分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用課件

分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用1遺傳標(biāo)記（geneticmarker）具有多型性易于鑒別與目標(biāo)基因緊密連鎖

性狀標(biāo)記

色澤，形態(tài)…

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

倒位，易位，G/N/C帶…

生化標(biāo)記

同功酶…

分子標(biāo)記RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP……基礎(chǔ)-基因表達(dá)結(jié)果表現(xiàn)型DNA堿基序列變異遺傳標(biāo)記性狀標(biāo)記基礎(chǔ)-DNA堿基2形態(tài)標(biāo)記遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見(jiàn)的外部特征---遺傳與環(huán)境、結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果。如穗形、芒長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。特點(diǎn)：直觀簡(jiǎn)單從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達(dá)、調(diào)控、個(gè)體發(fā)育等環(huán)節(jié)，表型差異有時(shí)難以反映基因型差異。形態(tài)標(biāo)記遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見(jiàn)的外部特征3細(xì)胞學(xué)標(biāo)記染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）。隨著分帶、細(xì)胞原位雜交等研究技術(shù)的發(fā)展，可在染色體水平揭示更多遺傳變異。特點(diǎn)：直觀、快速而經(jīng)濟(jì)，但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時(shí)難以分辨。

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、4生化標(biāo)記——貯藏蛋白和同工酶貯藏蛋白同工酶特點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、方便、成本較低結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)非結(jié)構(gòu)基因無(wú)能為力；所檢測(cè)位點(diǎn)只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時(shí)受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境影響。生化標(biāo)記——貯藏蛋白和同工酶貯藏蛋白5分子標(biāo)記本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點(diǎn)：（1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達(dá)與否的限制；（2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異；（3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個(gè)基因組；（4）表現(xiàn)為“中性”，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無(wú)必然的連鎖；（5）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。分子標(biāo)記本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點(diǎn)：6分子標(biāo)記的分類(lèi)（Staub等1996）分子標(biāo)記以Southern為基礎(chǔ)如RFLP以PCR為基礎(chǔ)單引物PCR標(biāo)記有RAPD、

AP-PCR、DAF、ISSR等雙引物選擇性擴(kuò)增PCR主要指AFLP需克隆、測(cè)序構(gòu)建特殊雙引物PCR標(biāo)記 如SSR、STS等分子標(biāo)記的分類(lèi)（Staub等1996）分子標(biāo)記以Southe7植物遺傳研究中常用的分子標(biāo)記RFLP—RestrictionFragmentLengthPolymorphismRAPD—RandomAmplifiedPolymorphicDNAs

(DAF,AP-PCR)SSR—SimpleSequenceRepeatAFLP—AmplifiedFragmentLengthPolymorphism植物遺傳研究中常用的分子標(biāo)記RFLP—Restricti8RFLP原理：DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜同位素或非放射標(biāo)記（如地高辛等）的探針雜交膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小RFLP原理：9酶切：3-5ugDNA，以10U內(nèi)切酶酶切5小時(shí)電泳：0.6-0.8%瓊脂糖膠70V電泳16小時(shí)染色：EtBr染色20分鐘變性：0.25MHCl20分鐘，抽真空，水冼印跡：加入0.4NNaOH，進(jìn)行Southern印跡沖洗：以2×SSC冼膠，風(fēng)干酶切—電泳—印跡酶切：3-5ugDNA，以10U內(nèi)切酶酶切5小時(shí)酶切—電10—雜交—洗脫預(yù)雜交：將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、5×HSB、DenhardtⅢ）中，封好后置65℃溫箱中振蕩5－6小時(shí)。雜交：預(yù)雜交液中加入標(biāo)記好的marker和探針，放入雜交膜浸勻。封好雜交盒后，置65℃溫箱中振蕩過(guò)夜。洗脫：將膜轉(zhuǎn)入洗脫盒，加入洗脫液65℃振蕩洗脫兩次（15min/次），吸干包好?！s交—洗脫預(yù)雜交：將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、5×HSB、11—放射自顯影將洗脫好的雜交膜置于增感屏上,于暗室中將X-光片放于雜交膜上，再放上另一張?jiān)龈衅?，裝人暗袋，并用夾板夾好。置-70℃超低溫冰箱中曝光10天左右。使用磷屏儀，操作更方便?！派渥燥@影將洗脫好的雜交膜置于增感屏上,于暗室中將X-12RFLP探針來(lái)源：cDNA探針與基因組DNA（gDNA）探針cDNA探針:保守性較強(qiáng)，探針檢測(cè)的多態(tài)性頻率較低。gDNA探針:檢測(cè)的多態(tài)性頻率較高，但不同種屬特異性較強(qiáng)。玉米R(shí)FLP探針：/probes.HtmlRFLP探針來(lái)源：cDNA探針與基因組DNA（gDNA）探針13探針標(biāo)記—隨機(jī)引物法25ng變性DNA5ul寡聚核苷酸2ulBSA3ul[α-32P]dCTP2ulKlenow酶加水至50ul，37℃溫箱中標(biāo)記2小時(shí)探針標(biāo)記—隨機(jī)引物法25ng變性DNA14RFLP標(biāo)記特點(diǎn)共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)某些植物中開(kāi)發(fā)探針已遍及整個(gè)基因組缺點(diǎn)：DNA需要量較大，技術(shù)復(fù)雜；用于做圖較費(fèi)時(shí)，難以分析大量樣品；

在基因組較大、嚴(yán)格自花授粉作物上多態(tài)性很低，使遺傳圖飽和度低。RFLP標(biāo)記特點(diǎn)共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型15RAPD原理：用一個(gè)隨機(jī)引物（8-10bp）、堿基隨機(jī)排列的寡核苷酸序列，非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后電泳分開(kāi)擴(kuò)增片段。RAPD原理：16PolymeraseChainReaction-PCR3'5'5'3'TargetDNAsequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGdenature@95?C5'3'3'5'GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCannealprimers@60?CTaqpolymerasebinds3’andextendsGCTCGC5'3'3'5'AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNAisdoubledwitheachcycleRepeat25-40timesPolymeraseChainReaction-PCR317RAPD的操作PCR反應(yīng)：DNA（20ng/μl） 1μlPrimer 15ng10×Buffer 2.0μlMg2+（25mM） 1.2μlTaq酶（5U/μl） 0.15μldNTP（25mM） 0.2μl加水至20μl，再加入石臘油，進(jìn)行PCR擴(kuò)增RAPD的操作PCR反應(yīng)：18Step195℃2分鐘Step295℃15秒Step336℃30秒Step472℃45秒Step5GOTOStep246循環(huán)Step6

72℃5分鐘

PCR擴(kuò)增：Step195℃2分鐘PCR擴(kuò)增：19主要特點(diǎn)無(wú)需雜交，設(shè)計(jì)引物也無(wú)須知道序列信息；DNA需要量少，引物便宜，成本較低；技術(shù)簡(jiǎn)便，操作方便、快速，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)。不同物種間引物通用；缺點(diǎn)：大多顯性遺傳，不能鑒別雜合和純合子；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。主要特點(diǎn)無(wú)需雜交，設(shè)計(jì)引物也無(wú)須知道序列信息；20DAF

(DNAamplificationfingerprinting)：與RAPD不同的是:引物濃度更高，引物長(zhǎng)度更短（一般5－8個(gè)堿基），且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳，通常會(huì)產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型，譜帶信息比RAPDs大得多。（Caetano-Anolles等，1990）DAF

(DNAamplificationfingerp21AP-PCR(arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction)引物較長(zhǎng)（10～50bp）；引物濃度較高；引物長(zhǎng)度不定，并且常常來(lái)自為其它目的而設(shè)計(jì)的引物（如M13通用測(cè)序引物）。AP-PCR(arbitrarilyprimedpoly22ISSRISSR23共同優(yōu)點(diǎn)：

