獸用疫苗生產與檢驗技術

關于獸用疫苗生產與檢驗技術第一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

獸用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（細菌、病毒、衣原體、鉤端螺旋體等）及其代謝產物、寄生蟲、動物血液或組織等為原材料，采用生物學、分子生物學或生物化學等相應技術制成的生物制劑，用于預防、治療或診斷畜禽疫病。

1、按照性質和制造方法疫（菌）苗、類毒素、抗血清、診斷制劑和微生態(tài)制劑等。

2、按照作用與用途預防、診斷和治療用生物制品。

一、獸用生物制品分類第二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

將細菌、病毒、寄生蟲等接種于特殊基質進行培養(yǎng)，收獲其抗原單位或亞單位，或用人工合成的抗原單位或亞單位制備而成的活的或滅活的、具有特異性和免疫原性的生物制品，用于預防靶動物的疾病。預防用獸用生物制品包括：滅活疫苗、活疫苗、重組亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重組活載體疫苗和核酸（DNA）疫苗。

（一）預防用獸用生物制品第三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1)強毒(菌)或弱毒（菌）→培養(yǎng)→滅活或加熱→純化或濃縮→佐劑或防腐劑。

2)滅活的毒素或提取的亞單位或rDNA產生亞單位。

滅活疫苗穩(wěn)定、安全，便于運輸和保存，易于提純純化和制備多價、多聯(lián)苗。但用量較大、接種次數(shù)多、免疫力產生慢、注射困難、注射局部可能有反應等。

1、滅活疫苗(死疫苗)

第四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）致弱的弱毒（菌、蟲）株動物、組織、細胞、雞胚或培養(yǎng)基→培養(yǎng)→降低毒力、保留免疫原性→篩選。

2）自然弱（無）毒（菌、蟲）株。

3）異種毒（菌、蟲）株。

4）基因工程改造弱毒株?；钜呙鐚υ拗鲃游餆o致病性或引起亞臨床感染，能產生主動免疫力，用量少、成本低、免疫力產生快、免疫期長。但可能存在不安全風險。2、活疫苗(弱毒疫苗)第五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

1）微生物→物理和化學方法→提取有效抗原成分。

2）病原→基因工程技術→保護性抗原基因序列插入合適的表達質?！咝Х€(wěn)定表達→生產抗原→亞單位疫苗。3、重組亞單位疫苗第六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日用化學方法人工合成多肽作為抗原。純度高、穩(wěn)定，但只能線性表達，不能折疊，免疫原性較差。4、合成肽疫苗第七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

病原體→基因工程方法→缺失致病性基因或非必要糖蛋白→保持免疫原性→降低致病性。疫苗毒力不易恢復，穩(wěn)定性好，可配合鑒別診斷方法，區(qū)別免疫動物和自然感染動物。5、基因缺失疫苗第八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日病原保護性抗原基因序列→插入另一種無毒或弱毒的微生物基因組→表達→構建重組活載體疫苗株?？梢酝瑫r表達多種抗原，制成多價或多聯(lián)疫苗，毒力不返強。6、重組活載體疫苗第九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

病原保護性抗原基因→連接細菌或病毒DNA→直接導入動物體→表達抗原→誘導產生免疫保護。制造簡便、成本低、安全、免疫期長、熱穩(wěn)定性好，但仍未商品化生產。

7、核酸疫苗（基因或DNA疫苗）第十頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1、常規(guī)免疫—血清學診斷技術（1）凝集試驗抗原：直接凝集試驗（平板法、試管法）：抗原和抗體混合后直接發(fā)生凝集反應。間接凝集試驗（間接血凝、膠乳凝集和反相間接血凝試驗）。

（二）診斷用制品第十一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（2）免疫沉淀試驗抗原：包括試管沉淀法、單相免疫擴散試驗和雙相免疫擴散試驗、免疫電泳、對流免疫電泳等。（3）中和試驗：將特異性血清與相應病原混合，用血清—病毒混合物接種靶動物、雞胚或細胞培養(yǎng)，觀察感染情況進行疾病診斷。（4）補體結合試驗抗原：抗原抗體復合物可以激活補體，出現(xiàn)各種生物學反應。1、常規(guī)免疫—血清學診斷技術第十二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：包括直接法、間接法、雙抗體夾心、競爭ELISA等。（6）熒光抗體染色技術：直接法、間接法、競爭法等。（7）膠體金免疫檢測技術。（8）免疫組化診斷試劑。1、常規(guī)免疫—血清學診斷技術第十三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（1）生物技術：單克隆抗體技術（熒光抗體染色技術或酶聯(lián)免疫染色技術）。（2）分子生物學技術。PCR（RT－PCR）擴增技術。熒光定量PCR（RT－PCR）?；诤怂嵝蛄袛U增技術（NASBA）。核酸探針。2、生物技術和分子生物學診斷技術第十四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1、抗血清：用抗原多次免疫動物，提取血清制成，用于治療或預防動物疾病。2、微生態(tài)制劑：含活菌的制劑，具有調節(jié)機體菌群、增強免疫力、促生長等。3、卵黃抗體：用抗原多次免疫禽類，提取卵黃抗體制成，用于治療或預防動物疾病。4、干擾素：用病毒等誘導產生干擾素。5、轉移因子：用動物臟器或組織提取制成，作為非特異性免疫調節(jié)劑，增強機體免疫力，提高生產性能。（三）治療及其他制品第十五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（一）獸用滅活疫苗的制備技術滅活疫苗是用菌（毒）種培養(yǎng)物或含毒組織或細胞培養(yǎng)物，經化學滅活劑滅活或加熱處理，使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入適當?shù)姆栏瘎┗蚣尤朊庖咦魟┲瞥伞?/p>

二、獸用疫苗制備技術第十六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1.1、菌（毒）種標準歷史清楚；生物學性狀明顯；遺傳穩(wěn)定；優(yōu)良的免疫原性與反應原性；毒力在規(guī)定的范圍內。1、菌（毒）種第十七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日原種細菌原種應規(guī)定其培養(yǎng)特性、生化特性、血清學特性、毒力和免疫原性等，并作純粹檢查。病毒原種應規(guī)定其生物學特性、理化特性、血清學特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并純粹?；A種子基礎種子由原種制備而來，基礎種子為企業(yè)生產獸用生物制品提供種子來源，應作系統(tǒng)鑒定，并規(guī)定代次。生產種子生產種子由生產企業(yè)用基礎種子進行復壯、繁殖。細菌等生產種子應作純粹檢查。病毒生產種子應作含量測定和純凈檢查。1.1、菌（毒）種標準第十八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日菌種的選育分離病原→純粹檢驗→致病性鑒定和抗原性測定→設計制成滅活疫苗→接種實驗室動物→攻毒→用本動物進行保護率測定→以確定疫苗候選株。毒種的選育弱毒毒種有天然弱毒株或人工致弱毒株；強毒毒株分離→系統(tǒng)鑒定（無污染、毒力強而穩(wěn)定、免疫原性好、抗原譜廣、與流行毒血清型相符）→疫苗候選株。1.2、菌（毒）種選育第十九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日冷凍真空干燥法凍干的菌種一般在2—8C保存；凍干的毒種一般在-20C以下保存，溫度越低保存期越長。結凍保存有些病毒可用含毒組織在低溫條件下（-20C以下）。液氮保存有些細胞結合毒須在－196C的液氮中保存。動物繼代保存蟲種一般通過動物繼代保存。1.3、菌（毒）種保存第二十頁，共一百一十頁，2022年，8月28日生產檢驗用菌（毒）種實行分級管理制度，種子分三級（原種、基礎種子和生產種子）。原種和由國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心或分中心負責保管；基礎種子由菌種中心或分中心負責制備、鑒定、保管和供應；生產種子由生產企業(yè)自行制備、鑒定和保管。1.4、菌（毒）種的管理第二十一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日供應：菌種中心及分中心統(tǒng)一供應。索?。喉毘钟邢鄳墑e機構出具的正式公函，說明菌種名稱、型別、數(shù)量及用途。一、二類菌種時，必須由?。ㄊ?、自治區(qū)）獸醫(yī)行政主管部門審核，農業(yè)部批準后，方可供應。有產品批準文號者，可由生產企業(yè)直接向菌種中心或分中心領取。要求：其他任何單位不得轉發(fā)生產用菌（毒）種。烈性傳染病或人畜共患傳染病的強毒菌（毒）種，必須有專職技術人員領取。1.5、菌（毒）種索取與分發(fā)

