng)U散：將瓊脂板置于濕盒中,37℃擴(kuò)散24－48h。注意事項(xiàng)：1、不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應(yīng)程度，加多了，易溢出，也影響反應(yīng)結(jié)果。

2．用以檢測(cè)的抗血清的效價(jià)時(shí)，將抗原置中心孔，抗血清倍比稀釋后置周圍孔，以出