在不需要知道所擴(kuò)增DNA序列情況下，產(chǎn)生DNA片段的指紋；需DNA量少，產(chǎn)生多態(tài)性豐富。缺點(diǎn)：

對(duì)反應(yīng)條件非常敏感，重復(fù)性差。共同優(yōu)點(diǎn)：24SCARs

（SequencedCharacterizedAmplifiedRegions）為提高RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性，把目標(biāo)RAPD片段克隆測(cè)序，根據(jù)片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物（通常24個(gè)堿基），再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可把相應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來(lái)。具有更高的可重復(fù)性共顯性SCARs

（SequencedCharacterized25微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)真核生物基因組普遍存在，呈隨機(jī)分布,大約每隔10-50kb就存在一個(gè)SSR.哺乳動(dòng)物中約為植物的5-6倍;植物中平均23.3kb有一個(gè)SSR;雙子葉植物SSR數(shù)量大于單子葉植物,核DNASSR數(shù)量多于細(xì)胞質(zhì)DNA;根據(jù)核心序列堿基數(shù)的不同,可分為單堿基、2堿基、3堿基、4堿基等多種重復(fù)型。微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)真核生物基因組普遍存在，呈隨機(jī)分布,大約26不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。通過(guò)對(duì)54個(gè)植物種核DNA和28個(gè)植物種細(xì)胞器DNASSR(1-4bp)的搜索,發(fā)現(xiàn)：(AT)ｎ最豐富,然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一類(lèi)內(nèi)堿基種類(lèi)不同的SSR,豐度差別很大。SSR的分布特點(diǎn)不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。SSR的分布特點(diǎn)27SSR的功能長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為SSR是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒(méi)有明確的生理功能。但隨著研究深入，證明并非如此。SSR的主要功能:

編碼氨基酸；染色體末端的SSR，有保護(hù)DNA完整性、避免降解、融合及丟失的功能；提高或降低臨近基因轉(zhuǎn)錄速率；基因重組的熱點(diǎn)，是基因變異的來(lái)源；部分SSR可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合物或活化染色體SSR的功能長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為SSR是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒(méi)有明確的生理28兩端序列多是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR將其間微衛(wèi)星序列擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳技術(shù)獲得長(zhǎng)度多態(tài)性。不同材料重復(fù)次數(shù)的不同，導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性。SSR分析兩端序列多是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引29SSR分子標(biāo)記的創(chuàng)制基因組文庫(kù)的構(gòu)建探針制備-預(yù)雜交-帶有SSR克隆的選擇測(cè)序引物設(shè)計(jì)檢測(cè)其它方法:EST-SSR、相關(guān)種間SSR......SSR分子標(biāo)記的創(chuàng)制基因組文庫(kù)的構(gòu)建30Cross-speciesSSRTaxonomic Transferability PolymorphismDivergence%(N)%(N)Samesubgenus 89.8(521) 78.3(299)Samegenus 76.4(1800) 86.0(773)Samealliance 45.4(403) 50.4(141)Samefamily 35.2(1683) 58.4(363)Cross-speciesSSRTaxonomic T31SSR的操作PCR反應(yīng)：DNA（20ng/μl） 4μlPrimer（1mM） 0.25μl10×Buffer 2.0μlMg2+（25mM） 1.2μlTaq酶（5U/μl） 0.1μldNTP（25mM） 0.2μl加水至20μlSSR的操作PCR反應(yīng)：32混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：Step1 95℃2分鐘Step2 95℃30秒Step3 56℃30秒Step4 72℃60秒Step5 GOTOStep231循環(huán)注：SSR引物退火溫度在52-65℃不等。混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：33SSR的特點(diǎn)：兩側(cè)順序保守，在同種間多相同；數(shù)量豐富，在整個(gè)基因組均勻隨機(jī)分布；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；多數(shù)SSR增減重復(fù)序列頻率高，在品種間具廣泛位點(diǎn)變異；共顯性標(biāo)記，可鑒別雜合子和純合子；僅需微量組織，適合PCR分析半自動(dòng)化SSR的特點(diǎn)：兩側(cè)順序保守，在同種間多相同；34相對(duì)的物種專(zhuān)一性；由于開(kāi)發(fā)時(shí)需針對(duì)每個(gè)座位的微衛(wèi)星序列，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)引物，需建立基因文庫(kù)、克隆識(shí)別與篩選、測(cè)序等過(guò)程，開(kāi)發(fā)困難，費(fèi)用較高，耗時(shí)長(zhǎng)；實(shí)際分析時(shí)一般每次只分析單個(gè)位點(diǎn)；不同引物退火溫度不同，需要探索。不足：不足：35SSR的檢測(cè)瓊脂糖凝膠檢測(cè)（同前）聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)一般采用銀染、熒光檢測(cè)。SSR的檢測(cè)瓊脂糖凝膠檢測(cè)（同前）36銀染檢測(cè)程序脫色：加1升10%HAC液，脫色20分鐘沖洗：用重蒸水沖洗膠板2次，每次5分鐘染色：加染色液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分鐘沖洗：用重蒸水沖洗膠板不超過(guò)5秒鐘；顯影：預(yù)冷顯影液（30g/LNaCO3，0.075%甲醛，0.4mg/mlNa2SO3），輕搖到帶紋出現(xiàn)；定影：在固定/停止液并輕搖3-5分鐘；沖洗：用重蒸水沖洗2次，每次2分鐘；干膠：室溫下自然干燥過(guò)夜。銀染檢測(cè)程序脫色：加1升10%HAC液，脫色20分鐘37AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)原理：基于RFLP技術(shù)和PCR技術(shù)的結(jié)合

AFLP（AmplifiedFragmentLength38DNAMseI-MseI

MseI-EcoRI EcoRI-EcoRIMseI-MseI片段環(huán)化，不利小片段擴(kuò)增；EcoRI-EcoRI引物的退火溫度高；MseI-EcoRI片段優(yōu)先擴(kuò)增酶切連接DNA酶切連接39接頭序列MseⅠ接頭、PstⅠ分別為：MseⅠ：

5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’3’-TACTCAGGACTCAT-5’PstⅠ：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’3’-CTGACGCATGGTTAA-5’EcoRⅠ：

5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’3’-CTGACGCATGGTTAA-5’

接頭序列MseⅠ接頭、PstⅠ分別為：40M00:5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'；P00:5'-

GACTGCGTACCAATTC-3';E00:5'-GACTGCGTACCAATTC-3';MseI-primers+3:5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3‘EcoRI-primers+3:5'-GACTGCGTACCAATTCNNN-3‘PstI-primers+3:5'-GACTGCGTACATCGAGNNN-3‘M00:5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'；41

AFLP技術(shù)的特點(diǎn)（1）由于內(nèi)切酶及選擇性堿基組合數(shù)和種類(lèi)很多，產(chǎn)生標(biāo)記數(shù)無(wú)限，可覆蓋整個(gè)基因組。（2）多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它分子標(biāo)記，一般可檢測(cè)到50-100個(gè)AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠在遺傳關(guān)系十分相近的材料產(chǎn)生多態(tài)性，被認(rèn)為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項(xiàng)技術(shù)。（3）AFLP分析由于擴(kuò)增片段較短（30-700bp)，分辨率高。AFLP技術(shù)的特點(diǎn)（1）由于內(nèi)切酶及選擇性堿基組合數(shù)和種類(lèi)42（4）AFLP分析用樣量少（0.05-0.5gDNA），而且對(duì)模板濃度的變化不敏感。（5）由于特定引物擴(kuò)增，退火溫度高，因而假陽(yáng)性低，可靠性高。（6）引物在不同物種間是通用的，可用于沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的物種。（7）銀染技術(shù)具有快速、方便的特點(diǎn)，在1-2天內(nèi)可以得到指紋。（4）AFLP分析用樣量少（0.05-0.5gDNA）43AFLP操作具體包括三個(gè)步驟：1.

