第3節(jié)薄層色譜分離檢測技術(shù)一課件

第3節(jié)薄層色譜分離檢測技術(shù)一、分離原理

薄層色譜是一種開放性色譜，是將混合組分樣品溶液點在薄層板一端的起始線上，點樣處稱為原點，在密閉容器中用適宜的流動相（薄層色譜法中又稱為展開劑）展開。因吸附劑對不同組分的吸附能力不同，展開劑對不同組分的解吸能力也不完全相同，造成各組分在薄層析上移動的速度有快有慢，經(jīng)過一段時間展開后，不同的組分彼此分開，最終形成相互分離的斑點

薄層色譜法(thinlayerchromatography，TLC)

將固定相均勻平鋪在光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法可分為吸附、分配、分子排阻色譜法等第3節(jié)薄層色譜分離檢測技術(shù)一、分離原理薄層色譜法(thi1二、薄層色譜參數(shù)1．比移值(1）定義

組分遷移的距離與展開劑遷移的距離之比(2)計算方法二、薄層色譜參數(shù)1．比移值(2)計算方法22．相對比移值(1）定義

指被測組分的比移值與參照組分的比移值之比(2）計算方法(3）特點消除系統(tǒng)誤差，值的重復(fù)性和可靠性都比好2．相對比移值(1）定義(2）計算方法(3）特點33．分離度（1)定義衡量薄層色譜分離效果的重要指標(biāo)，是指相鄰兩斑點中心至原點的距離之差與兩斑點平均徑向?qū)挾龋◤较驅(qū)挾仁侵赴唿c沿著展開方向的寬度）的比值

(2）計算方法3．分離度（1)定義(2）計算方法4三、儀器與材料1．吸附劑粒徑5~40硅膠聚酰胺微晶纖維素氧化鋁硅藻土常用硅膠H硅膠G硅膠GF254硅膠HF254

想一想

H、G、F各代表何種意思？試解釋硅膠HF365？三、儀器與材料1．吸附劑粒徑5~40硅膠聚酰胺微52．載板玻璃板塑料膜金屬箔厚度2mm規(guī)格5cm×20cm10cm×10cm10cm×15cm10cm×20cm

種類要求

表面光滑、平整清潔玻板處理措施清潔劑或鉻酸洗液浸泡洗滌，用清水充分清洗，再用蒸餾水或去離子水沖洗，表面應(yīng)不附水珠，晾干備用2．載板玻璃板塑料膜金屬箔厚度2mm規(guī)格5cm×2063．點樣器手動全自動點樣儀定量毛細(xì)管

平口微量注射器

3．點樣器手動全自動點樣儀定量毛細(xì)管平口微量注射器73．展開容器平底色譜專用展開缸雙槽薄層色譜專用展開缸3．展開容器平底色譜專用展開缸雙槽薄層色譜專用展開缸84．顯色劑顯色劑適用范圍顯色方法斑點顏色濃硫酸乙醇溶液多數(shù)有機(jī)化合物噴霧加熱多數(shù)加熱后呈黑色碘多數(shù)有機(jī)化合物薰蒸多數(shù)顯黃棕色磷鉬酸乙醇溶液醛等還原性物質(zhì)噴霧烘干藍(lán)色茚三酮試液氨基酸類噴霧或浸漬紫色或黃色三氯化鐵-鐵氰化鉀試液含酚羥基化合物噴霧或浸漬紅褐色或棕紅色4．顯色劑顯色劑適用范圍顯色方法斑點顏色濃硫酸乙醇溶液多數(shù)有95．顯色裝置噴霧瓶浸漬槽蒸氣熏蒸----雙槽展開缸

5．顯色裝置噴霧瓶浸漬槽蒸氣熏蒸----雙槽展開缸106．檢視裝置紫外分析儀(三用)攝像設(shè)備薄層色譜掃描儀(CS9301型）6．檢視裝置紫外分析儀(三用)攝像設(shè)備薄層色譜掃描儀(CS11四、操作技術(shù)1．薄層板制備自制薄層板

市售薄層板無黏合劑分類含黏合劑10%～15%煅石膏0.2%～0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液

操作方法普通薄層板(玻璃、聚酰胺薄膜和鋁基)高效薄層板（固定相粒徑為5~7）分類操作方法臨用前一般應(yīng)在110℃活化30分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板和聚酰胺薄膜可根據(jù)需要剪裁四、操作技術(shù)1．薄層板制備自制薄層板市售薄層板無黏合劑分12操作方法將1份固定相和3份水（或羧甲基纖維素鈉水溶液）在研缽中沿同一方向研磨混勻，去除表面的氣泡后，置玻璃板上使涂布均勻，或倒入涂布器（見圖8-14）中，在玻板上平穩(wěn)地移動涂布器進(jìn)行涂布(涂層厚度為0.2mm～0.3mm)，取涂好的薄層板，置水平臺上于室溫下晾干后，在110℃活化30分鐘，立即置于有干燥劑的干燥器中備用。手動涂布器

