芳胺類藥物分析課件

第七章芳香胺類藥物的分析

芳胺類，苯乙胺類，苯丙胺類等藥物分析【大綱要求】

一、掌握典型藥物普魯卡因、對乙酰氨基酚、腎上腺素、馬來酸依那普利等及其制劑的鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查和含量測定方法。二、熟悉本類藥物的基本化學結(jié)構(gòu)與特點。第一節(jié)芳胺類藥物的分析芳胺類藥物分為兩類芳伯氨基未被取代芳伯氨基被?；?、對氨基苯甲酸酯類藥物的基本結(jié)構(gòu)與主要化學性質(zhì)（一）基本結(jié)構(gòu)與典型藥物苯佐卡因鹽酸普魯卡因1.芳伯氨基特性：重氮化－偶合反應(yīng)；芳醛縮合成Schiff堿；易氧化變色等。鹽酸丁卡因無此特性。（二）主要理化性質(zhì)水解特性：分子結(jié)構(gòu)中的酯鍵或酰胺鍵易水解，除鹽酸丁卡因外水產(chǎn)物為對丁基苯甲酸外，上述均為對氨基苯甲酸。弱堿性：除苯佐卡因外，其余均含有叔胺氮的側(cè)鏈，故具有弱堿性。4.其它特性：因結(jié)構(gòu)中有芳伯氨基或同時具有脂烴胺側(cè)鏈，其游離堿多為堿型油狀液體或低熔點固體，難溶于水，可溶于有機溶劑。其鹽酸鹽則易溶于水。二、酰胺類藥物的基本結(jié)構(gòu)與主要化學性質(zhì)（一）基本結(jié)構(gòu)與典型藥物對乙酰氨基酚（撲熱息痛）醋氨苯砜鹽酸布比卡因鹽酸利多卡因3.酚羥基特性：對乙?；佑杏坞x酚羥基；醋氨苯砜酸水解有酚羥基，可與FeCl3發(fā)生顯色反應(yīng)，可相互區(qū)別。4.弱堿性：利多卡因和布比卡因烴胺側(cè)鏈有叔胺氮，顯堿性，可與生物堿沉淀劑發(fā)生沉淀反應(yīng)，可相互區(qū)別。5.與金屬離子發(fā)生沉淀反應(yīng)：利多卡因和布比卡因酰氨基上氮可與Cu2+,Co2+生成有色配位化合物沉淀。

直接反應(yīng)：苯佐卡因、鹽酸普魯卡因、鹽酸普魯卡因胺間接反應(yīng)：對乙酰氨基酚、醋氨苯砜利多卡因和布比卡因由于空間位阻很難發(fā)生此反應(yīng)。

丁卡因雖無芳伯氨基，但可與NaNO2反應(yīng)生成N－亞硝基化合物的乳白色沉淀。

（二）與三氯化鐵反應(yīng)對乙酰氨基酚+FeCl3藍紫色化合物

1.與銅和鈷離子反應(yīng)：

利多卡因與硫酸銅生成藍紫色配位化合物；與氯化鈷生成亮綠色沉淀。（三）與金屬離子反應(yīng)2.羥肟酸鐵鹽反應(yīng)

基于普魯卡因胺分子中的芳酰胺結(jié)構(gòu)。3.與汞離子反應(yīng)鹽酸利多卡因+H2NO3+Hg(NO3)2黃色對氨基苯甲酸酯＋H2NO3+Hg(NO3)2紅色或橙黃色1.鹽酸普魯卡因的鑒別

(四)水解產(chǎn)物反應(yīng)鹽酸普魯卡因+NaOH普魯卡因油狀物對氨基苯甲酸鈉+二乙氨基乙醇（使?jié)駶櫟募t色石蕊試紙變蘭色）對氨基苯甲酸鈉+HCl對氨基苯甲酸（白色）2.苯佐卡因的鑒別

苯佐卡因+NaOH乙醇乙醇+I2

+NaOHCHI3（碘仿臭氣，黃色沉淀）(五)制備衍生物測熔點1.三硝基苯酚衍生物的制備：利多卡因和布比卡因(六)紫外特征吸收光譜法

1.在λmax處測定供試液的百分吸收系數(shù)

例如：對乙?；釉?.4%NaOH中于λmax=240nm;E1%1cm=715在HCl(0.1nol/L)-甲醇于λmax=249nm;E1%1cm=8802.在規(guī)定的濃度2下測定λmax