酶切--連接；2.PCR擴(kuò)增，使目的序列擴(kuò)增到0.5～1μg；3.電泳分離（利用聚丙烯酰胺凝膠）。對(duì)于基因組較大的物種，需要進(jìn)行兩步擴(kuò)增—預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。AFLP操作步驟：AFLP操作具體包括三個(gè)步驟：AFLP操作步驟：44模板DNA的酶切與連接DNA（200ng/μl） 2.5μlMseⅠ 3單位PstⅠ 3單位MseⅠ接頭（50pmol/μl） 1.0μlPstⅠ接頭（5pmol/μl） 1.0μl10×NEBBuffer 2.5μl100×BSA 0.25μlATP（10mM） 2.0μlT4-連接酶（3U/μl） 0.4μl加水至25μl，37℃酶切-連接4-6小時(shí)，或過(guò)夜。

AFLP實(shí)驗(yàn)程序模板DNA的酶切與連接DNA（200ng/μl） 2.545DNA片段的預(yù)擴(kuò)增取2.0μl完成的樣品，加入18μl如下混合液：

MseⅠ引物（M00，50ng/μl）0.6μlPstⅠ引物（P00，50ng/μl）0.6μl10×PCRBuffer 2.0μlMg2+（25mM） 1.2μl

Taq酶（5U/μl） 0.1μldNTP（25mM） 0.16μl加ddH2O至20μl

DNA片段的預(yù)擴(kuò)增取2.0μl完成的樣品，加入18μl如下混46混合后，在如下PCR條件下擴(kuò)增：Step1 95℃2分鐘Step2 95℃30秒Step3 56℃30秒Step4 72℃60秒Step5 GOTOStep231cyclesStep6 72℃5分鐘混合后，在如下PCR條件下擴(kuò)增：47AFLP的選擇性擴(kuò)增取4μl稀釋預(yù)擴(kuò)增液，加入16μl如下反應(yīng)液：PstⅠ引物（50ng/μl） 0.8μlMseⅠ引物（50ng/μl）0.8μl10×PCRBuffer 2.0μlMg2+（30mM） 1.1μldNTP（25mM） 0.18μlTaq酶（5U/μl） 0.12μlddH2O 11.0μlAFLP的選擇性擴(kuò)增取4μl稀釋預(yù)擴(kuò)增液，加入16μl如下反48混合后按如下PCR程序擴(kuò)增：

Step1 95℃2分鐘

Step2 95℃30秒

Step3 65℃30秒（-0.7℃/cycle）

Step4 72℃60秒

Step5 GOTOStep212循環(huán)

Step6 95℃30秒

Step7 56℃30秒

Step8 72℃60秒

Step9 GOTOStep630cyclesStep10 72℃5分鐘混合后按如下PCR程序擴(kuò)增：49AFLP的檢測(cè)銀染熒光同位素檢測(cè)AFLP的檢測(cè)銀染50注意事項(xiàng)：1．AFLP酶切反應(yīng)對(duì)模板DNA質(zhì)量要求較高，要求260/280在1.8左右，且不能有降解。2．AFLP反應(yīng)對(duì)模板DNA濃度不是很敏感，在50pg-50ng時(shí)，均可以觀察到多態(tài)性帶，但為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，DNA濃度不能太低。3．酶切-連接反應(yīng)可以分開(kāi)作，也可以合在一起作，但合在一起更方便些。注意事項(xiàng)：1．AFLP酶切反應(yīng)對(duì)模板DNA質(zhì)量要求較高，要求514．AFLP反應(yīng)對(duì)PCR要求較高，要首先摸索優(yōu)化Mg2+、dNTP條件，達(dá)到最佳擴(kuò)增。5．EcoRⅠ受甲基化胞嘧啶的影響較小，而PstⅠ對(duì)富含的甲基化胞嘧啶十分敏感，因而PstⅠ-MseⅠ檢測(cè)的多為表達(dá)區(qū)域，而EcoRⅠ-MseⅠ檢測(cè)位點(diǎn)聚集在甲基化較高的重復(fù)序列區(qū)域。4．AFLP反應(yīng)對(duì)PCR要求較高，要首先摸索優(yōu)化Mg2+、d526．引物中用作選擇性核苷酸的Ｇ和Ｃ含量對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物數(shù)目有影響。一般而言，Ｇ和Ｃ含量越高，擴(kuò)增出的產(chǎn)物數(shù)目越少。7．同位素、熒光標(biāo)記分辨率較高，但價(jià)格昂貴，操作不方便；銀染方法方便快捷，掌握好各個(gè)環(huán)節(jié)，同樣可以達(dá)到很好的效果。6．引物中用作選擇性核苷酸的Ｇ和Ｃ含量對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物數(shù)目有影53為什么用雙酶解?適合PCR擴(kuò)增效率與變性膠的分辨率減少PCR擴(kuò)增的片段,從而減少使用選擇性堿基的數(shù)目使標(biāo)記單鏈成為可能增加PCR擴(kuò)增的靈活性增加使用引物的靈活性為什么用雙酶解?適合PCR擴(kuò)增效率與變性膠的分辨率54為什么要預(yù)擴(kuò)增?減少選擇性堿基的錯(cuò)配減輕背景提供足量模板DNA降低模板濃度的影響為什么要預(yù)擴(kuò)增?減少選擇性堿基的錯(cuò)配55目的：分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)篩選BAC文庫(kù)，進(jìn)行圖位克?。╩ap-basedgenecloning）AFLPSCAR目的：AFLPSCAR56PIC/Simpson遺傳多樣性系數(shù)=1-Pi2等位基因數(shù)目A

A=4PIC=1–SUM(0.47)2+(0.30)2+(0.17)2+(0.04)2=0.64SSR資料：PIC/Simpson遺傳多樣性系數(shù)=1-Pi57遺傳相似系數(shù)Gower(1985):

a+da+b+c+d簡(jiǎn)單匹配系數(shù)（SM）(Simplematchingcoefficient)

aa+b+cJaccard相似系數(shù)(Jaccard1908).

2a2a+b+cDice(1945)相似系數(shù)，即Nei&Li(1979)相似系數(shù).遺傳相似系數(shù)Gower(1985):a+58其中:abcd+

-+-kj其中:abcd+-+-kj59遺傳距離的計(jì)算：Rogers（1972）Rogers-W（RogersdistanceasmodifiedbyWright（1978）遺傳距離的計(jì)算：Rogers（1972）Rogers-W（R60兩個(gè)隨機(jī)群體j、k間的遺傳距離（Nei1972）:

Xij為X群體第i個(gè)位點(diǎn)第j個(gè)等位基因頻率

Yij為Y群體第i個(gè)位點(diǎn)第j個(gè)位點(diǎn)基因頻率

兩個(gè)隨機(jī)群體j、k間的遺傳距離（Nei1972）:61在種質(zhì)資源研究中，大多數(shù)采用羅杰斯距離（RD）和改良的羅杰斯距離（MRD）（Rogers，1972；Goodman&Stuber，1983）。根據(jù)遺傳特性確定的羅杰斯距離在相關(guān)種質(zhì)的親緣關(guān)系分析中非常有用；而改良的羅杰斯距離還適用于雜種優(yōu)勢(shì)研究。

在種質(zhì)資源研究中，大多數(shù)采用羅杰斯距離（RD）和改良的羅杰斯62聚類(lèi)分析聚類(lèi)指標(biāo)：遺傳相似系數(shù)遺傳距離聚類(lèi)方法：SAHN（SequentialAgglomerativeHierarchicalandNested）clustering