操作方法將1份固定相和3份水（或羧甲基纖維素鈉水溶液）在研缽132．點樣

普通板點樣基線----距底邊2.0cm

圓點狀----

R≤3mm條帶狀-----寬度5～10mm

點或條帶間距----＜8mm

點樣量----＜10高效板點樣基線----距底邊0.8~1cm

圓點狀----

R≤2mm條帶狀-----寬度4～8mm

點或條帶間距----＜5mm

點樣量----＜52．點樣普通板高效板143.展開（1）展開要求

查閱A.何為邊緣效應(yīng)?何因？如何防止?B.展開劑加入量?展開劑展開距離？（2）展開方式上行近水平雙向多次3.展開（1）展開要求查閱A.何為邊緣效應(yīng)?15上行展開近水平展開上行展開近水平展開164．檢視有色物質(zhì)斑點----目光檢視無色物質(zhì)斑點熒光檢出法化學(xué)檢出法

五、檢測技術(shù)1．系統(tǒng)適用性試驗檢測靈敏度比移值

分離效能

4．檢視有色物質(zhì)斑點----目光檢視無色物質(zhì)斑點熒光檢出法172．鑒別等濃度對照法----同板---大致同位、同大、同色澤等體積混合法----斑點單一、緊密結(jié)構(gòu)相似對比法-----Rf不同或兩斑點3．雜質(zhì)檢查

雜質(zhì)對照品法

樣品溶液的自身稀釋對照法

二者合用法2．鑒別等濃度對照法----同板---大致同位、同大、同色澤184．定量方法（1）目視比色法-----半定量法（精度±10%）（2）斑點洗脫法（3）薄層掃描法(正在減小使用)

4．定量方法（1）目視比色法-----半定量法（精度±1019第4節(jié)紙色譜分離技術(shù)一、分離原理(液-液萃取)利用樣品中不同組分在兩相溶劑中溶解性（或分配系數(shù)）不同，當(dāng)流動相攜帶樣品流經(jīng)固定相（被吸附或固定在惰性材料上的液體）時，各組分在兩相間不斷進(jìn)行溶解、萃取、再溶解、再萃取，……，樣品經(jīng)過多次反復(fù)分配后，造成分配系數(shù)稍有差異的組分移行的距離不同面實現(xiàn)分離.二、儀器與材料

1．色譜濾紙想一想:色譜濾紙如何選擇?第4節(jié)紙色譜分離技術(shù)一、分離原理(液-液萃取)二、儀器202．展開劑（1）紙色譜一般固定相是什么?（2）紙色譜展開劑如何選擇?3．展開容器圓形或長方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃蓋且能密閉下行紙色譜展開缸2．展開劑（1）紙色譜一般固定相是什么?（2）紙色譜展開劑如21三、操作技術(shù)1．色譜濾紙的準(zhǔn)備（1）用于下行法的色譜濾紙（2）用于上行法的色譜濾紙2．點樣樣品溶解于適宜的溶劑中制成一定濃度的溶液。用定量毛細(xì)管或微量注射器吸取溶液，點于點樣基線上，溶液宜分次點加，每次點加后，俟其自然干燥、低溫烘干或經(jīng)溫?zé)釟饬鞔蹈?，點樣直徑為2mm～4mm，點樣量取決于色譜濾紙的薄厚程度和顯色劑的靈敏度，一般幾到幾十微克。點間距離約為1.5cm～2.0cm，樣點通常為圓形，也可點成條形。三、操作技術(shù)1．色譜濾紙的準(zhǔn)備（1）用于下行法的色譜濾紙（223．展開紙色譜下行展開紙色譜上行展開3．展開紙色譜下行展開紙色譜上行展開234．斑點定位紙色譜法斑點的定位基本和薄層色譜法相似，但紙色譜法不能使用腐蝕性顯色劑，也不能在高溫下顯色。運用紙色譜進(jìn)行藥物的鑒別、檢查和含量測定的方法、要求與薄層色譜法一致4．斑點定位紙色譜法斑點的定位基本和薄層色譜法相似，但紙色譜24第5節(jié)應(yīng)用案例一、柱色譜法的應(yīng)用案例