第二十二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1.2.1細菌培養(yǎng)技術細菌的繁殖是以二分裂法進行，分四個時期：遲緩期（細菌處于靜止適應狀態(tài)）；對數(shù)增殖期（以恒定的速度增殖）；穩(wěn)定期（細菌增加數(shù)與死亡數(shù)保存平衡）；衰退期（活菌數(shù)下降）。1.2、病原培養(yǎng)第二十三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

需氧菌的培養(yǎng)平板培養(yǎng)法有平板劃線培養(yǎng)法和傾注培養(yǎng)法。需氧芽孢菌的培養(yǎng)將接種材料先接種于液體培養(yǎng)基中，置水浴加入至80C，維持15－20分鐘，以殺死非芽孢菌，然后在37C作增菌培養(yǎng)。抑菌分離培養(yǎng)利用某些化學藥品對某類細菌的抑制或殺滅作用，而對另一些細菌不生產明顯的作用，來分離培養(yǎng)某些細菌。接種試驗動物進行培養(yǎng)。、細菌培養(yǎng)技術

第二十四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日厭氧菌的培養(yǎng)生物學方法在培養(yǎng)基中加入植物或動物組織（如馬鈴薯、發(fā)芽谷物、滅菌的新鮮動物組織塊），以消耗養(yǎng)氣或使氧化還原電勢下降。用這些培養(yǎng)基培養(yǎng)厭氧菌時，先將培養(yǎng)基煮沸15－30分鐘，降溫后在培養(yǎng)基表面加一層滅菌的液體石蠟，然后接種培養(yǎng)。、細菌培養(yǎng)技術第二十五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日化學方法利用還原作用強的化學物質，吸收環(huán)境或培養(yǎng)基內的養(yǎng)氣或還原氧化型物質，降低氧化還原電勢。物理學方法利用加熱、密封、抽氣等物理學方法，以驅除或隔絕培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基中的養(yǎng)氣，形成無氧狀態(tài)，以利于厭氧菌的生長。常用的有厭氧罐法。厭氧菌的培養(yǎng)第二十六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日有些細菌特別是初次分離培養(yǎng)，在含有5％－10％CO2環(huán)境下生長良好，培養(yǎng)時，可直接利用二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照需要調節(jié)培養(yǎng)箱內二氧化碳的濃度。在沒有條件的實驗室，簡便的做法是用有蓋玻璃容器，放入接種的培養(yǎng)物后，點燃蠟燭，加蓋密閉容器，由于燃燒耗氧產生二氧化碳，蠟燭即熄滅。此時容器內含有較高濃度的二氧化碳，將容器放入適宜溫度培養(yǎng)。含二氧化碳條件下的細菌培養(yǎng)第二十七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日病毒是嚴格的細胞內寄生物，由于病毒缺乏自主復制的酶系統(tǒng)，不能獨自進行物質代謝，必須依賴宿主細胞或細胞的某些成分合成核酸和蛋白質，所以只能在易感的細胞內以復制的方式進行增殖，而不能在任何無細胞的培養(yǎng)液內生長。除少數(shù)病毒外，大多數(shù)動物病毒能在試驗動物、受精卵和細胞培養(yǎng)中增殖。、病毒培養(yǎng)基本技術第二十八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日病毒細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求1）無機離子維持滲透壓、提供細胞酶與代謝活動所需要的物質，促進細胞貼壁等。常用弱碳酸氫鹽來調節(jié)培養(yǎng)液的pH值，培養(yǎng)液的pH值一般維持在。2)碳水化合物常用的碳水化合物是葡萄糖。有些復雜的培養(yǎng)基，還需添加其它糖類或簡單的化合物如乳酸、丙酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。3)氨基酸細胞培養(yǎng)所用的氨基酸為左旋異構體。維持細胞生長的最低營養(yǎng)要求需要以下13種氨基酸。、病毒培養(yǎng)基本技術第二十九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日4)維生素大部分維生素與細胞代謝有關。使用較多的維生素主要是B族維生素，復雜的培養(yǎng)液中還含有還原劑、谷胱甘肽、抗壞血酸及L－半胱氨酸。在不含血清的培養(yǎng)液中，常含有脂溶性維生素。5)蛋白質動物血清是蛋白質的主要來源，常用的有胎牛血清或犢牛血清。血清起營養(yǎng)作用，保護細胞或去毒，抑制蛋白溶解酶，促進細胞在玻璃上附著和鋪開。6）抗生素控制細胞培養(yǎng)中細菌的污染，常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、制霉菌素或兩性霉素B。病毒細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求第三十頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

細胞培養(yǎng)類型（1）原代細胞原代細胞是用動物新鮮組織如胚胎或幼畜的組織或受精卵，經胰蛋白酶消化分散后制備而成。病毒對原代細胞易感，繁殖滴度高，且無致瘤性等。但原代細胞不能在體外多次傳代，組織原材料的來源不固定，易混入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其質量，影響產品的純凈和安全性。