常用UPGMA分析軟件：NTSYS-pc2.02（Rholf，1998）聚類(lèi)分析聚類(lèi)指標(biāo)：63QTL分析單標(biāo)記作圖法；區(qū)間作圖法；Mapmaker/QTL/genome_/genome_software

復(fù)合區(qū)間作圖法；Cartographer、QTLmapper/qtlcart/WQTLCart.htm/ics/faculty/zhujun.htmQTL分析單標(biāo)記作圖法；64‘A’HomozygotefortheallelefromAparent‘B’HomozygotefortheallelefromBparent‘H’HeterozygotecarryingbothalellesAandB‘C’EitherBBorABgenotype‘D’EitherAAorABgenotype‘-’Missingdatafortheindividualatthislocus‘A’Homozygoteforthealle65datatypeF2intercross2051*locus1BBBHH-AAABBBHHH-AABA*locus2AB-ABHABHAB-AB-ABHAH*locus3ABBAHHHBHABHABHBBHH-#Locus3maybemis-scoredinindividual12!*locus4ABHHABAAAHAB-ABHABHH*locus5ABHABHAA-ABHABHAHHHB*trait8.79.0-7.56.8datatypeF2intercross66EST(ExpressedSequenceTags)SNP（singlenucleotidepolymophism）cSSR、cSNPDNA微陣列（Microarray）蛋白質(zhì)組學(xué)．．．．．．新型分子標(biāo)記EST(ExpressedSequenceTags)新67EST是長(zhǎng)約150-400bp的基因表達(dá)序列片段，攜帶著完整基因的某些片段。

mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，克隆到質(zhì)?；蚴删w載體，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，而后大規(guī)模隨機(jī)挑選克隆，對(duì)5’或3’端進(jìn)行一步法測(cè)序，獲得對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳變異、衰老死亡等過(guò)程認(rèn)識(shí)的技術(shù)。EST(ExpressedSequenceTags)EST是長(zhǎng)約150-400bp的基因表達(dá)序列片段，攜帶著完68DNADatabankscDNAresourcesGenbank(NCBI),NucleotideSequenceDatabase(EMBL),DDBJ,MGC,…GenomicDNAresourcesHTG,dbGSS,GOLD,ERGO,…ESTresourcesdbEST,UniGene,GIs,STACKS,DOTS,…OthersdbSTS,UniSTS,dbSNP,TransFac,ISIS,Repbase,......DNADatabankscDNAresources69常用基因組網(wǎng)址：擬南芥:TheArabidopsisInformationResource(TAIR)

/水稻：RiceGenehttp:///大豆：SoyBase

4/玉米：MaizeDB,MaizeGDB/小麥：GrainGene

/棉花:CottonDB

/htdocs-cotton/cottondb.html苜菽：Alfagenes

/大麥：BarleyDB--/barley.html油菜：BrassicaDB

Http:///brassica.html高梁：SorghumDb/sorghumdb.html常用基因組網(wǎng)址：擬南芥:TheArabidopsisI70單核苷酸多態(tài)（SNP

-singlenucleotidepolymophism）SNP是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)，即基因中的點(diǎn)突變。特點(diǎn)：雙等位基因在基因組中的發(fā)生頻率比較高有些SNP位點(diǎn)還影響基因的功能

SNPs可大大豐富既有的連鎖圖成熟自動(dòng)化技術(shù)，有望分析成千上萬(wàn)的SNPs

單核苷酸多態(tài)（SNP

-singlenucleotide71cSSR、cSNP———從EST中開(kāi)發(fā)SSR、SNP目前某些植物全序列的測(cè)定及EST數(shù)據(jù)庫(kù)的開(kāi)發(fā)，為SSR、SNP的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟了新的途徑。優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)序列，與特定功能有聯(lián)系多態(tài)性豐富，可大大豐富標(biāo)記數(shù)目開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)cSSR、cSNP72利用DNA芯片技術(shù)，將大量探針固定于玻/硅片上，然后用熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行大量分子雜交，以比較不同組織或器官的基因表達(dá)水平，篩選突變基因，分析基因表達(dá)模式。

優(yōu)點(diǎn)：密度高、制作方便，解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目的分子數(shù)量少、低通量等不足DNA微陣列（Microarray）利用DNA芯片技術(shù)，將大量探針固定于玻/硅片上，然后用熒73微型化高通量—提高信息量平行化—提高信息的可比性微量化—降低待檢樣品用量自動(dòng)化—提高工作效率低成本—可迅速普及推廣生物芯片的特征與優(yōu)點(diǎn)微型化高通量—提高信息量平行化—提高信息的可比性微量化—降低74蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,是基因功能的執(zhí)行體，決定了生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等各種性狀。蛋白質(zhì)組研究---了解生物體蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)空分布規(guī)律,不同個(gè)體/組織間的表達(dá)差異蛋白質(zhì)分子標(biāo)記---定位生物的表性變異(如抗病、抗逆等性狀)和相關(guān)基因蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,是基因功能75Thekeytechniqueinvolvesinproteomics1.Massspectrometry2.Two-dimensionalgelelectrophoresis3.Yeasttwo-hybridsystemThekeytechniqueinvolvesin76分子標(biāo)記技術(shù)

在植物遺傳研究中的應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)

在植物遺傳研究中的應(yīng)用77利用遺傳圖和遺傳標(biāo)記可用來(lái)加速植物育種進(jìn)程。經(jīng)典遺傳圖譜：形態(tài)、生理和生化標(biāo)記，數(shù)量極為有限，圖譜分辨率大都很低，表現(xiàn)標(biāo)記少，圖距大，飽和度低。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，使圖譜上標(biāo)記的密度越來(lái)越高。植物基因組遺傳作圖利用遺傳圖和遺傳標(biāo)記可用來(lái)加速植物育種進(jìn)程。植物基因組遺傳作78構(gòu)建遺傳圖譜（molecularmarkerlinkagemap）以具有遺傳多型性的分子標(biāo)記為“路標(biāo)”P(pán)olymorphicmolecularmarkeras“routesign”以減數(shù)分裂中發(fā)生的遺傳重組交換值為圖距Recombinationfrequency(%)inmeiosisas“mapdistance(cM)”繪制高密度的分子標(biāo)記連鎖圖Geneticlinkagemapwithhighdensity構(gòu)建遺傳圖譜以具有遺傳多型性的分子標(biāo)記為“路標(biāo)”79QTL作圖所需的數(shù)據(jù)遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)數(shù)量性狀數(shù)據(jù)QTL作圖所需的數(shù)據(jù)遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)數(shù)量性狀數(shù)據(jù)80分子標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建

定位群體親本間多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選定位群體的組建定位群體分子標(biāo)記分析分子標(biāo)記連鎖圖譜的繪制分子標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建定位群體親本間多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選81利用3個(gè)分離群體，一個(gè)人，三個(gè)月時(shí)間，能完成包括1032個(gè)AFLP標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜（Faye等1995）。AFLP不僅能縮小抗病基因與連鎖標(biāo)記之間的距離，而且在RFLP遺傳圖上，可增加染色體末端標(biāo)記和填充RFLP空隙，不干擾RFLP標(biāo)記簇，從而大大增加了遺傳圖的飽和度。利用3個(gè)分離群體，一個(gè)人，三個(gè)月時(shí)間，能完成包括1032個(gè)A82在植物遺傳多樣性研究上的應(yīng)用對(duì)植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的全面了解，對(duì)于拓寬遺傳基礎(chǔ)的育種策略十分重要。eg.賈繼增等（1997）利用21條染色體上473個(gè)RFLP探針對(duì)小麥遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，小麥不同位點(diǎn)、不同染色體上的遺傳多樣性各不相同，普通小麥B基因組遺傳多樣性較高，其中尤以2B、6B、7B更高，而D組的遺傳多樣性最差。對(duì)在小麥育種中引進(jìn)新的遺傳變異具有一定的意義。在植物遺傳多樣性研究上的應(yīng)用對(duì)植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的全面了83

eg.通過(guò)288個(gè)位點(diǎn)上對(duì)338個(gè)一粒小麥系群AFLP指紋分析，結(jié)合種系分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于土耳其東南部Karacadag山脈的一個(gè)野生一粒小麥（T.boeoticum）群體與栽培一粒小麥（T.monococcum）遺傳上最為相近，從而推斷該地區(qū)為現(xiàn)代栽培一粒小麥的發(fā)源地（Heun等1998）。植物起源、分類(lèi)和進(jìn)化研究eg.通過(guò)288個(gè)位點(diǎn)上對(duì)338個(gè)一粒小麥系群AFLP指84品種的DNA指紋圖譜