案例8-1黃芪含量測定中樣品溶液的制備1．黃芪中主要活性成分是什么?如何提取和純化?2.提取液用氨試液洗滌的目的是什么?3.D101水洗和40%乙醇液洗脫液為何棄去?二、薄層色譜法應(yīng)用案例案例8-2六味地黃丸中牡丹皮的鑒別1.牡丹皮的鑒別指標(biāo)是什么?鑒別原理是什么?2.為何選擇環(huán)己烷-乙酸乙酯（3:1）為展開劑?顯色方式是什么?第5節(jié)應(yīng)用案例一、柱色譜法的應(yīng)用案例案例8-1黃芪含253．鑒別結(jié)果六味地黃丸薄層色譜圖（1.丹皮酚；2~5.六味地黃丸）3．鑒別結(jié)果六味地黃丸薄層色譜圖（1.丹皮酚；2~5.六味26案例8-3甲苯咪唑中有關(guān)物質(zhì)檢查

1.TLC法檢查雜質(zhì)常用有哪些方法?2.檢查中為何采用硅膠GF254?3.甲苯咪唑中有關(guān)物質(zhì)的限度是多少？案例8-3甲苯咪唑中有關(guān)物質(zhì)檢查1.TLC法檢查雜質(zhì)常27第3節(jié)薄層色譜分離檢測技術(shù)一、分離原理

薄層色譜是一種開放性色譜，是將混合組分樣品溶液點在薄層板一端的起始線上，點樣處稱為原點，在密閉容器中用適宜的流動相（薄層色譜法中又稱為展開劑）展開。因吸附劑對不同組分的吸附能力不同，展開劑對不同組分的解吸能力也不完全相同，造成各組分在薄層析上移動的速度有快有慢，經(jīng)過一段時間展開后，不同的組分彼此分開，最終形成相互分離的斑點

薄層色譜法(thinlayerchromatography，TLC)

將固定相均勻平鋪在光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法可分為吸附、分配、分子排阻色譜法等第3節(jié)薄層色譜分離檢測技術(shù)一、分離原理薄層色譜法(thi28二、薄層色譜參數(shù)1．比移值(1）定義

組分遷移的距離與展開劑遷移的距離之比(2)計算方法二、薄層色譜參數(shù)1．比移值(2)計算方法292．相對比移值(1）定義

指被測組分的比移值與參照組分的比移值之比(2）計算方法(3）特點消除系統(tǒng)誤差，值的重復(fù)性和可靠性都比好2．相對比移值(1）定義(2）計算方法(3）特點303．分離度（1)定義衡量薄層色譜分離效果的重要指標(biāo)，是指相鄰兩斑點中心至原點的距離之差與兩斑點平均徑向?qū)挾龋◤较驅(qū)挾仁侵赴唿c沿著展開方向的寬度）的比值

(2）計算方法3．分離度（1)定義(2）計算方法31三、儀器與材料1．吸附劑粒徑5~40硅膠聚酰胺微晶纖維素氧化鋁硅藻土常用硅膠H硅膠G硅膠GF254硅膠HF254

想一想

H、G、F各代表何種意思？試解釋硅膠HF365？三、儀器與材料1．吸附劑粒徑5~40硅膠聚酰胺微322．載板玻璃板塑料膜金屬箔厚度2mm規(guī)格5cm×20cm10cm×10cm10cm×15cm10cm×20cm

種類要求

表面光滑、平整清潔玻板處理措施清潔劑或鉻酸洗液浸泡洗滌，用清水充分清洗，再用蒸餾水或去離子水沖洗，表面應(yīng)不附水珠，晾干備用2．載板玻璃板塑料膜金屬箔厚度2mm規(guī)格5cm×20333．點樣器手動全自動點樣儀定量毛細(xì)管

平口微量注射器

3．點樣器手動全自動點樣儀定量毛細(xì)管平口微量注射器343．展開容器平底色譜專用展開缸雙槽薄層色譜專用展開缸3．展開容器平底色譜專用展開缸雙槽薄層色譜專用展開缸354．顯色劑顯色劑適用范圍顯色方法斑點顏色濃硫酸乙醇溶液多數(shù)有機(jī)化合物噴霧加熱多數(shù)加熱后呈黑色碘多數(shù)有機(jī)化合物薰蒸多數(shù)顯黃棕色磷鉬酸乙醇溶液醛等還原性物質(zhì)噴霧烘干藍(lán)色茚三酮試液氨基酸類噴霧或浸漬紫色或黃色三氯化鐵-鐵氰化鉀試液含酚羥基化合物噴霧或浸漬紅褐色或棕紅色4．顯色劑顯色劑適用范圍顯色方法斑點顏色濃硫酸乙醇溶液多數(shù)有365．顯色裝置噴霧瓶浸漬槽蒸氣熏蒸----雙槽展開缸