細胞培養(yǎng)技術

第三十一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日2）二倍體細胞株原代細胞→次代細胞→多次連續(xù)傳代成為二倍體細胞。二倍體細胞的細胞形態(tài)學可能發(fā)生變化，但細胞染色體數(shù)與原代細胞一樣。不能在體外無限制傳代，從幾代至幾十代，兼有原代細胞和傳代細胞的優(yōu)點，病毒對其易感，質量可控，適用于繁殖病毒。3）傳代細胞系由腫瘤組織培養(yǎng)而成或由細胞株轉化而來?？稍隗w外無限制的傳代，其染色體數(shù)不正常，成為異倍體。適宜于許多動物病毒的生長，易于培養(yǎng)，可以建立種子庫，質量易控制。但存在潛在的致瘤性，要求背景情況應詳細，并作系統(tǒng)鑒定合格后，方可用于繁殖病毒生產滅活疫苗。細胞培養(yǎng)類型第三十二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日各種傳代水平細胞系檢查檢驗項目主細胞庫工作細胞庫最高限制代次細胞高于最高代次10代的細胞顯微鏡檢查＋＋＋－細菌和霉菌＋＋＋－支原體＋＋＋－病毒＋＋＋－細胞鑒別＋－＋＋胞核學檢查＋－＋＋致瘤和致癌性＋－＋＋第三十三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1)細胞保存收集新鮮細胞，用細胞冷凍保護液(含20％犢牛血清、5％～10％二甲基亞砜的營養(yǎng)液)調整細胞濃度達100萬一200萬個細胞／m1，分裝于安瓿中，封口，4℃預冷30min，封口嚴密的安瓿移至-50～－70C冰箱中預冷，然后移至液氮罐內貯存，可保存數(shù)年。2)細胞復蘇將安瓶自液氮罐取出后立即放入37～40℃溫水中，在lmin之內使細胞融化，換液培養(yǎng)至形成細胞單層。3)細胞運輸單層細胞培養(yǎng)瓶裝滿生長液，以防液體振蕩沖脫細胞，或只留少量生長液能覆蓋單層，以防細胞干燥。細胞懸液裝于冰盒保持溫度在15～25℃左右。傳代細胞的保存第三十四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）靜止培養(yǎng)靜止培養(yǎng)是指將制備好的細胞懸液分裝在適宜的培養(yǎng)瓶中，密閉瓶口，置恒溫培養(yǎng)箱內靜止培養(yǎng)或以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，形成細胞單層后，接種病毒懸液，37－38C左右繼續(xù)培養(yǎng)。2）轉動培養(yǎng)將制備好的細胞懸液分裝在玻璃或塑料轉瓶中，密閉瓶口，置轉瓶機上，以每小時5－10轉轉動培養(yǎng)，細胞在轉動培養(yǎng)時，貼附于瓶壁四周，長成細胞單層后，接種病毒懸液，37－38C左右繼續(xù)轉動培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)方法第三十五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日3）懸浮培養(yǎng)在懸浮培養(yǎng)罐中通過不斷攪拌，并隨時補充營養(yǎng)液和校正pH值，使細胞在懸浮的條件下培養(yǎng)生長。由于懸浮培養(yǎng)細胞能及時得到充足的營養(yǎng)和養(yǎng)氣，細胞生長速度快，產量高，可以得到大量的細胞。4）微載體培養(yǎng)通過攪拌使微載體懸浮在培養(yǎng)液中，細胞通過貼附在微載體固體顆粒表面上生長形成細胞單層，細胞的濃度較大、生長快。微載體培養(yǎng)可采用通氣攪拌法，也可采用轉瓶培養(yǎng)法進行。細胞培養(yǎng)方法第三十六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日雞胚的選擇必須是來源于健康易感的種雞群，其種蛋必須新鮮，清潔。種雞群必須定期監(jiān)測，不得含有繁殖病毒的相應抗體。雞胚接種途徑和接種方法1）尿囊腔途徑取9－11日齡的雞胚，在燈光照射下，在離氣室約0.3－0.5cm處無大血管的位置作一標記，作為接種部位，在氣室和待接種部位各打一小孔，將受精卵橫放在蛋盤上，在待接種處垂直刺入針頭約0.5cm，接種0.05－0.2ml病毒溶液，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。也可將氣室向上放于蛋盤中，在氣室距邊緣約0.5cm處打一小孔。沿受精卵長徑平行方向刺入針頭約1cm，注入接種物0.05－0.2ml，用石蠟封孔，繼續(xù)孵化。1.2.3雞胚接種技術

第三十七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日2）絨毛尿囊膜途徑在氣室中心鉆一小孔，直接從氣室處刺入針頭約0.5cm，滴入0.1－0.2ml病毒溶液，繼續(xù)垂直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿囊膜，拔出針頭。也可用人工氣室法進行，在胚胎附近處和氣室處各打一小孔，然后用吸球緊貼氣室小孔處輕輕吸氣，造成負壓，形成人工氣室，接種0.1－0.2ml病毒溶液，用石蠟封孔。3）卵黃囊途徑在氣室中心鉆一小孔，垂直刺入針頭約3cm，注入接種物0.2－0.5ml，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。也可在氣室外和卵長徑的1/2處各打一小孔，并在中間孔處刺入針頭約1.5cm，接種0.1－0.5ml病毒溶液，用石蠟封孔。雞胚接種途徑和接種方法第三十八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日4）羊膜腔途徑將氣室端靠近胚胎側的卵殼鋸穿，在卵膜上滴入一滴無菌液體石蠟或生理鹽水，避開血管，在氣室處刺入針頭約0.5cm，在氣室內的卵膜上滴入0.1－0.2ml病毒溶液，繼續(xù)垂直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿囊膜，拔出針頭?；蛟谌斯馐铱滋幊?0角刺入針頭約0.5cm，接種0.1－0.2ml病毒溶液，用石蠟封孔。5）靜脈途徑畫出直而粗的靜脈處位置，卵殼，加一滴液體石蠟，使卵膜透明。用長約1.5cm的4號針頭插入血管內注射接種物。雞胚接種途徑和接種方法第三十九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日接種后一般在37C左右繼續(xù)孵化2－7天，不必翻蛋。每日照蛋1－2次，棄去接種后24小時內非特異死亡的雞胚，24小時后死亡的雞胚隨時撿出，置4－8C冷卻4－24小時。觀察期結束，所有活胚同樣冷卻處理。分別收獲收獲胚體、卵黃囊、尿囊液、絨毛尿囊膜等。收獲期間注意檢查胚胎、絨毛尿囊膜的病變情況、尿囊液是否渾濁等。接種后的檢查及病毒的收獲第四十頁，共一百一十頁，2022年，8月28日幾種病毒接種途徑及收獲材料病毒胚齡接種途徑培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間雞胚變化收獲材料雞新城疫9－11尿囊腔37℃左右3－5天出血、死亡、血凝尿囊液雞痘10－11CAM37℃左右5天膜上痘皰CAM雞傳染性喉氣管炎10－11CAM37℃左右5天膜上痘皰CAM狂犬6－7卵黃囊37℃左右8－10天卵黃囊乙腦6－8卵黃囊37℃左右3天死亡雞胚第四十一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日2.4.1動物接種途徑和接種方法1）腦內接種給小鼠和地鼠腦內接種時，用左手大拇指和食指固定頭部，消毒左側眼與耳之間上部注射部位，并于眼后角、耳前緣及顱前后中線所構成之位置中間刺入針頭2－3mm，乳鼠接種，成年鼠和地鼠為。給豚鼠和家兔進行腦內接種時，先作麻醉或人工固定，在顱前后中線旁邊5mm平行線與動物瞳孔橫線交叉處消毒，用錐刺穿顱骨，然后用針頭刺入4－10mm，接種。綿羊腦內接種時，先固定在接種臺上，剪去頭頂部的毛，并用硫化鋇脫毛，碘酊消毒后，在顱頂部中線左或右側，用錐鉆一小孔，硬腦膜下或腦內接種1ml，立即用火棉膠封閉接種孔。1.2.4動物接種技術