定義：能夠鑒定作物品種之間差異的電泳圖譜。特點(diǎn)：高度的個(gè)體特異性、環(huán)境的穩(wěn)定性及豐富的多態(tài)性。用途：鑒定品種真實(shí)性和純度，用于新品種登記和品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等。其中AFLP被推薦為指紋圖譜繪制的最佳方法之一。eg.Law等（1998）利用6個(gè)AFLP引物組合產(chǎn)生90多條多態(tài)性條帶，建立了英國(guó)1934-1994廣泛種植的55份小麥的指紋圖譜。品種的DNA指紋圖譜定義：能夠鑒定作物品種之間差異的電泳圖85基因定位

質(zhì)量性狀的基因定位

近等基因系（NearIsogenicLines,NILs）NILs幾乎僅在目標(biāo)性狀上存有差異，一般凡是能在近等基因系間揭示多態(tài)性的分子標(biāo)記，就極可能位于目標(biāo)基因的兩翼附近。利用NILs方法已定位了許多質(zhì)量性狀基因，eg.番茄抗病毒基因Tm-2a，番茄抗細(xì)菌病毒基因及水稻半矮桿基因Sdy等?；蚨ㄎ?/p>

質(zhì)量性狀的基因定位

近等基因系（NearIs86原理：將分離群體(F2、BC、DH）中的個(gè)體依據(jù)目標(biāo)性狀(如抗病、感病)分成兩組，在每一組中將若干個(gè)體DNA等量混合，形成兩個(gè)DNA混合池(如抗病池和感病池)。由于分組時(shí)僅對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，因此兩個(gè)池之間理論上就應(yīng)主要在目標(biāo)基因區(qū)段存有差異，也稱(chēng)近等基因池法。優(yōu)點(diǎn)：克服了許多作物沒(méi)有或難以創(chuàng)造相應(yīng)NILs的限制(Michelmore等1991)。定位基因：萵苣抗霜霉病基因、水稻抗癭蠓基因水稻抗稻瘟病基因、水稻耐黃叢卷葉病毒病基因等分離群體分組分析法(BulkedSegregationAnalysis)原理：將分離群體(F2、BC、DH）中的個(gè)體依據(jù)目標(biāo)性狀(如87產(chǎn)量、品質(zhì)、熟期等大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀，均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)，受許多數(shù)量基因座位（QuantitativeTraitLoci,QTLs）和環(huán)境因子的共同作用。數(shù)量遺傳學(xué)無(wú)法確定控制數(shù)量性狀的QTLs數(shù)目，也無(wú)法確定單個(gè)QTL的遺傳效應(yīng)及染色體位置。分子連鎖圖譜的發(fā)展，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)QTL遺傳效應(yīng)的追蹤，從而應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇。目前已發(fā)展了QTLs定位的多種方法。數(shù)量性狀基因的定位產(chǎn)量、品質(zhì)、熟期等大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀，均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特88基于圖譜的基因克隆

誰(shuí)最先了解基因的功能，誰(shuí)就擁有了該基因的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，也就獲得了更多的利潤(rùn)。

克隆基因途徑——正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)。前者以欲克隆基因的功能為基礎(chǔ)，通過(guò)鑒定其產(chǎn)物或某種表型的突變進(jìn)行；后者則著眼于基因本身，通過(guò)其特定的序列或其在基因組中的特定位置進(jìn)行。基于圖譜的基因克隆誰(shuí)最先了解基因的功能，誰(shuí)就擁有了該基因的89圖位克隆條件：(1)目標(biāo)基因附近緊密連鎖的DNA標(biāo)記；(2)知道這些標(biāo)記與目的基因的位置一旦建立與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記圖，就可以找到染色體步行的起始點(diǎn)，從而進(jìn)行定位克隆。圖位克隆條件：90比較基因組研究

利用相同的DNA分子標(biāo)記（主要是cDNA標(biāo)記和基因克隆）在相關(guān)物種之間進(jìn)行遺傳或物理作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布特點(diǎn)，揭示染色體或染色體片段上的基因及其排列順序的相同或相似性，并由此對(duì)相關(guān)物種的基因組結(jié)構(gòu)和起源進(jìn)化進(jìn)行分析。比較基因組研究利用相同的DNA分子標(biāo)記（主要是cDNA標(biāo)記91新發(fā)現(xiàn)：不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性、拷貝數(shù)及連鎖順序上都具有很大程度的保守性。eg番茄、馬鈴薯和辣椒（Tanksley等1988；1992）；水稻、小麥和玉米（Ahn等，1993；1994）；小麥、大麥和黑麥（Devos等，1993）；高粱和玉米（Pereira等，1994）；以及大麥和水稻（Maroof等，1996）．．．．．．新發(fā)現(xiàn)：不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性、拷貝數(shù)及連鎖順序上都92分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用課件93比較基因組學(xué)研究表明，不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性，拷貝數(shù)及連鎖順序上都具有很大程度的保守性。啟示：模式植物上遺傳作圖成果可推而廣之。可借助比較基因組共享分子標(biāo)記，使建立高密度遺傳連鎖圖可資利用的標(biāo)記顯著增加，從而大大提高了獲取離目標(biāo)基因很近分子標(biāo)記的的可能性。比較基因組學(xué)研究表明，不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性，拷貝數(shù)94應(yīng)用比較基因組學(xué)進(jìn)行基因的克隆綠色革命Rht1、Rht2基因的克隆擬南芥GAI水稻EST篩選小麥BAC文庫(kù)Rht1、Rht2Blast探針標(biāo)記應(yīng)用比較基因組學(xué)進(jìn)行基因的克隆綠色革命Rht1、Rht2基因95深遠(yuǎn)意義比較基因組研究已使得傳統(tǒng)的植物遺傳學(xué)突破了物種的框架限定，發(fā)展成了新的系統(tǒng)遺傳學(xué)。隨著最近一些生物的基因組全序列的獲得，比較基因組研究也隨之步入了一個(gè)新的時(shí)代。深遠(yuǎn)意義96研究基因表達(dá)與調(diào)控傳統(tǒng)方法是利用cDNA文庫(kù)篩選和Northern雜交。AFLP研究基因表達(dá)是非常有效的方法，可同時(shí)比較植物發(fā)育的不同時(shí)期以及分離某些重要基因（cDNA-AFLP）。研究基因表達(dá)與調(diào)控傳統(tǒng)方法是利用cDNA文庫(kù)篩選和North97利用cDNA-AFLP的方法，闡明了馬鈴薯塊莖在不同發(fā)育階段基因表達(dá)的情況，并克隆了2個(gè)與塊莖脂肪氧合酶高度同源的cDNA片段（Bachem等1996）。利用cDNA-AFLP的方法，闡明了馬鈴薯塊莖在不同發(fā)育階段98在植物育種上的應(yīng)用在雜交育種中，單單根據(jù)育種材料的表型特點(diǎn)選配親本，往往會(huì)受到環(huán)境條件的干擾。輔之以DNA分子標(biāo)記的差異性分析，將使得親本選配更為快速、準(zhǔn)確，從而提高育種效率。揭示育種材料之間的親緣關(guān)系在植物育種上的應(yīng)用在雜交育種中，單單根據(jù)育種材料的表型特點(diǎn)選99雜種優(yōu)勢(shì)利用正成為許多作物提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)的重要途徑。對(duì)遺傳差異與雜種優(yōu)勢(shì)關(guān)系的評(píng)價(jià)方法經(jīng)歷了從形態(tài)性狀遺傳距離，到生化標(biāo)記遺傳差異，親緣系數(shù)，以及分子標(biāo)記遺傳差異等各種嘗試。雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)及機(jī)理研究雜種優(yōu)勢(shì)利用正成為許多作物提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)的重要途徑。雜種100

