臨床生物化學(xué)實驗室基本技術(shù)與實驗室質(zhì)量管理

第二章臨床生物化學(xué)實驗室基本技術(shù)與實驗室質(zhì)量管理第一節(jié)常用臨床生物化學(xué)分析技術(shù)第二節(jié)常用免疫分析技術(shù)(自學(xué))第三節(jié)生物芯片和生物傳感技術(shù)第四節(jié)酶蛋白分離純化技術(shù)(自學(xué))第一節(jié)常用臨床生物化學(xué)分析技術(shù)一、光譜分析技術(shù)二、電泳技術(shù)三、離心技術(shù)(了解)四、層析技術(shù)五、電化學(xué)分析技術(shù)一、光譜分析技術(shù)(一)吸收光譜分析法(二)發(fā)射光譜分析法(三)散射光譜分析法(一)吸收光譜分析法1.原理：利用物質(zhì)吸收光譜譜系特征，確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)。2.方法學(xué)評價優(yōu)點：(1)靈敏度高，檢測濃度在10-5~10-2

mol/l范圍。(2)操作簡便、快速、選擇性好和應(yīng)用廣泛。(3)原子吸收分光光度法使用空心陰極燈作光源，譜線簡單，由譜線重疊引起的干擾小(4)原子吸收分光光度法自動化程度高，在復(fù)雜樣品分析中，可直接測定多種元素。

缺點：(1)比色法需有標(biāo)準(zhǔn)品，有些反應(yīng)的顯色劑本身顏色會影響測定方法的靈敏度和特異性。(2)紫外法的吸收池需用石英玻璃作光學(xué)面。(3)原子法需特定元素的空心陰極燈，對難熔元素測定的靈敏度不夠理想。CONTINUE3.類型：可見光及紫外光、原子吸收分光光度法(參考方法)

4.臨床應(yīng)用

（1）可見光及紫外光法多用于酶試劑終點法及化學(xué)法測定的項目

（2）原子吸收分光光度法中用于Ca2+、Mg2+定值或參考方法返回(二)發(fā)射光譜分析法1.原理：利用物質(zhì)發(fā)射光譜特征，來確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)。2.類型：熒光分析法：靈敏度高，檢測范圍廣，臨床常用?；鹧婀舛确ǎ翰僮鳠┈?，干擾因素多，已淘汰。3.影響熒光強度的因素：

(1)溶劑。與熒光強度成反比。(2)熒光物質(zhì)的濃度。F=I，I是激發(fā)光強度。濃度很小且厚度不變時成正比。反之，則反比。(3)溫度。多數(shù)情況下，與熒光強度成反比。(4)溶液pH。不定。4.方法學(xué)評價：靈敏度高、選擇性好、取樣量少，但干擾因素較多。5.臨床應(yīng)用：糖類、胺類、DNA與RNA酶與輔酶，Vit類及Ca2+、Fe3+、Zn2+等。返回(三)散射光譜分析法(比濁法)1.原理：利用光線通過混懸顆粒后產(chǎn)生的散射光譜特征，確定其性質(zhì)…..2.類型：散射比濁法：根據(jù)光線通過混懸液后，光線減弱的程度來測定其濃度。不需特殊儀器。透射比濁法：速率和終點法。通過光線透過的強度來確定顆粒的濃度。需特殊儀器如激光比濁儀。3.影響比濁法測定的因素：