第四十二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日2）皮內接種常用于大動物。在背部、頸部、腹部、耳部及尾根部先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮膚，用針頭斜面向外，與皮膚面平行刺入2－3mm，接種。注射劑量較大時，可分點注射。牛、羊舌面皮內注射時，先固定動物，抓住動物舌頭并固定，然后接種。3）皮下注射豚鼠和家兔可選擇腹部及大腿內側皮膚松弛處，小鼠可選擇尾根部或背部，碘酊消毒皮膚處，用針頭水平方向挑起皮膚，刺入1.5-2cm，緩慢注入接種物0.2-1ml。動物接種途徑和接種方法第四十三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日4）靜脈接種小鼠尾靜脈注射時，先將小鼠尾巴在50－55C水中浸泡1分鐘，使尾靜脈擴張，用鼠缸扣住鼠體，露出尾部，用左手拇指和中指將鼠尾拉直，以食指托住尾部，消毒注射部位后由靠近尾尖端處平行刺入針頭，再向下刺入靜脈，慢慢注入0.1-1ml接種物。家兔耳靜脈注射時，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精棉球涂擦注射部位靜脈1分鐘，使靜脈擴張，再用左手拇指及中食指抓住耳尖部，刺入針頭緩慢注射1－5ml接種物。雞翅下肱靜脈注射時，側臥固定，張開翅膀，拔去注射部位的羽毛，碘酊消毒，用針頭斜面朝上刺入靜脈注射1－5ml接種物。動物接種途徑和接種方法第四十四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日5）腹腔接種家兔和豚鼠先在腹股溝處刺入皮下，進針少許后再刺入腹腔注射0.5-5ml。小鼠腹腔接種時，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其頭背部，翻轉鼠體使腹部向上，把鼠尾和右后腳夾于小指和無名指之間，右手將針頭平行刺入腿根處腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射0.5-1ml。動物接種途徑和接種方法第四十五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日動物接種后應每天觀察，注意動物的活動、飲食、糞便與尿液及皮毛體表等情況，還應根據(jù)接種微生物的特性及動物性別、年齡等的不同而有所側重，如體溫曲線、特征性臨床癥狀的出現(xiàn)及注射部位的特征性變化等。根據(jù)觀察結果，選出接種后符合要求的反應特征的動物，按照規(guī)定方法剖殺動物，收集含毒血液或采集含毒組織、器官等。動物接種后的觀察及含毒組織的收獲第四十六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日大量培養(yǎng)細菌的方法 （1）固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法此法是將溶化的肉湯瓊脂培養(yǎng)基，分裝于大扁瓶(大型克氏瓶)，滅菌后平放使凝固，經培養(yǎng)觀察無污染，在無菌室接入種子液，使均勻分布于表面，平放溫室靜置培養(yǎng)，然后傾去凝集水，收集菌苔制成菌懸浮液。1.3、工業(yè)化大規(guī)模繁殖病原的方法

第四十七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（2）液體靜置培養(yǎng)法此法適于一般菌苗的生產，培養(yǎng)容器可用大玻瓶也可用培養(yǎng)罐(或稱發(fā)酵罐)，按容器的深度，裝入適量培養(yǎng)基，一般是容器深度的1／2～2／3為宜，經高壓蒸汽滅菌之后，冷至室溫接入細菌種子，保持適宜溫度靜置培養(yǎng)。（3）液體深層通氣培養(yǎng)法使用培養(yǎng)罐（反應缸），帶有攪拌器和通氣系統(tǒng)，或自動控制裝置，用人工控制培養(yǎng)溫度和通氣量。培養(yǎng)基與佐劑（氫氧化鋁膠、油佐劑等）均可在缸內消毒，在缸內進行細菌的培養(yǎng)及滅活、加佐劑配苗與分裝等，可大量生產出質量較好的菌苗。大量培養(yǎng)細菌的方法第四十八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（1）單層轉瓶培養(yǎng)是在轉鼓條件下發(fā)展起來的，專用于大量生產細胞的一種設備，能自動調溫、調速和報警，靠一臺馬達驅動，轉瓶架分上、中、下幾層，每層可放一排1萬—1.5萬m1的轉瓶，轉瓶是擱置在滾軸上，以每小時9～15轉的轉速轉動。國際上普遍使用無毒塑料轉瓶，直徑為15～20cm，長度為30～80cm，多為一次性使用。工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法

第四十九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（2）培養(yǎng)罐培養(yǎng)培養(yǎng)罐罐體結構均為不銹鋼質，可以自動調溫、調pH值，用無級馬達、磁攪拌、消泡、控制氧壓、自動補液、換液、自動高壓滅菌、自動計算呼吸商等。深層懸浮培養(yǎng)法能控制一致的細胞培養(yǎng)條件，可大規(guī)模生產，細胞培養(yǎng)物可通過高速離心棄去培養(yǎng)液，使病毒更加純凈，可減少異性蛋白質的含量。工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法第五十頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（3）微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

微載體的直徑在60～250μm，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。此法兼有懸浮培養(yǎng)法和單層培養(yǎng)法的優(yōu)點，容易大量培養(yǎng)細胞，特別是適合那些不能被懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的二倍體細胞和原代細胞。工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法第五十一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（4）生物反應器反應器控制系統(tǒng)由高性能、智能化的微機控制儀及附屬功能電路和器件所組成，實現(xiàn)了空氣、氧氣、氮氣和C02氣體與pH值、溶氧的關聯(lián)控制，能準確控制溫度、轉速、pH值、溶解氧濃度和液位。細胞培養(yǎng)用生物反應器可連續(xù)進行培養(yǎng)，隨時采樣觀察，生產效率提高200％～300％，大大降低產品的成本；有完善的由計算機控制的檢測及培養(yǎng)系統(tǒng)，保證了運行的安全；體積小，減少了生產車間所需的凈化空間面積；自動化程度高，大大降低了污染率。

工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法第五十二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日3.1、滅活劑（1）甲醛溶液（福爾馬林）常用的甲醛溶液約含37%甲醛氣體（重量計），為強還原劑，能與微生物蛋白質的氨基酸結合，形成具有其它性質的化合物，而擾亂微生物的代謝，適當濃度可使微生物喪失增殖力或毒力，保持其抗原性和免疫原性。用于滅活細菌的濃度為0.1%—0.8%，用于滅活病毒時濃度為0.05%—0.2%。必要時在甲醛滅活后加入焦亞硫酸鈉以終止反應。（2）烷化劑類為一類含有烷基分子去一個氫原子的化合物，它能與另一種化合物作用，將烷基引入形成烷基取代物，其滅活作用主要是烷化病毒DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋鏈交聯(lián)，防礙RNA的合成，從而抑制細胞的有絲分裂，使病毒完全喪失感染力，但不損傷保護性抗原，廣泛用于病毒的滅活。常用的為BEI和AEI。3、滅活工藝

第五十三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（3）－丙烯內脂（BPL）本品為無色有刺激氣味的液體，對皮膚、粘膜有強刺激性，并具有致癌性。水中溶解度37％（V/V），能與丙酮、醚和氯仿混合。吸入空氣中的水分子時緩緩分解成羥基丙酸，其水溶液迅速全部分解，密封保存在玻璃瓶中于4－8C保存較穩(wěn)定。（4）硫柳汞鈉鹽又稱乙基汞硫代水楊酸鈉，本品為劇毒品，能溶于水和醇，在空氣中穩(wěn)定，在日光下不穩(wěn)定。對細菌、霉菌和病毒有一定的滅活作用，用于滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，常用終濃度為0.02%－0.01%。3.1、滅活劑第五十四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（5）苯酚又名石炭酸，為羥基與芳烴族（苯環(huán)與稠丙環(huán)）直接連接的化合物，其中苯的一部分被酚取代。本品有毒、腐蝕性及特殊氣味，其滅活機制是使微生物蛋白質變性和抑制特異酶系統(tǒng)，使其失去活性或感染性。常作為細菌滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，用量為0.3－0.5%。（6）結晶紫別名甲基青蓮或甲紫，為一種堿性染料，易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水或醚。其陽離子與微生物蛋白質帶陰電的羥基形成弱電力的化合物，防礙微生物的正常代謝，也可擾亂微生物的氧化還原作用，使電勢太高，不利于微生物的增殖。3.1、滅活劑

