植物過(guò)氧化物酶同工酶的測(cè)定凝膠圓盤(pán)電泳

植物過(guò)氧化物酶同工酶的測(cè)定（凝膠圓盤(pán)電泳）植物組織中的蛋白質(zhì)，包括同工酶（isoenzyme）都是基因表達(dá)的產(chǎn)物。每一種植物都有相同的遺傳信息（DNA），其表達(dá)產(chǎn)物與植物的發(fā)育和所處的環(huán)境有十分密切的關(guān)系，植物不同組織和器官有不同的形態(tài)特征和化學(xué)組成，從而合成不同的酶蛋白。凡能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其分子結(jié)構(gòu)和帶電性質(zhì)不同的一組酶稱(chēng)同工酶。同工酶譜的差異同樣是基因表達(dá)的差異造成的，所以在研究植物基因調(diào)控與生長(zhǎng)發(fā)育、與環(huán)境條件的關(guān)系以及許多生理生化和遺傳問(wèn)題時(shí)，常常要分析同工酶譜的差異。因此，同工酶研究在理論和實(shí)踐中都有非常重要的意義。一、原理聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下聚合而成，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度和交聯(lián)度加以調(diào)節(jié)。凝膠電泳兼有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。被分離物質(zhì)由于所載電荷數(shù)量、分子大小和形狀的差異，因此在電泳時(shí)產(chǎn)生不同的泳動(dòng)速率而相互分離。利用特異性的顏色反應(yīng)使待測(cè)酶著色，這樣就可在凝膠中展現(xiàn)出酶譜。過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)常見(jiàn)的氧化酶。植物體內(nèi)許多生理代謝過(guò)程常與它的活性及其同工酶的種類(lèi)有關(guān)。利用過(guò)氧化物酶能催化H2O2把聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕褐色產(chǎn)物的原理，將經(jīng)過(guò)電泳后的凝膠置于有H202及聯(lián)苯胺的溶液染色，出現(xiàn)藍(lán)色或棕褐色的部位即為過(guò)氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構(gòu)成過(guò)氧化物酶同工酶譜。本實(shí)驗(yàn)利用連續(xù)的盤(pán)狀凝膠電泳，采用Tris-Gly緩沖系統(tǒng)來(lái)分離陰離子過(guò)氧化物酶同工酶。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料小麥芽。（二）儀器設(shè)備穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，冷凍離心機(jī)及離心管，成套電泳槽（圓盤(pán)型），pH試紙，其他常規(guī)用具。（三）試劑（1）分離膠緩沖液（pH8.9）：1mol/LHC148mL，Tris36.6g，TEMED（四甲基乙二胺）0.23mL，加水定容至100mL。（2）分離膠貯液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容至100mL，過(guò)濾后使用。（3）過(guò)硫酸銨溶液：過(guò)硫酸銨0.2g，加水定容至100mL（制膠時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用）。（4）濃縮膠緩沖液：1mol/LHCl48mL＋Tris5.98g+TEMED0.46mL，調(diào)pH6.7，并定容至100mL。（5）濃縮膠貯備液：丙烯酰胺10g，甲叉雙丙烯酰胺2.5g加水定容到100mL，使用前過(guò)濾。（6）電極緩沖液：Tris6.0g.Gly28.8g，用水定容至1000mL（pH8.3），用前稀釋10倍。（7）四甲基乙二胺（TEMED）。（8）0.1%的溴酚藍(lán)水溶液。聯(lián)苯胺染色母液：聯(lián)苯胺1g+冰醋酸18mL＋H22mL溶解貯于棕色瓶中。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.安裝電泳槽見(jiàn)圖2-27-1。2.凝膠的配制（1）分離膠的配制。按試劑編號(hào)：試劑（1）：試劑（2）1：2：H.0：試劑（3）=3mL：6mL：3mL：12mL吸取各溶液至小燒杯中，混合均勻，然后用帶長(zhǎng)針頭的注射器吸取混合膠液、插入干燥潔凈下端密封的玻璃管中，緩慢推出膠液，同時(shí)針頭慢慢向上移動(dòng)，直至膠液至玻管的刻度線處（如有氣泡應(yīng)設(shè)法排除），膠面加0.5cm的水層，約30min左右，當(dāng)見(jiàn)到水層底下有一清楚界面時(shí)，表明膠已聚合。倒去水層，用濾紙條吸干水分。（2）濃縮膠的配制。按試劑編號(hào)；試劑（4）：試劑（5）：H2O：試劑（3）=0.5mL：1mL：0.5mL：2mL混合均勻，注入到分離膠上面至玻璃管的第二刻度處，再用水封閉濃縮膠液面，約30min聚合后吸去表面水層。3.過(guò)氧化物酶的提取稱(chēng)取1g待測(cè)植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1mLH，0或0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH6，8）研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2mL前述溶液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，3500r/min離心15~20min，其上清液即為酶的提取液，供電泳分析用。4.點(diǎn)樣用微量注射器吸取上清液，每管加樣50μL，再分別加入40%蔗糖溶液50gll，之后再用注射器將電極緩沖液慢慢加入每支膠管至浸沒(méi)頂部為止，最后向上、下電泳槽倒入電極緩沖液（上槽必須淹沒(méi)管頂，下槽液要能浸泡若凝膠管），最后在上槽液中滴入1~2滴溴酚藍(lán)溶液。5.電泳將電泳槽放至低溫處，最好在4℃左右，或接通電泳槽水冷卻系統(tǒng)按上"-"下“＋”接好導(dǎo)線，通電，電泳開(kāi)始電流應(yīng)低，每管1mA，10min后，再加大電流，使每管達(dá)到2~3mA，當(dāng)澳臀藍(lán)指示劑達(dá)到距管底約1cm處時(shí)，切斷電流，停止電泳：6.剝膠電泳完畢、將電泳槽取出，倒去緩沖液，取下凝膠管，放入培養(yǎng)皿中。用一個(gè)借有長(zhǎng)針頭的注射器。吸滿(mǎn)水，將針頭沿管壁插入，同時(shí)慢慢地將注射器中的水推出，并不斷轉(zhuǎn)動(dòng)凝膠管，將凝膠條擠脫出來(lái)，也可用洗耳球擠壓。7.染色取0.5mL聯(lián)苯胺母液+9.3mLH，O+0.2ml.3%H2O，，混勻后倒入盛有凝膠條的培養(yǎng)皿。此時(shí)可以看到膠條上出現(xiàn)藍(lán)色或棕褐色環(huán)，即過(guò)氧化物酶帶，約10min后用自來(lái)水沖洗，這時(shí)藍(lán)色帶也慢慢變成棕褐色。8.記錄并計(jì)算記錄酶譜，并計(jì)算各同