第十四章基因重組與基因工程 課件

第十四章

基因重組和基因工程授課教師 鄭志竑第十四章

基因重組和基因工程授課教師 鄭志竑1第一節(jié)DNA的重組

DNARecombination第一節(jié)DNA的重組

DNARecombination2一、同源重組

發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。一、同源重組 發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(hom3第十四章基因重組與基因工程課件4第十四章基因重組與基因工程課件5二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用(conjugation)：當(dāng)細(xì)胞或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞(細(xì)菌)轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）,這種類型的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用(conjugatio6

質(zhì)粒：細(xì)菌染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子。 質(zhì)粒：細(xì)菌染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子。7可接合質(zhì)粒，如F因子(Ffactor)可接合質(zhì)粒，如F因子(Ffactor)8（二）轉(zhuǎn)化作用(transformation)：通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。（二）轉(zhuǎn)化作用(transformation)：通過自動獲取9（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)：當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（受體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)：當(dāng)病毒從被感染的10第十四章基因重組與基因工程課件11第二節(jié)重組DNA技術(shù)第二節(jié)重組DNA技術(shù)12一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克?。ㄒ卜Q基因克隆或重組DNA）

應(yīng)用酶學(xué)的方法,在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)DNA與載體DNA接合成具有自我復(fù)制能力的DNA分子，再通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子。一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克隆（也稱基因克隆或重13第十四章基因重組與基因工程課件14生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等基因工程----實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程,又稱重組DNA工藝學(xué)。

目的

：1、分離獲得某一感興趣的基因或DNA序列 2、獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、基因工程----實現(xiàn)15（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶I逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶16

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)：識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ 限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuc17Ⅱ類酶識別序列特點—回文結(jié)構(gòu)Ⅱ類酶識別序列特點—回文結(jié)構(gòu)18BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTCG19（三）目的基因（又稱外源DNA）cDNA：經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA（mRNA或病毒RNA）互補(bǔ)的單鏈DNA?；蚪MDNA：在真核生物體，基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）和線粒體DNA的全部序列。（三）目的基因（又稱外源DNA）20（四）基因載體（克隆載體）：為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

常用載體：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA（四）基因載體（克隆載體）：為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或21

克隆載體(cloningvector)：為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體。

表達(dá)載體(expressionvector)：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體。 克隆載體(cloningvector)：為使插入的外源D22第十四章基因重組與基因工程課件23二、重組DNA技術(shù)基本原理及步驟1、目的基因的獲取2、基因載體的選擇與構(gòu)建3、目的基因與載體的拼接4、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞5、篩選并無性繁殖含重組分子 的受體分子（轉(zhuǎn)化子）二、重組DNA技術(shù)基本原理及步驟1、目的基因的獲取24（一）目的基因的獲取1、化學(xué)合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2、基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)

（一）目的基因的獲取1、化學(xué)合成法25組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫：存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分26第十四章基因重組與基因工程課件27第十四章基因重組與基因工程課件28

3、cDNA文庫：以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得cDNA文庫（cDNAlibrary）。 3、cDNA文庫：以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mR29組織或培養(yǎng)細(xì)胞載體mRNAcDNAcDNA與載體連接導(dǎo)入大腸桿菌鑒定cDNA文庫的克隆數(shù)與特征組織或培養(yǎng)細(xì)胞載體mRNAcDNAcDNA與載體連接導(dǎo)入大30（二）克隆載體的選擇

常用載體：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA（二）克隆載體的選擇31載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：32（三）外源基因與載體的連接（三）外源基因與載體的連接331、粘性末端連接：同一限制酶切割位點連接配伍末端連接1、粘性末端連接：34第十四章基因重組與基因工程課件352、平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端3、同聚物加尾連接

由末端轉(zhuǎn)移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。2、平端連接36第十四章基因重組與基因工程課件374、人工接頭：由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。4、人工接頭：38第十四章基因重組與基因工程課件39（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌：

受體菌條件:安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌：40導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)41（五）重組體的篩選1、直接選擇： 抗藥性標(biāo)記選擇插入失活法標(biāo)志補(bǔ)救分子雜交法： 原位雜交、Southern印跡（五）重組體的篩選1、直接選擇：42第十四章基因重組與基因工程課件43原位雜交原位雜交442、非直接選擇法：免疫學(xué)方法：如免疫化學(xué)方法 酶免檢測法重組DNA技術(shù)簡單概括為：

“分、切、接、轉(zhuǎn)、篩”2、非直接選擇法：45第三節(jié)

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系第三節(jié)