第五十五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）物理滅活方法有熱滅活、射線照射滅活和超聲波裂解等方法。采用熱滅活方法牛副結核滅活疫苗和草魚出血病滅活疫苗。超聲波裂解應放冰浴中間斷進行，以免升溫過高影響微生物的抗原性。60Co照射處理，應根據(jù)被照射物的容量大小選擇照射物與鈷源的距離和劑量。2）化學滅活方法早在20世紀初，就開始用甲醛減毒制備破傷風類毒素，之后有用甲醛或苯酚滅活制成犬瘟熱疫苗。20世紀30年代，用結晶紫成功地研制出豬瘟疫苗。1957年，采用－丙烯內脂研制成功了口蹄疫滅活疫苗等。3.2、滅活方法第五十六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日4.1、佐劑作用對抗原的作用佐劑吸附抗原后增加抗原的表面積，并改變活性基因的構型，因而增強抗原的免疫原性；佐劑和抗原被巨噬細胞吞噬，對抗原加工處理，賦予較強的免疫原性，增強T細胞和B細胞的協(xié)同作用；延長抗原在組織內的貯存時間，是抗原緩慢降解和緩慢釋放。4、佐劑配制第五十七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日對機體的作用引起巨噬細胞、淋巴細胞及漿細胞等細胞浸潤，促進其繁殖，增強其活性；加速淋巴細胞的轉化成效應細胞；增加細胞膜的活性和胞漿變化，分泌輔助性因子；改變細胞功能，巨噬細胞表現(xiàn)為數(shù)量增多、膜表面積增大、產生大量輔助因子和前列腺素等調節(jié)因子，T細胞和B細胞表現(xiàn)為數(shù)目增多、進入細胞增殖周期，膜表面成分發(fā)生改變，產生大量輔助因子（LK），B細胞則分化為漿細胞，分泌大量的抗體。4.1、佐劑作用第五十八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日無致癌或輔助致癌作用，不能誘導或促進腫瘤形成；無毒性，純度高，注射、口服等對動物安全，無任何毒、副作用；符合相關的質量標準；具有一定的吸附力；能在動物體內降解吸收，不易在組織中長期存留而誘發(fā)組織損傷；不誘發(fā)自身超敏反應及與血清抗體結合形成有害的免疫復合物；不含有與動物發(fā)生交叉反應的抗原物質；性能穩(wěn)定，佐劑抗原混合物儲存后不分解、不變質、不產生有害物質。4.2、佐劑標準第五十九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）不溶性鋁鹽佐劑包括氫氧化鋁膠、各種明礬和磷酸鋁等，與抗原混合后成為凝膠狀態(tài)，注射動物后可較長期存留在機體內，持續(xù)釋放抗原，顯著提高抗體滴度。這類佐劑在獸用生物制品中廣泛采用，《規(guī)程》現(xiàn)有的滅活疫苗中大多數(shù)用氫氧化鋁膠作為佐劑，如牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗等。鋁膠的質量對產品的質量有直接影響，因此《規(guī)程》中明確規(guī)定了氫氧化鋁膠質量標準。4.3、佐劑的類型第六十頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

早期有弗氏佐劑，以羊毛脂為乳化劑，具有親油親水性，乳化作用較好，但制出的乳劑非常粘稠。國外所用的油佐劑中廣泛采用的是礦物油和縮水甘露醇單油酸酯（ArlacelA）。國內廣泛選用注射白油、司本-80和吐溫-80作為油佐劑。

《規(guī)程》中明確規(guī)定了注射白油（輕質礦物油）的質量標準，要求其性狀（相對密度、粘度）、酸度、重金屬、鉛、砷、稠環(huán)芳烴、固形石蠟及易碳化物等項檢驗均應符合規(guī)定。乳化劑不同、礦物油不同、乳化劑配合比例不同及乳化方法不同，均影響著乳劑的性狀和穩(wěn)定性。目前常用的劑型為油包水和水包油包水型。2）油佐劑第六十一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日3）蜂膠佐劑蜂膠是蜜蜂采集植物分泌的樹脂，混入蜜蜂上顎腺分泌物，以及蜂蠟、花粉和其他一些有機與無機物的一種天然物質，具有廣譜的生物活性。蜂膠作為疫苗佐劑需進行純化，蜂膠佐劑具有良好的免疫增強作用，能增強巨噬細胞的吞噬能力，促進抗體的產生，提高機體的特異性和非特異性免疫力。4.3、佐劑的類型第六十二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日4）人工合成佐劑研究最多的屬胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、海藻糖合成衍生物，已合成了多種MDP的類似物和衍生物，這類佐劑和抗原形成油包水乳劑，接種動物具有有效的佐劑活性，但作為水溶液接種動物后，迅速排出，其佐劑活性受到限制。海藻糖合成衍生物有海藻糖-6，6′-雙霉菌酸酯（TDM），又稱索狀因子，最初從分枝桿菌細胞中發(fā)現(xiàn)。TDM有多種生物學活性，抗感染和抗腫瘤。4.3、佐劑的類型第六十三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日5）微生物及其代謝產物佐劑為細菌的菌體成分，具有明顯的佐劑作用。如革蘭氏陰性菌外膜脂多糖（LPS）、分枝菌的胞壁成分、革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸（LTA）、蛋白毒素等。

6）免疫刺激復合物佐劑（ISCOM）是由兩歧性抗原與QuilA和膽固醇1：1：1的分子混勻共價結合而成的一種較高免疫活性的脂質小泡。QuilA是從皂樹皮提取的一種糖苷，純化的QuilA能與病毒被膜蛋白或細菌和寄生蟲的外膜蛋白的疏水基結合。ISCOM現(xiàn)已廣泛用于多種細菌、病毒和寄生蟲病的疫苗。4.3、佐劑的類型第六十四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日7）細胞因子類佐劑多種細胞因子是有效的免疫增強劑，能增強由病毒、細菌和寄生蟲疫苗產生的保護作用。這類細胞因子主要有白細胞介素-2、白細胞介素-1、-干擾素及白細胞介素-12。8）其它佐劑這類佐劑主要有非離子阻斷共聚物表面活性劑、核酸及其類似物佐劑和左旋咪唑等。4.3、佐劑的類型第六十五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）用鋁膠作佐劑配苗時，將滅活的菌液和氫氧化鋁膠以一定的比例（3：1—9：1）混合，再加入適量的硫柳汞和苯酚充分振蕩而成。用明礬作佐劑配苗時，按滅活的菌液量加入明礬溶液1－2％，充分振蕩，然后沉淀而成。2）用油佐劑配苗，以白油、司本和硬脂酸鋁為油相，以含2—4%吐溫的抗原液為水相，按水相與油相1：1—1：4（V/V）的比例配制。在膠體磨或乳劑缸內配制成油包水或水包油包水疫苗。3）蜂膠作佐劑配苗時，在滅活的抗原液（病毒液或菌液）中加入蜂膠乙醇浸液，使每ml抗原液中含蜂膠10mg，變加變振蕩，成為乳濁狀，即為蜂膠佐劑疫苗。4.4制苗工藝第六十六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