DNA分子標(biāo)記的應(yīng)用，使得能夠在整個(gè)基因組范圍內(nèi)對(duì)大量親本材料間的遺傳距離進(jìn)行估測(cè)，并在此基礎(chǔ)上有效地預(yù)測(cè)具有強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的組合（Smith等，1992；Bernardo，1994）。結(jié)果：既有相關(guān)性很高的報(bào)道，又有完全相反的結(jié)果。分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用課件101張啟發(fā)認(rèn)為：分子標(biāo)記雜合度與雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性因遺傳材料而異，在經(jīng)過(guò)改良的優(yōu)良種質(zhì)中，兩者之間高度相關(guān)，而在一些未經(jīng)改良的優(yōu)良種質(zhì)中，相關(guān)程度很低。提出了“上位性是雜種優(yōu)勢(shì)的主要遺傳基礎(chǔ)”的重要觀點(diǎn)。張啟發(fā)認(rèn)為：102應(yīng)用cDNA－AFLP技術(shù)進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的研究表明，強(qiáng)優(yōu)勢(shì)與弱優(yōu)勢(shì)組合間基因表達(dá)有明顯差異，有增強(qiáng)型、減弱型和沉默型。雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)與單親沉默、雙單親沉默有密切關(guān)系。應(yīng)用cDNA－AFLP技術(shù)進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的研究表明，強(qiáng)優(yōu)勢(shì)103大量研究表明，雖然分子標(biāo)記揭示的遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系比較復(fù)雜，但親本之間的遺傳差異是產(chǎn)生的主要原因。通過(guò)對(duì)與雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)QTLs效應(yīng)的研究，可以加深對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的了解。大量研究表明，雖然分子標(biāo)記揭示的遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系比較104我國(guó)玉米種質(zhì)基礎(chǔ)

亞群 類(lèi)群

標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種

四平頭 Dom

黃早四旅大紅骨 丹340BSSS A

B73PA 掖478Lancaster B

Mo17PB齊319我國(guó)玉米種質(zhì)基礎(chǔ) 亞群 類(lèi)群 105分子標(biāo)記輔助選擇

（MAS,markerassistedselection)

分子標(biāo)記輔助選擇幾乎不受環(huán)境條件的影響，還可以跟蹤外源基因，克服回交的缺點(diǎn)，可大大提高選擇的效率。長(zhǎng)期以來(lái)，選擇都是基于植株的表型性狀進(jìn)行的。植物的許多性狀為數(shù)量性狀，受許多微效基因的控制，且易受環(huán)境的影響。分子標(biāo)記輔助選擇

（MAS,markerassisted106快速有效地選擇出帶有目標(biāo)基因的單株表現(xiàn)在:1.不受環(huán)境條件及生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響，在苗期或低世代就可進(jìn)行篩選;2.利用共顯性標(biāo)記可直接對(duì)隱性目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，無(wú)需測(cè)交或自交檢驗(yàn);3.如果目標(biāo)性狀不能在當(dāng)代進(jìn)行選擇，采用MAS可直接在當(dāng)代確定?？焖儆行У剡x擇出帶有目標(biāo)基因的單株表現(xiàn)在:107快速選出以輪回親本為遺傳背景的單株在回交育種中不僅要考慮優(yōu)良性狀的導(dǎo)入，還必須考慮保持其整個(gè)基因組的遺傳背景基本不變。通過(guò)MAS技術(shù)，借助于飽和的分子標(biāo)記連鎖圖，對(duì)各選擇單株進(jìn)行整個(gè)基因組的組成分析，進(jìn)而可以選出帶有多個(gè)目標(biāo)性狀而且遺傳背景良好的理想個(gè)體?？焖龠x出以輪回親本為遺傳背景的單株在回交育種中不僅要考慮優(yōu)良108當(dāng)回交轉(zhuǎn)移性狀由隱性基因控制時(shí)，需在選擇前先自交一代使其純合化；而且當(dāng)選擇的是如抗病這樣的性狀時(shí)，還要借助于繁瑣的接種鑒定等。賈繼增等（2001）根據(jù)AFLP標(biāo)記進(jìn)行小麥白粉病抗性的回交選擇，對(duì)小麥的外源染色質(zhì)及基因可以進(jìn)行準(zhǔn)確的跟蹤鑒定，從而加速種質(zhì)創(chuàng)新的進(jìn)程。當(dāng)回交轉(zhuǎn)移性狀由隱性基因控制時(shí)，需在選擇前先自交一代使其純合109計(jì)算機(jī)模擬表明：如果從每個(gè)回交世代含有目標(biāo)基因的30個(gè)的單株中，通過(guò)MAS選出1株帶有輪回親本基因組比率最高的個(gè)體作為下一次回交的親本，則完全恢復(fù)到輪回親本基因組的基因型只需3代。在傳統(tǒng)育種方法中，要達(dá)到99%輪回親本比率則需6.5代（Tanksley等1998）。計(jì)算機(jī)模擬表明：110有效選擇目標(biāo)基因附近發(fā)生重組的個(gè)體回交育種中,傳統(tǒng)解決連鎖累贅?lè)绞绞峭ㄟ^(guò)擴(kuò)大選擇群體或增加回交次數(shù)。但研究表明，即使回交20代，還能發(fā)現(xiàn)相當(dāng)大與目標(biāo)基因連鎖的供體染色體片段。Tanksley研究表明，用位于目標(biāo)基因兩側(cè)1cM的兩個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，通過(guò)兩個(gè)世代就可獲得含目標(biāo)基因長(zhǎng)度不大于2cM的個(gè)體，如果采用傳統(tǒng)的育種方式則需要100代。有效選擇目標(biāo)基因附近發(fā)生重組的個(gè)體回交育種中,傳統(tǒng)解決連鎖111通過(guò)對(duì)Opaque-2基因中開(kāi)發(fā)的SSR引物，以及與Opaque-2共分離的RFLP標(biāo)記，我們正在進(jìn)行QPM分子標(biāo)記輔助育種。通過(guò)對(duì)Opaque-2基因中開(kāi)發(fā)的SSR引物，以及與Opaq112基因聚合將多個(gè)有利基因通過(guò)選育途徑聚合到一個(gè)品種之中,這些基因可以控制相同的性狀也可以控制不同的性狀?；蚓酆贤黄屏嘶亟挥N改良個(gè)別性狀的局限,使品種在多個(gè)性狀上同時(shí)得到改良?；蚓酆蠈⒍鄠€(gè)有利基因通過(guò)選育途徑聚合到一個(gè)品種之中,這些基113數(shù)量性狀遺傳改良由于數(shù)量性狀遺傳的復(fù)雜性，存在以下問(wèn)題:1)QTL與環(huán)境之間的互作降低了對(duì)數(shù)量性狀基因定位的準(zhǔn)確性;2)由于單個(gè)QTL呈微效作用,所以必須同時(shí)操作多個(gè)QTL才能使性狀發(fā)生顯著變化;3)QTL之間存在互作關(guān)系,使得對(duì)QTL的效應(yīng)估計(jì)發(fā)生偏差;4)在對(duì)QTL進(jìn)行轉(zhuǎn)移時(shí),如果沒(méi)有轉(zhuǎn)移互作QTL,則不會(huì)達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。數(shù)量性狀遺傳改良由于數(shù)量性狀遺傳的復(fù)雜性，存在以下問(wèn)題:114Khan等（2000）以AFLP等分子標(biāo)記輔助選擇，將二粒小麥6BS的高谷蛋白QTL成功地轉(zhuǎn)入普通小麥品種Glupro。Stuber（1995）把產(chǎn)量有關(guān)的QTLs分別從Tx303和oh43轉(zhuǎn)移到B73和Mo17兩個(gè)玉米自交系中，由這兩個(gè)改良的自交系組配雜交種，產(chǎn)量比對(duì)照雜交種增產(chǎn)15%以上。Xiao等(1996)利用分子標(biāo)記從普通野生稻中鑒別出2個(gè)增產(chǎn)的QTL,并轉(zhuǎn)移到栽培稻中。．．．．．．成功的報(bào)道成功的報(bào)道115