例如：醋氨苯砜5μg/ml;λmax=256nm;284nm

再例如：鹽酸普魯卡因胺5μg/ml;λmax=280nm(七)紅外吸收光譜法利用化合物結(jié)構(gòu)中特殊基團的振動和轉(zhuǎn)動等紅外活性振動產(chǎn)生的紅外吸收峰對藥物進行鑒別的方法。要求能夠?qū)R圖中的cm-1（σ）進行正確的歸屬。2.有關(guān)物質(zhì)檢查：Ch.P是以對氯苯乙酰胺為對照品，采用TLC法中的雜質(zhì)對照品法。3.對氨基酚檢查：利用對氨基酚在堿性條件下可與亞硝基鐵氰化鈉生成藍色配位化合物，采用比色法。(二)鹽酸普魯卡因注射液中對氨基苯甲酸的檢查為什么要檢查？怎樣檢查？采用TLC法中的雜質(zhì)對照品法進行檢查。（三）鹽酸氯普卡因注射液中有關(guān)物質(zhì)和光解產(chǎn)物的檢查

由于鹽酸氯普卡因注射液在生產(chǎn)和貯藏過程中會產(chǎn)生4-氨基-2-氯苯甲酸，影響療效和成品的顏色，故此需要對降解產(chǎn)物進行檢查1、高效液相色譜法（HPLC）2、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）MSLCLC-MSLC-MS/MSLC-ESI-MS/MSLC-APCI-MS/MSLC-ESI-TOF-MS/MSLC-MALDI-TOF-MS/MSAgillent

安捷倫Waters

沃特斯Bruker

布魯克Varian

瓦里安AB

美國應(yīng)用生物系統(tǒng)Shimadzu

島津Finnigan

菲尼根GITC（一）亞硝酸鈉滴定法

Ar-NH2、Ar-NHCOR、Ar-NO2均可采用此法

Ch.P中的苯佐卡因、鹽酸普魯卡因和鹽酸普魯卡因胺及其制劑可直接采用本法、醋氨苯砜及注射液水解后用本法。五、含量測定1.原理：Ar-NHCOR+H2OAr-NH2+RCOOHH+Ar-NH2+NaNO2+2HClAr-N2+Cl-+NaCl+2H2O測定主要條件：(1)加KBr增加反應(yīng)速度HBr>HCl>HNO3重氮化的反應(yīng)歷程為：NaNO2+HClHNO2+NaClHNO2+HClNOCl+H2OKHClKBr+HClHBr+KClHNO2+HClNOBr+H2OKKBr∵

KHBr比KHCl大300倍∴生成NOBr量大得多∴加快反應(yīng)速度

(2)加過量HCl加速反應(yīng)：

①重氮化速度加快；

②重氮鹽在酸性介質(zhì)中穩(wěn)定；

③防止生成氨基偶氮化合物。

Ar-N2+Cl-+H2N-Ar

Ar-N=N-NH-Ar+HCl

一般摩爾比為Ar-NH2:HCl=1:2.5~6。(3)室溫條件下滴定:溫度高反應(yīng)速度快；每升高10℃加快2.5倍太高,可使Ar-N2+Cl-+H2OAr-OH+N2+HCl(4)滴定管尖端插入液面下滴定

3.指示終點的方法

(1)用停滴定法

溶液檢流計

終點前：

無過量無電流

HNO2

終點時：有過量有電流（使指針偏離零

HNO2永停在某一位置）

(2)外指示劑法

用KI-淀粉指示劑指示終點的原理：

2NaO2+2KI+4HCl

2NO+I2+2KCl+2NaCl+2H2OGVVR1R2+V(二）非水溶液滴定法

基于鹽酸丁卡因、鹽酸利多卡因和鹽酸布比卡因側(cè)鏈叔胺氮在滴定鹽酸丁卡因時，因其在冰醋酸中堿性弱，加醋酐可增加其堿性。因醋酐合乙酰氧離子比醋酸和質(zhì)子的酸性強，可增加堿性。2(CH3CO)2O(CH3CO)3O++CH3COO-相當于［B]HCl+Hg(Ac)2[B]HAc+HgCl2[B]HAc+HClO4[B]HClO4+HAc