弱毒活疫苗是用人工培育的弱菌（毒）株或自然弱（無）毒菌（毒）株或異種菌（毒）株或基因工程弱毒疫苗株生產的，對原宿主動物無致病性或引起亞臨床感染，但能使接種動物產生免疫力，以抵抗由該種病原引起的疾病。弱毒疫苗又稱活疫苗，大多數(shù)采用冷凍干燥技術生產成凍干疫苗，少數(shù)為液體（濕）疫苗。弱毒疫苗具有用量少、成本低、免疫力產生快、免疫期長等優(yōu)點。

（二）活疫苗制備技術第六十七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1.1、菌種的選育1）自然弱毒菌株自然界中存在著具有免疫原性的自然弱毒株，可以用于生產活疫苗。如布魯氏菌病豬2號株就是自然界中存在的弱毒株，已成功地用于制作活疫苗。2）人工傳代致弱菌株在培養(yǎng)基中或非宿主體內等連續(xù)傳代減弱病原的致病性，以制作活疫苗。如致弱的兔、山羊、綿羊牛傳染性胸膜肺炎菌株、布魯氏菌羊型5號菌株、乳兔肺致弱的豬支原體肺炎疫苗株等。1、菌（毒）種的選育

第六十八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日3）改變培養(yǎng)環(huán)境致弱菌株

在體外培養(yǎng)傳代病原菌時，某些突變株在正常環(huán)境中不易生長發(fā)育而死亡，但改變培養(yǎng)溫度（提高或降低），或在培養(yǎng)基中加入有抑制病原的化學物質，有利于某些突變株的發(fā)育，如在培養(yǎng)基中加醋酸鉈分離培育出了抗醋酸鉈的豬副傷寒沙門氏菌和馬流產沙門氏菌弱毒菌株。4）誘變菌株射線處理病原微生物或在體外的培養(yǎng)基中加入化學誘變劑，都能提高微生物的突變率，從而有助于弱毒株的培育。如用黃色素培養(yǎng)基培育豬丹毒弱毒菌株。許多疫苗的溫度敏感株（ts）都經過誘變選擇的。1.1、菌種的選育第六十九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

1）自然弱毒株選用自然界中具有免疫原性的天然弱毒株，可以用于生產動物用活疫苗。如NDVLaSota株和B1株，雞馬立克氏病血清II型（SB1、Z4）毒株，已成功地用于制作活疫苗。2）同屬異種的微生物選擇與病原同屬不同種，但具有一定的交叉免疫原性，天然宿主不同的微生物株系作為疫苗株，如火雞皰疹病毒預防雞馬立克氏病，山羊痘細胞致弱毒株預防綿羊痘和羊接觸傳染性膿皰皮炎等。1.2、毒種的選育第七十頁，共一百一十頁，2022年，8月28日3）人工傳代致弱毒株在培組織或細胞培養(yǎng)中、雞胚內或非宿主體內等連續(xù)傳代減弱病原的致病性，以制作活疫苗，如豬瘟活疫苗。4）基因工程疫苗株的構建利用基因工程技術改造微生物，構建基因工程弱毒活疫苗株。1）基因缺失疫苗株2）重組載體疫苗株。1.2、毒種的選育第七十一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）免疫抑制試驗當疫苗毒可能存在免疫抑制作用時，如雞傳染性法氏囊病、豬繁殖與呼吸綜合癥等，應對毒種進行免疫抑制試驗。靶動物接種菌（毒）種后，與未接種的動物同時觀察免疫器官或組織的變化，或同時再免疫接種其它疫苗，觀察兩組的疫苗抗體產生情況和/或抗強毒攻擊的保護情況。1.3、菌（毒）種的鑒定第七十二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日2）毒力返強試驗用基礎菌（毒）種較早代次，按實際接種途徑大劑量接種各種最易感日齡的靶動物，一定時間后，采集含菌（毒）靶組織制成懸液，再接種另一組易感的靶動物，如此至少傳5代次，觀察每次傳代動物的反應情況，并比較第一代和最后一代動物的反應和毒力或致病性增強的趨勢情況。1.3、菌（毒）種的鑒定第七十三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日禽源種毒1)雞胚接種檢查法將種毒中和后分別經尿囊腔和絨毛尿囊膜途徑接種9－11日齡的SPF雞胚10枚，雞胚應發(fā)育正常，絨毛尿囊膜無病變，雞胚尿囊液對雞紅細胞凝集陰性。2)雞接種檢查法將種毒接種適宜日齡的SPF雛雞20只，點眼、滴鼻接種10頭份；肌肉注射100頭份，接種后21日，重復接種1次，第一次接種后42日采血，測定相關病原的抗體。觀察期間不應由種毒引起的特異性局部或全身和呼吸道癥狀或死亡。3)細胞接種檢查法將種毒中和后接種CEF后，培養(yǎng)5－7日，不應有特異的細胞病變（CPE）產生，并不應出現(xiàn)吸附紅細胞現(xiàn)象。此外禽白血病病毒的檢驗（COFEL或ELISA）和REV（IFA）應為陰性。3）外源病毒檢驗第七十四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日非禽源種毒1)熒光抗體檢查法先用相應的陽性血清中和種毒后，接種細胞連傳2代，視被檢的種毒不同，選用不同的細胞和不同的熒光抗體。經熒光抗體染色后，不應出現(xiàn)特異的熒光。2)綠猴腎(vero)傳代細胞檢查法將中和后的接種vero細胞，連傳2代，不應出現(xiàn)CPE，同時進行紅細胞（豚鼠、雞和人紅細胞混合物）吸附試驗和熒光抗體試驗，均應為陰性。3)致細胞病變和紅細胞吸附試驗檢查法經接種傳代培養(yǎng)7日的細胞，用適宜染色液對細胞單層進行染色，檢查后不應出現(xiàn)包涵體、巨細胞或其它由外源病原引起的CPE。此外不應出現(xiàn)紅細胞吸附現(xiàn)象。3）外源病毒檢驗第七十五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）SPF雞或雞胚所有禽用病毒性活疫苗及其種毒制備所用的雞胚必須符合《獸用生物制品質量標準》中有關標準，即必須來源于SPF雞。生產禽用疫苗用SPF雞應在隔離環(huán)境中飼養(yǎng)，使用全價營養(yǎng)的無菌飼料。必須經17種病原（13種病毒，2種細菌，2種支原體的檢測，結果陰性方可使用。2）試驗動物當采用動物及其動物組織生產病毒性活疫苗時，要求制苗用動物應按照實驗動物的來源、品種、品系不同、動物級別不同和實驗目的不同，分開飼養(yǎng)，飼喂質量合格的全價飼料。2、制苗用主要原材料第七十六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日◆2008年1月1日起，農業(yè)部將對GMP疫苗生產企業(yè)疫苗菌(毒)種制備與鑒定、活疫苗生產以及疫苗檢驗使用無特定病原體(SPF級)雞、雞胚情況進行全面監(jiān)督檢查。對達不到標準要求的，將根據(jù)《獸藥管理條例》規(guī)定進行處理。《農業(yè)部關于加強獸用生物制品生產