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系46（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克?。ǘ┥镏扑帲ㄈ┗蛟\斷（四）基因治療（五）遺傳病的預(yù)防（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆47小結(jié)自然界基因轉(zhuǎn)移伴發(fā)重組的形式有多種。細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移包括接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用等，在這些過程中不同DNA分子間發(fā)生的共價連接即為重組。小結(jié)自然界基因轉(zhuǎn)移伴發(fā)重組的形式有多種。48重組DNA（基因克?。┘夹g(shù)是應(yīng)用酶學(xué)的方法,在體外將目的基因與載體DNA接合成復(fù)制子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子。重組DNA技術(shù)的基本過程可概括為“分、切、接、轉(zhuǎn)、篩”。重組DNA（基因克?。┘夹g(shù)是應(yīng)用酶學(xué)的49演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！50第十四章

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基因重組和基因工程授課教師 鄭志竑51第一節(jié)DNA的重組

DNARecombination第一節(jié)DNA的重組

DNARecombination52一、同源重組

發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。一、同源重組 發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(hom53第十四章基因重組與基因工程課件54第十四章基因重組與基因工程課件55二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用(conjugation)：當(dāng)細(xì)胞或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞(細(xì)菌)轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）,這種類型的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用(conjugatio56

質(zhì)粒：細(xì)菌染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子。 質(zhì)粒：細(xì)菌染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA分子。57可接合質(zhì)粒，如F因子(Ffactor)可接合質(zhì)粒，如F因子(Ffactor)58（二）轉(zhuǎn)化作用(transformation)：通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。（二）轉(zhuǎn)化作用(transformation)：通過自動獲取59（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)：當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（受體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)：當(dāng)病毒從被感染的60第十四章基因重組與基因工程課件61第二節(jié)重組DNA技術(shù)第二節(jié)重組DNA技術(shù)62一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克?。ㄒ卜Q基因克隆或重組DNA）

應(yīng)用酶學(xué)的方法,在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)DNA與載體DNA接合成具有自我復(fù)制能力的DNA分子，再通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子。一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克?。ㄒ卜Q基因克隆或重63第十四章基因重組與基因工程課件64生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等基因工程----實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程,又稱重組DNA工藝學(xué)。

目的

：1、分離獲得某一感興趣的基因或DNA序列 2、獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、基因工程----實現(xiàn)65（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶I逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶（二）工具酶66

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)：識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ 限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuc67Ⅱ類酶識別序列特點—回文結(jié)構(gòu)Ⅱ類酶識別序列特點—回文結(jié)構(gòu)68BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠGTCGGATCC+GGATCCHindⅡGTCG69（三）目的基因（又稱外源DNA）cDNA：經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA（mRNA或病毒RNA）互補(bǔ)的單鏈DNA。基因組DNA：在真核生物體，基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）和線粒體DNA的全部序列。（三）目的基因（又稱外源DNA）70（四）基因載體（克隆載體）：為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

常用載體：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA（四）基因載體（克隆載體）：為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或71

克隆載體(cloningvector)：為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體。

表達(dá)載體(expressionvector)：為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體。 克隆載體(cloningvector)：為使插入的外源D72第十四章基因重組與基因工程課件73二、重組DNA技術(shù)基本原理及步驟1、目的基因的獲取2、基因載體的選擇與構(gòu)建3、目的基因與載體的拼接4、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞5、篩選并無性繁殖含重組分子 的受體分子（轉(zhuǎn)化子）二、重組DNA技術(shù)基本原理及步驟1、目的基因的獲取74（一）目的基因的獲取1、化學(xué)合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2、基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)

（一）目的基因的獲取1、化學(xué)合成法75組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫：存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分76第十四章基因重組與基因工程課件77第十四章基因重組與基因工程課件78

3、cDNA文庫：以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得cDNA文庫（cDNAlibrary）。 3、cDNA文庫：以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mR79組織或培養(yǎng)細(xì)胞載體mRNAcDNAcDNA與載體連接導(dǎo)入大腸桿菌鑒定cDNA文庫的克隆數(shù)與特征組織或培養(yǎng)細(xì)胞載體mRNAcDNAcDNA與載體連接導(dǎo)入大80（二）克隆載體的選擇

常用載體：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA（二）克隆載體的選擇81載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：82（三）外源基因與載體的連接（三）外源基因與載體的連接831、粘性末端連接：同一限制酶切割位點連接配伍末端連接1、粘性末端連接：84第十四章基因重組與基因工程課件852、平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端3、同聚物加尾連接

由末端轉(zhuǎn)移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。2、平端連接86第十四章基因重組與基因工程課件874、人工接頭：由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。4、人工接頭：88第十四章基因重組與基因工程課件89（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌：

受體菌條件:安全宿主菌限制酶和重組酶缺