1.對乙?；釉系暮繙y定

在0.4%NaOH介質(zhì)中，257nm

D%＝［E1%1cm]樣／［E1%1cm]標×100％；E1%1cm＝715

2.對乙酰基酚片溶出度測定（測定條件同上）

1片＋稀HCl24ml+H2O1000ml精密量取5ml+0.4%NaOH10ml+H2O100mlλ257nm測定A。W×1／1000×5／100×100＝C（g/100ml)

W(g)=200×C;C=A/715∴溶出度＝W／標示量×100％＞80％為合格（三）分光光度法中性條件下的重氮化反應(yīng)（四）比色法鹽酸普魯卡因+1,2-蒽醌-4-磺酸鈉pH4-9棕紅色化合物，max482nm處測定A等吸收雙波長分光光度法測定鹽酸普魯卡因注射液的含量（五）鹽酸普魯卡因胺的快速熒光測定λex400nm（激發(fā)波長）、λem485nm（發(fā)射波長）處測定熒光強度，標準曲線法定量。鹽酸普魯卡因胺+熒胺pH7.5熒光物

此法主要用于鹽酸普魯卡因注射液的測定。因該注射液中常含有降解產(chǎn)物對氨基苯甲酸；可以苯甲酸為內(nèi)標同時測定兩者的含量，該法簡單準確。色譜條件：色譜柱為ODS

流動相為甲醇－1％HAc(40:60)UV檢測器250nm

（六）HPLC法返回第二節(jié)苯乙胺類藥物的分析一、苯乙胺類藥物的基本結(jié)構(gòu)與主要化學性質(zhì)（一）基本結(jié)構(gòu)與典型藥物*常見的苯乙胺類藥物

（二）主要化學性質(zhì)

1.弱堿性本類藥物結(jié)構(gòu)中有烴氨基側(cè)鏈，為仲胺氮顯弱堿性。

2.酚羥基特性本類藥物結(jié)構(gòu)中有酚羥基，可與FeCl3;發(fā)生氧化。

3.光學活性多數(shù)藥物結(jié)構(gòu)中有手性碳原子，具有旋光性。二、鑒別試驗(一)與三氯化鐵反應(yīng)Ar-OH＋FeCl3絡(luò)合顯色＋堿液紫色或紫紅色。

(二）甲醛－硫酸反應(yīng)

在此試劑中形成醌式結(jié)構(gòu)而顯色。

藥物

三氯化鐵

甲醛－硫酸

腎上腺素0.1mol/LHCl顯綠色,甲氨試液顯紅－紫紅紅色重酒石酸去甲腎上腺素綠色,加NaCO3試液顯紫色－紅色淡紅色鹽酸去氧腎上腺素紫色玫瑰紅橙紅棕紅鹽酸異丙腎上腺素深綠色,加5％NaCO3試液顯藍紫色－紅色棕色暗紫色(三）氧化反應(yīng)

本類藥物具有Ar-OH，易被氧化劑I2,H2O2,K3Fe(CN)6氧化而顯色，例如：腎上腺素在中性或酸性條件下，被I2,H2O2

氧化后，生成腎上腺素紅；鹽酸異丙腎上腺素在酸性條件下，被I2氧化，生成異丙腎上腺素紅。(四）紫外特征吸收與紅外吸收光譜例如：

鹽酸異丙腎上腺素0.05mg/mlλmax=280nmA=0.50這一類藥物均可采用紅外吸收光譜進行鑒別(五）與亞硝基鐵氰化鈉(Rimini試驗）是鑒別脂肪伯氨基的特殊反應(yīng)，可用于重酒石酸間羥胺鑒別。D＋亞硝基鐵氰化鈉＋丙酮＋Na2CO3紅紫色(六)雙縮脲反應(yīng)

是鑒別芳環(huán)氨基醇的特殊反應(yīng)；可用于鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿鑒別：D＋CuSO4+NaOH顯藍紫色＋乙醚，醚層(紫紅色)水層(藍色)