檢驗原料監(jiān)督管理的通知》

(2006.11.22農醫(yī)發(fā)[2006]l0號令)第七十七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日血清、化學試劑和生物制劑細胞培養(yǎng)用血清能提供人工合成培養(yǎng)液必須的物質，對細胞附著和保護有明顯的作用，各種動物的血清都能應用，實驗室常用新生犢牛血清，既可大量采集，又有良好的細胞培養(yǎng)效果。也可應用馬血清、大牛血清、綿羊血清或雞、兔血清等。用成年動物血清培養(yǎng)細胞，效果大都不如犢牛血清，常含有抗病毒抗體或其它抑制病毒的物質，抑制病毒的生長。3）其它原材料第七十八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）制苗用菌液的制備液體培養(yǎng)基按培養(yǎng)基量的一定比例接入二級種子菌液，在37C左右搖動培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，當菌液混濁或pH下降時，停止培養(yǎng)，冷卻后收獲菌液或離心后收獲菌泥，適當稀釋后置2—8C保存?zhèn)溆谩９腆w培養(yǎng)基培養(yǎng)時，將檢驗合格的二級種子接種于瓊脂培養(yǎng)基上布勻，置適宜的溫度下培養(yǎng)一定時間，經檢查合格后加入穩(wěn)定劑將菌苔洗下，過濾，2—8C靜置沉淀。2）制苗用病毒液的制備將一定量的生產毒種接種動物、組織、雞胚或細胞，每天觀察接種動物的反應，接種雞胚的觀察雞胚的死亡或感染情況，接種細胞的既可靜止培養(yǎng)，也可轉瓶培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，待病毒繁殖充分后收獲含毒器官、組織或含毒細胞液，收獲的含毒組織或細胞液。3、疫苗原液的繁殖第七十九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）液體（濕）苗的配制疫苗原液或半成品檢驗合格后，將菌（毒）液混合，按規(guī)定頭份定量分裝，每頭份疫苗不得低于規(guī)定的最低標準。2）凍干苗的配制按疫苗原液量加入一定比例的保護（穩(wěn)定）劑，病毒性組織苗需預先制成乳劑后，加入一定比例的保護（穩(wěn)定）劑，充分混合后，按規(guī)定頭份定量分裝，分裝過程中應隨時振搖，分裝結束后迅速進行冷凍真空干燥。凍干后在真空狀態(tài)下在凍干柜內自動壓塞，出箱后壓上鋁帽。4、疫苗配制與凍干第八十頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）凍干疫苗保護劑（穩(wěn)定劑）防止疫苗在凍干過程中活性物質失去結構水及阻止結構水形成結晶；保護微生物中活性物質的活性與抗原性；降低細胞內外的滲透壓差；保持弱毒疫苗中微生物在干燥狀態(tài)下的活力和復蘇時迅速恢復活力；對疫苗的免疫效果無影響；對微生物的保護性能（尤其是耐熱性能）良好；凍干產品的物理性狀（外觀、色澤、溶解性等）符合要求。常用的有：5%蔗糖（乳糖）脫脂乳、明膠蔗糖、40%蔗糖明膠、聚乙烯吡咯烷酮乳糖和SPGA。2）液體疫苗保護劑甘油甘油作為保護劑廣泛用于活疫苗，如50％甘油鹽水，可以殺滅大多數(shù)細菌，而病毒卻可存活二甲基亞砜（DMSO）二甲基亞砜可以減少冷凍過程中微小冰晶的形成，因而保護冷凍的病毒。5、疫苗保護劑第八十一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

不同微生物保護劑的主要成分

微生物類型凍干保護劑主要成分細菌10%蔗糖、5%蔗糖脫脂乳、5%蔗糖、1.5%明膠；10—20%脫脂乳、含1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳；5%牛血清白蛋白的蔗糖；滅活馬血清等厭氧菌含0.1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳，10%脫脂乳，7.5%葡萄糖血清等病毒常用下列物質的不同濃度或按不同比例混合組成凍干保護劑：明膠、血清、谷氨酸鈉、羊水、蛋白胨、蔗糖、乳糖、山梨醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、水解乳蛋白、乳酸鈣、海藻糖、硫脲等支原體50%馬血清、1%牛血清白蛋白、5%脫脂乳、7.5%葡萄糖馬血清等立克次體10%脫脂乳酵母菌馬血清或含7.5%葡萄糖馬血清、含1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳等第八十二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日

1、疫苗質量中問題弱毒活疫苗：凍干保護劑；毒力偏強；外源病原污染。滅活疫苗:抗原繁殖、濃縮和純化技術落后，抗原純度不夠，副反應太大；油佐劑滅活苗穩(wěn)定性差，副反應大；免疫效果差。

（三）疫苗質量改進新技術第八十三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）分子設計與基因工程技術亞單位疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、DNA疫苗轉基因植物疫苗等。2）抗原緩釋技術將抗原制成聚合物，增加抗原效能、延長疫苗免疫期。3）新型免疫佐劑減少副反應，提高細胞免疫調節(jié)作用。4）新型生物發(fā)酵技術傳統(tǒng)的生物發(fā)酵罐變?yōu)樯锓磻?，實現(xiàn)了程序化操作。5）現(xiàn)代細胞工程技術利用細胞反應器進行細胞微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。2、改進新技術第八十四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日獸用診斷制品中使用的微生物都具有抗原性，根據(jù)抗原與抗體特異性結合或核酸堿基配對的原理，利用微生物及其代謝產物或動物血液及組織材料制成的可用于畜禽疾病診斷的制品稱為診斷用生物制品，包括診斷抗原、診斷血清、標記抗體及核酸探針等。三、獸用診斷試劑的制備