分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用116遺傳標(biāo)記（geneticmarker）具有多型性易于鑒別與目標(biāo)基因緊密連鎖

性狀標(biāo)記

色澤，形態(tài)…

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

倒位，易位，G/N/C帶…

生化標(biāo)記

同功酶…

分子標(biāo)記RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP……基礎(chǔ)-基因表達(dá)結(jié)果表現(xiàn)型DNA堿基序列變異遺傳標(biāo)記性狀標(biāo)記基礎(chǔ)-DNA堿基117形態(tài)標(biāo)記遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見(jiàn)的外部特征---遺傳與環(huán)境、結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果。如穗形、芒長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。特點(diǎn)：直觀簡(jiǎn)單從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達(dá)、調(diào)控、個(gè)體發(fā)育等環(huán)節(jié)，表型差異有時(shí)難以反映基因型差異。形態(tài)標(biāo)記遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見(jiàn)的外部特征118細(xì)胞學(xué)標(biāo)記染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）。隨著分帶、細(xì)胞原位雜交等研究技術(shù)的發(fā)展，可在染色體水平揭示更多遺傳變異。特點(diǎn)：直觀、快速而經(jīng)濟(jì)，但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時(shí)難以分辨。

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、119生化標(biāo)記——貯藏蛋白和同工酶貯藏蛋白同工酶特點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、方便、成本較低結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)非結(jié)構(gòu)基因無(wú)能為力；所檢測(cè)位點(diǎn)只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時(shí)受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境影響。生化標(biāo)記——貯藏蛋白和同工酶貯藏蛋白120分子標(biāo)記本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點(diǎn)：（1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達(dá)與否的限制；（2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異；（3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個(gè)基因組；（4）表現(xiàn)為“中性”，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無(wú)必然的連鎖；（5）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。分子標(biāo)記本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點(diǎn)：121分子標(biāo)記的分類(lèi)（Staub等1996）分子標(biāo)記以Southern為基礎(chǔ)如RFLP以PCR為基礎(chǔ)單引物PCR標(biāo)記有RAPD、

AP-PCR、DAF、ISSR等雙引物選擇性擴(kuò)增PCR主要指AFLP需克隆、測(cè)序構(gòu)建特殊雙引物PCR標(biāo)記 如SSR、STS等分子標(biāo)記的分類(lèi)（Staub等1996）分子標(biāo)記以Southe122植物遺傳研究中常用的分子標(biāo)記RFLP—RestrictionFragmentLengthPolymorphismRAPD—RandomAmplifiedPolymorphicDNAs

(DAF,AP-PCR)SSR—SimpleSequenceRepeatAFLP—AmplifiedFragmentLengthPolymorphism植物遺傳研究中常用的分子標(biāo)記RFLP—Restricti123RFLP原理：DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜同位素或非放射標(biāo)記（如地高辛等）的探針雜交膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小RFLP原理：124酶切：3-5ugDNA，以10U內(nèi)切酶酶切5小時(shí)電泳：0.6-0.8%瓊脂糖膠70V電泳16小時(shí)染色：EtBr染色20分鐘變性：0.25MHCl20分鐘，抽真空，水冼印跡：加入0.4NNaOH，進(jìn)行Southern印跡沖洗：以2×SSC冼膠，風(fēng)干酶切—電泳—印跡酶切：3-5ugDNA，以10U內(nèi)切酶酶切5小時(shí)酶切—電125—雜交—洗脫預(yù)雜交：將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、5×HSB、DenhardtⅢ）中，封好后置65℃溫箱中振蕩5－6小時(shí)。雜交：預(yù)雜交液中加入標(biāo)記好的marker和探針，放入雜交膜浸勻。封好雜交盒后，置65℃溫箱中振蕩過(guò)夜。洗脫：將膜轉(zhuǎn)入洗脫盒，加入洗脫液65℃振蕩洗脫兩次（15min/次），吸干包好?！s交—洗脫預(yù)雜交：將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、5×HSB、126—放射自顯影將洗脫好的雜交膜置于增感屏上,于暗室中將X-光片放于雜交膜上，再放上另一張?jiān)龈衅?，裝人暗袋，并用夾板夾好。置-70℃超低溫冰箱中曝光10天左右。使用磷屏儀，操作更方便?！派渥燥@影將洗脫好的雜交膜置于增感屏上,于暗室中將X-127RFLP探針來(lái)源：cDNA探針與基因組DNA（gDNA）探針cDNA探針:保守性較強(qiáng)，探針檢測(cè)的多態(tài)性頻率較低。gDNA探針:檢測(cè)的多態(tài)性頻率較高，但不同種屬特異性較強(qiáng)。玉米R(shí)FLP探針：/probes.HtmlRFLP探針來(lái)源：cDNA探針與基因組DNA（gDNA）探針128探針標(biāo)記—隨機(jī)引物法25ng變性DNA5ul寡聚核苷酸2ulBSA3ul[α-32P]dCTP2ulKlenow酶加水至50ul，37℃溫箱中標(biāo)記2小時(shí)探針標(biāo)記—隨機(jī)引物法25ng變性DNA129RFLP標(biāo)記特點(diǎn)共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)某些植物中開(kāi)發(fā)探針已遍及整個(gè)基因組缺點(diǎn)：DNA需要量較大，技術(shù)復(fù)雜；用于做圖較費(fèi)時(shí)，難以分析大量樣品；

在基因組較大、嚴(yán)格自花授粉作物上多態(tài)性很低，使遺傳圖飽和度低。RFLP標(biāo)記特點(diǎn)共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型130RAPD原理：用一個(gè)隨機(jī)引物（8-10bp）、堿基隨機(jī)排列的寡核苷酸序列，非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后電泳分開(kāi)擴(kuò)增片段。RAPD原理：131PolymeraseChainReaction-PCR3'5'5'3'TargetDNAsequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGdenature@95?C5'3'3'5'GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCannealprimers@60?CTaqpolymerasebinds3’andextendsGCTCGC5'3'3'5'AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNAisdoubledwitheachcycleRepeat25-40timesPolymeraseChainReaction-PCR3132RAPD的操作PCR反應(yīng)：DNA（20ng/μl） 1μlPrimer 15ng10×Buffer 2.0μlMg2+（25mM） 1.2μlTaq酶（5U/μl） 0.15μldNTP（25mM） 0.2μl加水至20μl，再加入石臘油，進(jìn)行PCR擴(kuò)增RAPD的操作PCR反應(yīng)：133Step195℃2分鐘Step295℃15秒Step336℃30秒Step472℃45秒Step5GOTOStep246循環(huán)Step6