(1)混懸顆粒大?。?2)顆粒形狀；(3)混懸液的穩(wěn)定性。因此，使用比濁法必須做到：(1)溶液中顆粒的分散度盡可能相同；(2)混濁液至少10min內(nèi)保持穩(wěn)定。4.臨床應(yīng)用：免疫球蛋白、載脂蛋白、補體、ASO、RF等。返回二、電泳技術(shù)(一)原理：利用帶電粒子在電場中向所帶電荷相反的電極移動的性能，對物質(zhì)分子進(jìn)行分析測定。(二)電泳技術(shù)的分類與特點1.移動界面電泳(movingboundaryelectrophoresis)：已淘汰。2.區(qū)帶電泳(zoneelectrophoresis)：一類是濾紙、醋酸纖維素膜、硅膠等；一類是淀粉、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠等。其中后者的優(yōu)點是：(1)使用細(xì)微多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)支持介質(zhì)，可消除電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)使分辨率提高；(2)幾乎不吸附蛋白質(zhì)，電泳無拖尾現(xiàn)象；(3)蛋白質(zhì)在低濃度瓊脂糖膠電泳時可自由穿透，阻力小，透明度高，敏感性高。因此，取代第一類電泳。CONTINUE(三)方法學(xué)評價設(shè)備簡單，操作方便，具較高的分辨率及選擇性，不足之處是干擾因素較多。(四)電泳技術(shù)的影響因素顆粒性質(zhì)，電場強度，溶液性質(zhì)，pH值，離子強度，溶液粘度，電滲和支持物等。(五)區(qū)帶電泳的臨應(yīng)用測定項目有：血清蛋白、血紅蛋白、糖化血紅蛋白、腦脊液和尿液蛋白、脂蛋白及脂蛋白(a)、LDH、ALP、CK的同工酶及亞型。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳可分離的項目包括：多肽、氨基酸、DNA、酶分子等。研究熱點。返回四、層析技術(shù)(一)原理：利用固定相和流動相理化性質(zhì)的差異而建立起來的分析技術(shù)。當(dāng)流動相(待分離物質(zhì))經(jīng)過固定相時，由于各組分的理化性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用(吸附、結(jié)合)的能力不同，在兩相中的分配不同，隨著流動相的推進(jìn)，各組分在兩相中進(jìn)行不斷再分配。與固定相作用弱的組分，受到阻力小，向前移動速度快，反之，移動速度慢，從而達(dá)到將樣品中各單一組分分離的目的。(二)層析技術(shù)的類型：

1.按兩相所處狀分：液-液層析法、液固層析法、氣-液層析法、氣-固層析法

2.按操作模式不同分：柱層析法、薄層析法、紙層析法、薄膜層析法

3.按層析原理分：吸附層析法---固定相是固體吸附劑

分配層析法---固定相是靜止的液體CONTINUE離子交換換層析法法------固定相相是離子子交換劑劑凝膠層析析法------固定定相是多多孔凝膠膠親和層析析法------固定定相可以以是固體體、液體體或凝膠膠，但只只能與一一種待分離的的成份專專一結(jié)合合。(三)層層析法的的特點及及應(yīng)用層析法具具有分辨辨率高、、靈敏度度高、選選擇性好好、速度快等等特點，，故適用用于雜質(zhì)質(zhì)多，含含量少的的復(fù)雜樣樣品分析析，尤其其適用于于生物樣品的分分離分析。。具體如下下：1.凝膠層層析法(1)特點點：固定相相為惰性載載體，不帶帶電荷，吸吸附力弱，，操作條件件比較溫和，對分離離成分理化化性質(zhì)的保保持有獨到到之處。(2)應(yīng)應(yīng)用：脫鹽鹽；分離提提純；測定定高分子物物質(zhì)的分子子量；高分分子溶液的的濃縮。CONTINUE2.離子交交換層析法法以具有離子子交換性能能的物質(zhì)作作固定相，，利用流動動相中的離離子能進(jìn)行行可逆的交換性性質(zhì)來分離離離子型化化合物的一一種方法。。臨床應(yīng)用用于分離氨氨基酸、多肽、蛋白白質(zhì)及同工工酶等。3.高效液液相層析法法(highperformanceliquidchromatography)(1)優(yōu)點：分離離能力強，，測定靈敏敏度高，強強在室溫下下進(jìn)行，應(yīng)應(yīng)用范圍極極廣。(2)HPLC的類型：液液-固吸附附層析；液液-液分配配層析；離離子交換層層析。(3)臨床床應(yīng)用：多多用于蛋白白質(zhì)、核酸酸、氨基酸酸、生物堿堿、類固醇醇和脂類等等的分離。4.親和層層析法利利用用待分離物物質(zhì)與配體體間所具有有的特異性性親和力，，達(dá)到分離離目的一類特殊殊層析技術(shù)術(shù)。如抗原原與抗體、、DNA與RNA、酶與底物或或抑制物等等。主要用用于純化生物物分子。返回五、電化學(xué)學(xué)分析技術(shù)術(shù)(一)定義義：利用物質(zhì)質(zhì)的電化學(xué)學(xué)性質(zhì)，測測定化學(xué)電電池的電位位、電流或或電量變化化的方法。。包括電位位分析法(potentialmethod)、電導(dǎo)分析法法和電容量量分析法等等。電位分析法法：是利用電極極電位和濃濃度之間的的關(guān)系來確確定物質(zhì)含含量的分析析方法。而而離子選擇擇性電極分分析法(ionselectiveelectrode，ISE)則是電位分析法法中發(fā)展最最為活躍的的分支。(二)離子子選擇性電電極法的電電極類型1.玻璃璃膜電極如如H+、Na+等。