第八十五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1、診斷抗原類型按性質可將診斷抗原分顆粒性抗原和可溶性抗原。按照診斷試驗的種類可將診斷抗原分為凝集反應抗原、補體結合反應抗原、酶聯(lián)免疫吸附試驗抗原、中和試驗抗原、瓊擴試驗抗原、變態(tài)反應抗原及對流免疫電泳抗原等。（一）診斷抗原的制備第八十六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）凝集反應抗原此類抗原多為顆粒性抗原，在有電解質的情況下，與特異性抗體結合形成肉眼可見的凝集塊，稱凝集反應。參與凝集反應的抗原為凝集原，抗體為凝集素。凝集反應有直接凝集反應和間接凝集反應。直接凝集試驗只適用于不產生自凝現(xiàn)象的細菌，所以應用面較窄。間接凝集反應是將病原微生物的可溶性抗原物質吸附在顆粒性載體如紅細胞、膠乳顆粒、炭素顆粒等的表面，制備成可產生凝集反應的顆粒性抗原成分。用紅細胞作抗原載體的凝集反應稱間接血凝試驗。相反將免疫球蛋白連接到紅細胞的表面，即為反相間接血凝試驗。1、診斷抗原類型第八十七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日在補體結合試驗中有兩個反應系統(tǒng)：即檢驗系統(tǒng)和指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）。檢驗系統(tǒng)包括已知的抗原（或抗體）、被檢的抗體（或抗原）和補體。指示系統(tǒng)包括綿羊紅細胞、溶血素和補體。補體是兩個系統(tǒng)共用的。如果檢驗系統(tǒng)中抗原與抗體形成復合物，則補體被結合不再游離，隨后加入的指示系統(tǒng)不發(fā)生溶血現(xiàn)象。反之若抗原與抗體不相應，則不能結合補體，補體即參與溶血系統(tǒng)反應，導致溶血現(xiàn)象。根據(jù)指示系統(tǒng)的溶血情況可以間接測定特異性抗原與抗體是否存在及其含量，從而對抗原或抗體進行定性或定量。2）補體結合反應抗原第八十八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日3）酶聯(lián)免疫吸附試驗抗原將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶染色，底物顯色后用肉眼或分光光度計判定結果，包括直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法等。4）中和試驗抗原中和試驗是一種常用的診斷試驗方法，既可用于定性試驗，又可用于定量試驗。既有固定血清—稀釋病毒方法（法），又有固定病毒—稀釋血清（法）。5）免疫沉淀試驗抗原當可溶性抗原與其相應的抗體在溶液中或瓊脂凝膠中擴散接觸時，形成的抗原－抗體復合物成為肉眼可見的不溶性沉淀物，即為免疫沉淀反應。第八十九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日某些細胞內寄生菌、病毒、真菌、寄生蟲等，感染后可引起以細胞免疫為主的IV型變態(tài)反應。由于這種反應具有高度的特異性和敏感性，因此臨床上常利用變態(tài)反應作為某些傳染病的診斷方法。如鼻疽菌素、結核菌素、布氏菌水解素、提純副結核菌素等。6）變態(tài)反應抗原第九十頁，共一百一十頁，2022年，8月28日基本技術路線包括：選擇抗原性良好的菌（毒）株生產用菌（毒）種的制備與鑒定制備細菌抗原用培養(yǎng)基或制備病毒抗原用細胞或動物等原材料的選擇細菌（固體或液體）的培養(yǎng)或病毒液的繁殖、收獲抗原液的滅活抗原的提純、濃縮除菌過濾抗原的檢驗抗原的分裝與凍干保存。不同的微生物制備診斷抗原的方法不同，不同的抗原制備方法也有差異。有些抗原需要較復雜的工藝，如變態(tài)反應抗原、免疫沉淀試驗抗原的制備往往需要提純和濃縮抗原，以增加抗原反應的特異性和敏感性。中和試驗抗原制備比較簡單，一般不需提純與濃縮。2、診斷抗原的制備第九十一頁，共一百一十頁，2022年，8月28日診斷血清是一類含有特異性抗體、用于診斷或鑒定微生物的生物制劑，包括各種診斷血清、分群血清或分型血清等。1、免疫動物的選擇制備免疫血清的動物多為家兔、豚鼠、馬、牛、羊及雞等。免疫前，須經確認無傳染病并健康者方可使用。禽類血清有抗補體成分，在制備補體結合試驗用抗血清時應選用哺乳動物。2、免疫抗原的制備制備免疫血清的抗原，多為微生物體或其毒素(類毒素)，或其提取物等純化完全抗原。免疫抗原的提純和濃縮，是制出高效價血清的先決條件。（二）診斷血清的制備第九十二頁，共一百一十頁，2022年，8月28日免疫原注射多采用皮下或肌肉途徑注射，大量抗原注射則以靜脈途徑較好，但抗毒素免疫則不采用靜脈途徑，應以背部多點注射為宜。有一些用球蛋白抗原制備抗抗體血清時，須要加適當佐劑注射，如用弗氏完全或不完全佐劑，背部皮下多點注射，第一次免疫加完全佐劑，以后多次免疫只能使用不完全佐劑，隔7—10天加強免疫一次，可以獲得較好的抗抗體血清。3、免疫方法和免疫程序第九十三頁，共一百一十頁，2022年，8月28日最后一次大劑量注射抗原后8～10天進行第一次采血。采血量可按動物體重每公斤采10ml左右。動物采血應在上午空腹時進行，前一天下午不喂精料，只喂草料及水。3～4天后進行第二次采血。采血后3—5天再次注射大量抗原，如此循環(huán)進行采血及注射抗原。4、血清采集與提取第九十四頁，共一百一十頁，2022年，8月28日1）免疫血清的檢驗：診斷用血清的檢驗主要是特異性、敏感性和效價的測定。作標記抗體用血清，免疫球蛋白含量應達到一定的絕對值。2）免疫血清的標化：診斷用陽性血清，特別是分群血清和分型血清等，均須標化成為標準品或參考標準品，有些還須用國際標準品進行標化，定出國際單位(1U)。5、免疫血清的檢驗與標化第九十五頁，共一百一十頁，2022年，8月28日標記抗體技術主要有熒光抗體技術、免疫酶組化染色技術、酶聯(lián)免疫吸附試驗、放射免疫測定、免疫膠體金技術等。豬瘟熒光抗體的制備方法將高免血清用飽和硫酸銨鹽析法提取免疫球蛋白G（IgG），用2％（W/V）抗體蛋白液按80：1的重量比與異硫氰酸熒光素（FITC）在10C左右結合6小時。通過SephadexG50柱層析，除去未結合的游離熒光素，測定熒光抗體染色效價和蛋白濃度，蛋白濃度不應超過0.125mg/ml為合格。6、標記抗體的制備第九十六頁，共一百一十頁，2022年，8月28日（一）獸用生物制品檢驗技術標準1、獸用活疫苗檢驗技術標準：物理性狀：液體疫苗應無異物、搖不散的凝塊、絮狀物、霉團、變質；凍干疫苗無干縮、瓶破裂、瓶口密封不嚴。純粹檢驗：所有制品不應污染細菌、霉菌。病毒組織苗如有細菌污染，非病原菌每頭份不超過1個；病毒性活疫苗不應污染支原體和外源病毒，尤其是明確規(guī)定禽源活疫苗必須用COFAL試驗檢測不應有禽白血病病毒的污染。鑒別檢驗：應能被特異抗血清所中和。四、獸用生物制品檢測技術第九十七頁，共一百一十頁，2022年，8月28日安全檢驗：在專用動物舍進行，一般使用10個頭份的疫苗進行,無論是本動物或非本動物進行的安全檢驗，必須全部符合規(guī)定。規(guī)定用多種動物進行安全檢驗的制品，任何一種動物結果不符合規(guī)定者，均判不合格。效力檢驗：1）病毒滴定或細菌計數(shù)：應保證比最小免疫原性的數(shù)量大，且在規(guī)定的有效期內均不應低于規(guī)定標準。2）動物免疫方法：測定免疫動物的血清抗體或免疫攻毒進行判定。水份測定：不應超過4%。真空度測定：每瓶疫苗均應有真空。1、獸用活疫苗檢驗技術標準第九十八頁，共一百一十頁，2022年，8月28日物理性狀：油乳劑滅活疫苗的外觀應為乳白色均勻乳劑，單相苗為油包水，雙相苗為水包油包水劑型；37℃放置21天不破乳；單相苗的粘度在10秒以內，雙相苗的粘度在

5秒以內。無菌檢驗：不應污染細菌、霉菌；不得含有活的本菌和本毒。安全檢驗：在專用動物舍進行，一般使用2個頭份的疫苗進行檢驗，無論是本動物或非本動物進行的安全檢驗，必須全部符合規(guī)定。2、獸用滅活疫苗檢驗技術標準第九十九頁，共一百一十頁，2022年，8月28日效力檢驗：多用本動物進行相關的效力試驗（接種/攻毒或檢測血清抗體），當對照組攻毒成立或抗體陰性時，疫苗免疫組的保護力或抗體水平須符合標準規(guī)定。甲醛、苯酚、硫柳汞含量測定：甲醛含量不應超過0.2%；苯酚含量不應超過0.5%；硫柳汞含量不應超過0.01%。

2、獸用