72℃5分鐘

PCR擴(kuò)增：Step195℃2分鐘PCR擴(kuò)增：134主要特點(diǎn)無(wú)需雜交，設(shè)計(jì)引物也無(wú)須知道序列信息；DNA需要量少，引物便宜，成本較低；技術(shù)簡(jiǎn)便，操作方便、快速，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)。不同物種間引物通用；缺點(diǎn)：大多顯性遺傳，不能鑒別雜合和純合子；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。主要特點(diǎn)無(wú)需雜交，設(shè)計(jì)引物也無(wú)須知道序列信息；135DAF

(DNAamplificationfingerprinting)：與RAPD不同的是:引物濃度更高，引物長(zhǎng)度更短（一般5－8個(gè)堿基），且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳，通常會(huì)產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型，譜帶信息比RAPDs大得多。（Caetano-Anolles等，1990）DAF

(DNAamplificationfingerp136AP-PCR(arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction)引物較長(zhǎng)（10～50bp）；引物濃度較高；引物長(zhǎng)度不定，并且常常來(lái)自為其它目的而設(shè)計(jì)的引物（如M13通用測(cè)序引物）。AP-PCR(arbitrarilyprimedpoly137ISSRISSR138共同優(yōu)點(diǎn)：

在不需要知道所擴(kuò)增DNA序列情況下，產(chǎn)生DNA片段的指紋；需DNA量少，產(chǎn)生多態(tài)性豐富。缺點(diǎn)：

對(duì)反應(yīng)條件非常敏感，重復(fù)性差。共同優(yōu)點(diǎn)：139SCARs

（SequencedCharacterizedAmplifiedRegions）為提高RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性，把目標(biāo)RAPD片段克隆測(cè)序，根據(jù)片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物（通常24個(gè)堿基），再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可把相應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來(lái)。具有更高的可重復(fù)性共顯性SCARs

（SequencedCharacterized140微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)真核生物基因組普遍存在，呈隨機(jī)分布,大約每隔10-50kb就存在一個(gè)SSR.哺乳動(dòng)物中約為植物的5-6倍;植物中平均23.3kb有一個(gè)SSR;雙子葉植物SSR數(shù)量大于單子葉植物,核DNASSR數(shù)量多于細(xì)胞質(zhì)DNA;根據(jù)核心序列堿基數(shù)的不同,可分為單堿基、2堿基、3堿基、4堿基等多種重復(fù)型。微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)真核生物基因組普遍存在，呈隨機(jī)分布,大約141不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。通過(guò)對(duì)54個(gè)植物種核DNA和28個(gè)植物種細(xì)胞器DNASSR(1-4bp)的搜索,發(fā)現(xiàn)：(AT)ｎ最豐富,然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一類(lèi)內(nèi)堿基種類(lèi)不同的SSR,豐度差別很大。SSR的分布特點(diǎn)不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。SSR的分布特點(diǎn)142SSR的功能長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為SSR是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒(méi)有明確的生理功能。但隨著研究深入，證明并非如此。SSR的主要功能:

編碼氨基酸；染色體末端的SSR，有保護(hù)DNA完整性、避免降解、融合及丟失的功能；提高或降低臨近基因轉(zhuǎn)錄速率；基因重組的熱點(diǎn)，是基因變異的來(lái)源；部分SSR可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合物或活化染色體SSR的功能長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為SSR是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒(méi)有明確的生理143兩端序列多是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR將其間微衛(wèi)星序列擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳技術(shù)獲得長(zhǎng)度多態(tài)性。不同材料重復(fù)次數(shù)的不同，導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性。SSR分析兩端序列多是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引144SSR分子標(biāo)記的創(chuàng)制基因組文庫(kù)的構(gòu)建探針制備-預(yù)雜交-帶有SSR克隆的選擇測(cè)序引物設(shè)計(jì)檢測(cè)其它方法:EST-SSR、相關(guān)種間SSR......SSR分子標(biāo)記的創(chuàng)制基因組文庫(kù)的構(gòu)建145Cross-speciesSSRTaxonomic Transferability PolymorphismDivergence%(N)%(N)Samesubgenus 89.8(521) 78.3(299)Samegenus 76.4(1800) 86.0(773)Samealliance 45.4(403) 50.4(141)Samefamily 35.2(1683) 58.4(363)Cross-speciesSSRTaxonomic T146SSR的操作PCR反應(yīng)：DNA（20ng/μl） 4μlPrimer（1mM） 0.25μl10×Buffer 2.0μlMg2+（25mM） 1.2μlTaq酶（5U/μl） 0.1μldNTP（25mM） 0.2μl加水至20μlSSR的操作PCR反應(yīng)：147混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：Step1 95℃2分鐘Step2 95℃30秒Step3 56℃30秒Step4 72℃60秒Step5 GOTOStep231循環(huán)注：SSR引物退火溫度在52-65℃不等?；旌虾螅M(jìn)行PCR擴(kuò)增：148SSR的特點(diǎn)：兩側(cè)順序保守，在同種間多相同；數(shù)量豐富，在整個(gè)基因組均勻隨機(jī)分布；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；多數(shù)SSR增減重復(fù)序列頻率高，在品種間具廣泛位點(diǎn)變異；共顯性標(biāo)記，可鑒別雜合子和純合子；僅需微量組織，適合PCR分析半自動(dòng)化SSR的特點(diǎn)：兩側(cè)順序保守，在同種間多相同；149相對(duì)的物種專(zhuān)一性；由于開(kāi)發(fā)時(shí)需針對(duì)每個(gè)座位的微衛(wèi)星序列，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)引物，需建立基因文庫(kù)、克隆識(shí)別與篩選、測(cè)序等過(guò)程，開(kāi)發(fā)困難，費(fèi)用較高，耗時(shí)長(zhǎng)；實(shí)際分析時(shí)一般每次只分析單個(gè)位點(diǎn)；不同引物退火溫度不同，需要探索。不足：不足：150SSR的檢測(cè)瓊脂糖凝膠檢測(cè)（同前）聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)一般采用銀染、熒光檢測(cè)。SSR的檢測(cè)瓊脂糖凝膠檢測(cè)（同前）151銀染檢測(cè)程序脫色：加1升10%HAC液，脫色20分鐘沖洗：用重蒸水沖洗膠板2次，每次5分鐘染色：加染色液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分鐘沖洗：用重蒸水沖洗膠板不超過(guò)5秒鐘；顯影：預(yù)冷顯影液（30g/LNaCO3，0.075%甲醛，0.4mg/mlNa2SO3），輕搖到帶紋出現(xiàn)；定影：在固定/停止液并輕搖3-5分鐘；沖洗：用重蒸水沖洗2次，每次2分鐘；干膠：室溫下自然干燥過(guò)夜。銀染檢測(cè)程序脫色：加1升10%HAC液，脫色20分鐘152AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)原理：基于RFLP技術(shù)和PCR技術(shù)的結(jié)合

AFLP（AmplifiedFragmentLength153DNAMseI-MseI

MseI-EcoRI EcoRI-EcoRIMseI-MseI片段環(huán)化，不利小片段擴(kuò)增；EcoRI-EcoRI引物的退火溫度高；MseI-EcoRI片段優(yōu)先擴(kuò)增酶切連接DNA酶切連接154接頭序列MseⅠ接頭、PstⅠ分別為：MseⅠ：

5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’3’-TACTCAGGACTCAT-5’PstⅠ：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’3’-CTGACGCATGGTTAA-5’EcoRⅠ：

5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’3’-C