2.氣敏電極極3.酶酶電極(enzymeelectrode)(三)臨床應(yīng)應(yīng)用用用在電電解質(zhì)分析析儀上，測測定K+、Na+、Cl-、、Ca2+等。返回第三節(jié)生生物芯片片和生物傳傳感技術(shù)一、生物芯片技技術(shù)生物芯片(biochip)是指由微加加工技術(shù)和和微電子技技術(shù)在固體體芯片表面面構(gòu)建而成的微型型生物化學(xué)學(xué)分析系統(tǒng)統(tǒng)。其特點點是高通量量、微型化化和自動化化，可以對細(xì)胞、蛋蛋白質(zhì)、DNA及其他生物物組分進(jìn)行行準(zhǔn)確、快快速、大信信息量的檢檢測。二、生物傳感技技術(shù)生物傳感技技術(shù)(biosensor)是由生物活活性材料與與相應(yīng)的換換能器結(jié)合而成的的結(jié)合體，，能測定多多種特定的的生物化學(xué)學(xué)物質(zhì)。一、生物芯芯片技術(shù)(一)原理理：把制備好的的生物樣品固定于經(jīng)過過化學(xué)修飾飾的載體上上，樣品中中的生物分分子與載體體表面結(jié)合合(保留其其理化性質(zhì)質(zhì))，在一一定條件下下，與芯片片上的生物物分子發(fā)生生反應(yīng)，并并使反應(yīng)達(dá)達(dá)最佳狀態(tài)態(tài)，然后利利用芯片專專用監(jiān)測系系統(tǒng)對芯片片信號進(jìn)行行監(jiān)測，即即可高效、、大量獲取取待檢物質(zhì)質(zhì)的信息。。(二)生物物芯片類型型按固定的生生物分子及及材料不同可分為為基因芯片片、蛋白質(zhì)質(zhì)芯片、細(xì)細(xì)胞芯片、、組織芯片片和芯片實實驗室等。。其中臨床床生物化學(xué)學(xué)常用的有有基因芯片片、蛋白質(zhì)質(zhì)芯片和芯芯片實驗室室三類。1.基因因芯片(genearrays)是通過檢測測基因的豐豐度來確定定基因的表表達(dá)模式和和表達(dá)水平平。

2.蛋白質(zhì)芯芯片(proteinarrays)，，指把制備好的的蛋白質(zhì)樣品品固定于經(jīng)過過化學(xué)修飾后后的玻片、硅硅片等載體上上，蛋白質(zhì)與與載體表面結(jié)結(jié)合，但仍保保留蛋白質(zhì)的的理化性質(zhì)和和生物活性的的分析系統(tǒng)。。CONTINUE3.芯片實驗驗室(lab-on-chip)是指將生物化化學(xué)實驗室的的分析功能濃濃縮固定在生生物芯片上所所形成的分析析系統(tǒng)。(三)生物芯芯片技術(shù)要點點1.芯片制備備常用的芯片基基底(即芯片片載體)是玻玻璃片和硅片片。制芯片過過程有：(1)首先利用用表面化學(xué)方方法或組合化化學(xué)方法對芯芯片基底(載載體)進(jìn)行處處理(修飾)；(2)然然后將蛋白質(zhì)質(zhì)分子(純化化后的)按順順序排列在芯芯片上。主要要是利用自動動點樣裝置將將不同的蛋白白質(zhì)固化在載載體的表而，，用這種裝置置，半塊載玻玻片就可固定定10000多種蛋白質(zhì)質(zhì)。點樣的關(guān)關(guān)鍵是既要保保證芯片載體體上的蛋白質(zhì)質(zhì)分不失活，，又要能夠牢牢固的固定在在載體表面。。根據(jù)對芯片片載體的處理理方法，芯片片可有以下幾幾種類型：蛋白質(zhì)微陳陳列芯片----用于研研究蛋白質(zhì)；；微孔板蛋蛋白質(zhì)芯片；；三維凝膠膠塊芯片---用于研究究抗原抗體、、酶動力學(xué)。。CONTINUE2.樣品的制制備(1)首先利利用同位素標(biāo)標(biāo)記法、或酶酶標(biāo)記法或熒熒光標(biāo)記法對對待測樣品進(jìn)進(jìn)行標(biāo)記；(2)然后通通過在芯片上上制作的微型型樣品處理系系統(tǒng)(如介電電電泳)，將將標(biāo)記的待測測樣品從復(fù)雜雜的混合體中中分離出來。。3.生物分子子的反應(yīng)選擇合適的反反應(yīng)條件，如如溫度、pH、抗體濃度等使使生物分子之之間的反應(yīng)處處于最佳狀態(tài)態(tài)，以提高檢檢測的靈敏度度和特異性。。反應(yīng)類型如如抗原抗體反反應(yīng)、受體配配體反應(yīng)、DNA與互補DNA或RNA的反應(yīng)、酶與與底物或抑制制劑的反應(yīng)等等。