(一)酮體檢查

本類藥物在生產(chǎn)過程中多采用酮體氫化制得，若氫化不完全，易引入酮體雜質(zhì)。

采用UV法檢查：

利用酮體在310nm有吸收，本類藥物無吸收。例如：腎上腺素本項檢查配2.0mg/mlλ=310nmA≤0.05

鹽酸去氧腎上腺素配2.0mg/mlλ=310nmA≤0.02鹽酸異丙腎上腺素配2.0mg/mlλ=310nmA≤0.15

三、特殊雜質(zhì)檢查(二)有關(guān)物質(zhì)的檢查鹽酸去氧腎上腺素、硫酸沙丁胺醇－TLC鹽酸苯乙雙胍-PC

鹽酸氨溴索－HPLC采用TLC法中的高低濃度對比法進行檢查。

鹽酸氨溴索的檢查方法對照樣品制備：本品→供試品溶液→對照溶液供試樣品制備：本品→甲醇溶解→加甲醛溶液→加熱→吹干溶劑→用水和流動相溶解→HPLC分析色譜條件：RP-HPLC0.01mol/lNH4H2PO4-CH3CN(50:50);248nm分析：對照溶液主成分峰為滿量程的20％~25%，記錄至主成分峰保留時間的2倍，注入供試品溶液，如有雜峰，各雜峰的面積之和不得大于對照液主峰面積的三分之一。(三)鹽酸苯乙雙胍中有關(guān)雙胍的檢查－PC法樣品制備：本品甲醇溶解即得展開：7.5×50cm，EtOAc-ethanol-water(6:3:1)顯色：10％鐵氰化鉀＋10％亞硝基鐵氰化鈉＋10％NaOH檢測：剪下顯色斑點后甲醇萃取用UV法測定

(一)非水溶液滴定法

本類藥物的原料藥多采用此法。

1.重酒石酸去甲腎上腺素的測定

相當于［B］的有機酸鹽可直接滴定。

2.鹽酸克侖特羅的測定

相當于［B］的HX酸鹽不能直接滴定，需加Hg(Ac)2處理后滴定。

3.硫酸沙丁醇的測定

相當于［B］的H2SO4鹽可直接滴定,也可處理后滴定。四、含量測定(二)溴量法本類藥物重酒石酸間羥胺、鹽酸去氧腎上腺素及其注射液用此法?；驹恚夯静僮鳎汗┰嚻贰芊Q定→加水溶解后精密加溴滴定液＋鹽酸→放置并振搖→加碘化鉀→振搖→用Na2S2O3滴定至近終點→加淀粉指示液→繼續(xù)滴定至藍色消失同時進行空白實驗（三）提取酸堿滴定法基本原理：藥物的鹽酸鹽或硫酸鹽易溶于水，而藥物本身不溶于水，加適量堿化試劑后，用適當?shù)挠袡C溶劑萃取，提取也蒸干后用中性乙醇溶解，用標準酸液直接滴定，或加入滴定過量的標準酸溶液，用標準堿溶液進行回滴。硫酸苯丙胺的含量測定：［B］H2SO4+NaOH+NaCl乙醚提取［B］+H2SO4蒸去乙醚NaOH標準液滴定終點(四)紫外分光光度法與比色法

利用藥物分子結(jié)構(gòu)中的芳伯氨基進行重氮化－偶合反應(yīng)，以及分子結(jié)構(gòu)中的Ar-OH與Fe3＋絡(luò)合顯色，進行比色測定。鹽酸異丙腎上腺素注射液重酒石酸間羥胺注射液鹽酸甲氧明注射液硫酸沙丁胺醇注射液及膠囊例如：鹽酸克倫特羅栓的含量測定

上述偶合劑可與HNO2顯色，干擾比色測定，可先加氨基磺酸銨分解過量的HNO2。HNO2＋2H2NSO3NH42N2+(NH4)2SO4+H2SO4+H2O(五)熒光分光光度法腎上腺素測定：λex410nm、λem520nm處測定熒光強度，對照法定量。腎上腺素+I2

腎上腺紅一定條件下N-甲基-3,5,6-三羥基吲哚(六)HPLC法

例一、重酒石酸去甲腎上腺素注射液的測定采用RPIP-HPLC-UV法；用外標一點法進行定量測定。

例二、血漿中兒茶酚胺類（腎上腺素類）藥物的測定采用RPIP-HPLC-ECD法；用標準曲線法進行定量測定。

(七)衍生化GC法（GC-FID以鹽酸美西律作內(nèi)標物)

