細(xì)胞工程與基因工程詳解演示文稿

細(xì)胞工程與基因工程詳解演示文稿第一頁，共三十三頁。（優(yōu)選）細(xì)胞工程與基因工程第二頁，共三十三頁。酶生物活性分子天然細(xì)胞天然細(xì)胞干細(xì)胞工程干細(xì)胞工程細(xì)胞組織器官個體組織工程組織器官個體生物活性分子發(fā)酵工程細(xì)胞工程代謝工程分離工程分離工程酶工程采集破碎蛋白質(zhì)工程途徑工程基因工程生物工程的技術(shù)體系細(xì)胞工程分離工程分離工程第三頁，共三十三頁。細(xì)胞工程的基本原理

細(xì)胞工程是指通過組織、細(xì)胞、細(xì)胞器水平上的篩選和改造，獲得具有商業(yè)價值的人造組織（器官）、工程細(xì)胞株或細(xì)胞系，再通過規(guī)?；囵B(yǎng)，制備特殊產(chǎn)品的技術(shù)和過程。細(xì)胞工程包括：動植物細(xì)胞及組織大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動植物細(xì)胞融合技術(shù)動植物細(xì)胞重組技術(shù)干細(xì)胞技術(shù)（組織或器官再生技術(shù)，即組織工程）第四頁，共三十三頁。植物細(xì)胞和組織的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)基本原理：植物細(xì)胞的分化全能性第五頁，共三十三頁。動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)基本原理：動物細(xì)胞的接觸抑制性第六頁，共三十三頁。動植物細(xì)胞融合技術(shù)將兩種不同性狀的細(xì)胞在促融劑的幫助下融合在一起，并從中篩選出具有優(yōu)異性能的雜合細(xì)胞。例如，B淋巴細(xì)胞具有合成特異性抗體的性狀，骨髓瘤細(xì)胞具有生長迅速的性狀。將兩者融合，就能篩選到集兩者優(yōu)點(diǎn)的雜合細(xì)胞，即單克隆抗體技術(shù)。第七頁，共三十三頁。細(xì)胞重組是把不同種類的細(xì)胞的部件重新組合裝配，包括細(xì)胞核移植、葉綠體移植、核糖體重建及線粒體裝配等，由此獲得具有優(yōu)良性能的重組細(xì)胞株或細(xì)胞系動植物細(xì)胞重組技術(shù)第八頁，共三十三頁。經(jīng)歷277次乳腺細(xì)胞核的移植實(shí)驗(yàn)；獲得29個發(fā)育為八細(xì)胞胚；使用13頭代孕母親；生出多莉動植物細(xì)胞重組技術(shù)第九頁，共三十三頁。骨髓多能干細(xì)胞骨髓細(xì)胞淋巴細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞紅細(xì)胞巨核細(xì)胞血小板單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞嗜中酸堿性粒細(xì)胞B、T淋巴細(xì)胞干細(xì)胞技術(shù)（組織或器官再生技術(shù)）第十頁，共三十三頁?；蚬こ痰幕驹砬薪愚D(zhuǎn)增檢第十一頁，共三十三頁。DNA的體外重組：切與接用限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點(diǎn)在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點(diǎn)第十二頁，共三十三頁。EcoRI等產(chǎn)生的5’

粘性末端5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP第十三頁，共三十三頁。PstI等產(chǎn)生的3’

粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP第十四頁，共三十三頁。PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’第十五頁，共三十三頁。DNA的體外重組：切與接用T4-DNA連接酶連接DNA分子修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick第十六頁，共三十三頁。DNA的體外重組：切與接用T4-DNA連接酶連接DNA分子連接多個平頭雙鏈DNA分子5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶第十七頁，共三十三頁。同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG第十八頁，共三十三頁。同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT第十九頁，共三十三頁。同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接載體質(zhì)粒BamHISau3AIGGATCCCCTAGGGATCCTAGBamHISau3AISau3AIGATCCGCTAG第二十頁，共三十三頁。不同酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGCTGCAGGACGTCGATCCG5'

5'

G5'

GACGTCT4-DNAligase5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

PstICTGCA3'

GGGATCCCCTAGGBamHICCTAG5'

5'

G5'

GACGTCCCTAGGATCCGCTGCAG5'

G5'ACGTCCCTAGGGATCCCTGCAGG混合退火第二十一頁，共三十三頁。重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增：轉(zhuǎn)與增物理轉(zhuǎn)化法：鈣離子誘導(dǎo)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化電擊轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化法：病毒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化細(xì)菌接合轉(zhuǎn)化第二十二頁，共三十三頁。轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定：檢由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。轉(zhuǎn)化子重組子目的重組子第二十三頁，共三十三頁?；谳d體遺傳標(biāo)記篩選抗藥性篩選法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori此類篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子。將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs

第二十四頁，共三十三頁?；谳d體遺傳標(biāo)記篩選抗藥性篩選法抗藥性篩選法的基本操作：

先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板上；再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上。

在Ap平板上生長、但在Ap和Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為重組子。

ApAp+Tc影印挑選第二十五頁，共三十三頁?；谳d體遺傳標(biāo)記篩選重組子（Apr+lacZ-）

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal顯色篩選法第二十六頁，共三十三頁。pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分重組子與非重組子用BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA電泳觀察酶解產(chǎn)物片段重組子：2.7kb+4.0kb非重組子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然后通過其長度來鑒定其是否為重組子基于克隆DNA序列檢測限制性酶切圖譜法：第二十七頁，共三十三頁。pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb區(qū)分目的重組子與非目的重組子用EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA：目的重組子：3.0kb+3.7kb或者：1.0kb+5.7kb用PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA：目的重組子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kb基于克隆DNA序列檢測限制性酶切圖譜法：第二十八頁，共三十三頁?；谀繕?biāo)DNA序列鑒定DNA雜交法影印堿解雜交感光漂洗取膜ATGCCGTATGTGTCATAGC