4.芯芯片信號的檢檢測(1)芯芯片專用監(jiān)測測系統(tǒng)，scanArray5000;(2)全自動免疫分分析儀，用于于監(jiān)測微孔板板蛋白質(zhì)芯片片。(四)生物芯芯片技在醫(yī)學(xué)學(xué)中的應(yīng)用1.用于臨臨床疾病的診診斷：如腫瘤瘤、糖尿病、、傳染性疾病病等。CONTINUE2.基因排序序分析3.藥物篩選選：從蛋白質(zhì)水平平或基因水平平尋找藥物靶標(biāo)，解釋藥物的的作用機制。。(五)蛋白質(zhì)質(zhì)芯片技術(shù)與與傳統(tǒng)的質(zhì)譜譜和雙向凝膠膠電泳技術(shù)相相比，優(yōu)點：：1.能夠快速速定量分析大大量的蛋白質(zhì)質(zhì)。2.操作較簡簡單，只須標(biāo)標(biāo)本進(jìn)行沉降降分離后，就就可加在芯片片上進(jìn)檢測分分析。3.樣本用量量少，結(jié)果正正確率高。4.與酶標(biāo)ELISA相比，蛋白質(zhì)質(zhì)芯片采用光光敏染料標(biāo)記記，靈敏度高高，準(zhǔn)確性好好。5.所需試劑劑少，實用性性較強。返回二、生物傳感感技術(shù)(一)原理：：待測物質(zhì)分子子經(jīng)擴散作用用，進(jìn)入固化化生物敏感膜膜層，發(fā)生特特異的生物化化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)產(chǎn)生的信息被被相應(yīng)的物理理或化學(xué)換能能器轉(zhuǎn)變成可可定量或可處處理的電信號號，再經(jīng)過2次脈沖放放大輸入到計計算機系統(tǒng)，，就可算出待待測物的濃度度。1.生生物物敏敏感感膜膜又又稱稱為為分分子子識識別別元元件件。。是是采采用用固固定定化化技技術(shù)術(shù)將將酶酶等等生生物物活活性性物物質(zhì)質(zhì)限限制制在在一一定定的的空空間間，，而而又又不不妨妨礙礙它它們們自自由由擴擴散散的的人人工工膜膜。。固固化化生生物物活活性性物物質(zhì)質(zhì)與與游游離離相相比比優(yōu)優(yōu)點點有有：：(1)熱熱穩(wěn)穩(wěn)定定性性提提高高；；(2)可可重重復(fù)復(fù)使使用用；；(3)不不需需要要在在反反應(yīng)應(yīng)后后進(jìn)進(jìn)行行催催化化物物質(zhì)質(zhì)與與反反應(yīng)應(yīng)物物的的分分離離；；(4)可可根根據(jù)據(jù)已已知知的的halflife來確確定定生生物物膜膜的的壽壽命命；；(5)能能夠夠避避免免外外源源性性微微生生物物對對生生物物功功能能物物質(zhì)質(zhì)的的污污染染和和降降解解等等。。2.生生物物學(xué)學(xué)反反應(yīng)應(yīng)和和換換能能器器CONTINUE(二二)生生物物傳傳感感技技術(shù)術(shù)的的分分類類1.按按分分子子識識別別元元件件的的不不同同可可分分為為：酶酶傳傳感感器器(enzymesensor)、、微生生物物傳傳感感器器(microbial)、、免疫疫傳傳感感器器(immune)、、組織織傳傳感感器器(tissue)和細(xì)細(xì)胞胞器器傳傳感感器器(organell)2.按所所用用換換能能器器不不同同分分為為：生生物物電電極極、、半半導(dǎo)導(dǎo)體體生生物物傳傳感感器器、、光光生生物物傳傳感感器器(opticalbiosensor)、、熱生生物物傳傳感感器器、、壓壓電電晶晶體體生生物