應(yīng)用示例：鹽酸芬氟拉明片的含量測定鹽酸芬氟拉明＋三氟乙酰肝衍生物返回其它分析技術(shù)與方法高效毛細管電泳法用于飼料中鹽酸克倫特羅與沙丁胺醇含量的測定第三節(jié)：苯丙胺類藥物的分析基本結(jié)構(gòu)與主要性質(zhì)ACE抑制劑馬來酸依那普利鹽酸貝那普利2005版中國藥典收載的代表藥物西那普利賴諾普利主要性質(zhì)1、酸堿性：分子中含有-COOH，顯酸性；含有烴氨鏈，顯弱堿性2、氨基酸特性：結(jié)構(gòu)是脯氨酸的衍生物3、光學活性：分子中含有不對稱中心，具有旋光性4、水解特性：本類藥物大多是Pre-drug，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性代謝物二、鑒別試驗一、物理與化學鑒別法1、熔點測定法－BP(馬來酸依那普利）2、高錳酸鉀反應(yīng)－紅色消失（氧化還原反應(yīng)）3、溴－間苯二酚反應(yīng)：先進行溴代反應(yīng)，使溴顏色消失，再與間苯二酚反應(yīng)，顯棕紅色4、羥胺－三氯化鐵反應(yīng)：先進行羥胺的生成（羥胺甲醇液＋KOH乙醇液）→FeCl3→顯棕紅色二、旋光法三、光譜與色譜法鑒別三、特殊雜質(zhì)的檢查1、馬賴酸依那普利有關(guān)物質(zhì)的檢查：依那普利那＋依那普利雙酮－采用HPLC法檢查2、西那普利中有關(guān)物質(zhì)的檢查：A、B、C、D四個主要雜質(zhì)雜質(zhì)A-TLC法檢查（硅膠G板，目視比較），不得超過0.1％－BP雜質(zhì)B、C、D及其它雜質(zhì)－HPLC法，分別不得超過0.5％、0.1％、0.2％和0.1％－BPTLC法檢查A雜質(zhì)制備樣品液：供試品溶液（40mg/ml）、對照品溶液a（40μg/ml)、對照溶液b（0.5mg/ml）點樣與展開：硅膠G板，HAc-H2O-n-Hex-MeOH-EtOAc(1:1:3:3:12)顯色：KBiI4-HAc(1:10)比較：供試品如顯雜質(zhì)A斑點，顏色≤對照液a的主斑點。要求對照液b顯示兩個清晰分開的斑點時，結(jié)果有效。HPLC法檢查B、C、D和其它雜質(zhì)樣品測定液配制：供試品溶液（0.5mg/ml)、對照溶液a(2.5μg/ml）、對照溶液b（雜質(zhì)D對照品0.5mg/ml）色譜條件：ODS色譜柱，四氫呋喃－三乙胺為流動相，流速1.0ml/min，檢測波長：214nm色譜系統(tǒng)適用性：分別進樣對照溶液a和b，使對照溶液a的主成分峰為滿量程的50％，在對照溶液b中西那普利與雜質(zhì)D的分離度不得低于2.5。測定與評判：1、色普圖記錄至峰A被洗脫為止2、雜質(zhì)B、C、D與西那普利的相對保留時間分別為0.6、1.6、0.93、峰面積雜質(zhì)B≤0.5％（對照液a的主峰面積）峰面積雜質(zhì)C≤0.1％（對照液a的主峰面積）峰面積雜質(zhì)D≤0.2％（對照液a的主峰面積）峰面積其它≤0.1％（對照液a的主峰面積）（三）殘留溶劑的測定1、馬賴酸乙那普利中殘留溶劑乙腈的檢查－capillaryGC法≤0.041％樣品溶液的制備：本品加二甲基甲酰胺溶解100mg/ml對照溶液的制備：取乙腈加二甲基甲酰胺溶解40μg/ml分析方法：PEG-20M為固定液的毛細管柱，F(xiàn)ID檢測器，程序升溫洗脫：Injectiontem.:200℃,detectortem.:250℃,injectionvolume:1μl2、鹽酸喹那普利中丙酮、乙腈、二氯甲烷、甲苯的檢-GC法色譜系統(tǒng)適用性試驗測定結(jié)果計算：乙腈和丙酮≤0.25％二氯甲烷≤0.1％制備標準溶液所取某溶劑的重量供試品量供試品溶液的色譜峰面積標準溶液色譜峰面積四、含量測定一、酸堿滴定法：利用本類藥物結(jié)構(gòu)中的-COOH和氮原子氨基，可進行酸堿滴定法進行含量分析1、非水滴定法馬賴酸依那普利－非水堿量法滴定，以冰醋酸和無水二氧六環(huán)為溶劑，結(jié)晶紫為指示劑，高氯酸為滴定液2、水溶液中的滴定馬賴酸依那普利：供試品→新沸過的冷水溶解→NaOH滴定→電位法指示終點3、