5．顯色裝置噴霧瓶浸漬槽蒸氣熏蒸----雙槽展開缸376．檢視裝置紫外分析儀(三用)攝像設(shè)備薄層色譜掃描儀(CS9301型）6．檢視裝置紫外分析儀(三用)攝像設(shè)備薄層色譜掃描儀(CS38四、操作技術(shù)1．薄層板制備自制薄層板

市售薄層板無黏合劑分類含黏合劑10%～15%煅石膏0.2%～0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液

操作方法普通薄層板(玻璃、聚酰胺薄膜和鋁基)高效薄層板（固定相粒徑為5~7）分類操作方法臨用前一般應(yīng)在110℃活化30分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板和聚酰胺薄膜可根據(jù)需要剪裁四、操作技術(shù)1．薄層板制備自制薄層板市售薄層板無黏合劑分39操作方法將1份固定相和3份水（或羧甲基纖維素鈉水溶液）在研缽中沿同一方向研磨混勻，去除表面的氣泡后，置玻璃板上使涂布均勻，或倒入涂布器（見圖8-14）中，在玻板上平穩(wěn)地移動涂布器進(jìn)行涂布(涂層厚度為0.2mm～0.3mm)，取涂好的薄層板，置水平臺上于室溫下晾干后，在110℃活化30分鐘，立即置于有干燥劑的干燥器中備用。手動涂布器

操作方法將1份固定相和3份水（或羧甲基纖維素鈉水溶液）在研缽402．點樣

普通板點樣基線----距底邊2.0cm

圓點狀----

R≤3mm條帶狀-----寬度5～10mm

點或條帶間距----＜8mm

點樣量----＜10高效板點樣基線----距底邊0.8~1cm

圓點狀----

R≤2mm條帶狀-----寬度4～8mm

點或條帶間距----＜5mm

點樣量----＜52．點樣普通板高效板413.展開（1）展開要求

查閱A.何為邊緣效應(yīng)?何因？如何防止?B.展開劑加入量?展開劑展開距離？（2）展開方式上行近水平雙向多次3.展開（1）展開要求查閱A.何為邊緣效應(yīng)?42上行展開近水平展開上行展開近水平展開434．檢視有色物質(zhì)斑點----目光檢視無色物質(zhì)斑點熒光檢出法化學(xué)檢出法

五、檢測技術(shù)1．系統(tǒng)適用性試驗檢測靈敏度比移值

分離效能

4．檢視有色物質(zhì)斑點----目光檢視無色物質(zhì)斑點熒光檢出法442．鑒別等濃度對照法----同板---大致同位、同大、同色澤等體積混合法----斑點單一、緊密結(jié)構(gòu)相似對比法-----Rf不同或兩斑點3．雜質(zhì)檢查

雜質(zhì)對照品法

樣品溶液的自身稀釋對照法

二者合用法2．鑒別等濃度對照法----同板---大致同位、同大、同色澤454．定量方法（1）目視比色法-----半定量法（精度±10%）（2）斑點洗脫法（3）薄層掃描法(正在減小使用)

4．定量方法（1）目視比色法-----半定量法（精度±1046第4節(jié)紙色譜分離技術(shù)一、分離原理(液-液萃取)利用樣品中不同組分在兩相溶劑中溶解性（或分配系數(shù)）不同，當(dāng)流動相攜帶樣品流經(jīng)固定相（被吸附或固定在惰性材料上的液體）時，各組分在兩相間不斷進(jìn)行溶解、萃取、再溶解、再萃取，……，樣品經(jīng)過多次反復(fù)分配后，造成分配系數(shù)稍有差異的組分移行的距離不同面實現(xiàn)分離.二、儀器與材料

1．色譜濾紙想一想:色譜濾紙如何選擇?第4節(jié)紙色譜分離技術(shù)一、分離原理(液-液萃取)二、儀器472．展開劑（1）紙色譜一般固定相是什么?（2）紙色譜展開劑如何選擇?3．展開容器圓形或長方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃蓋且能密閉下行紙色譜展開缸2．展開劑（1）紙色譜一般固定相是什么?（2）紙色譜展開劑如48三、操作技術(shù)1．色譜濾紙的準(zhǔn)備（1）用于下行法的色譜濾紙（2）用于上行法的色譜濾紙2．點樣樣品溶解于適宜的溶劑中制成一定濃度的溶液。用定量毛細(xì)管或微量注射器吸取溶液，點于點樣基