免疫學及免疫學檢驗課件

標記免疫技術醫(yī)學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室二OO四年三月標記免疫技術1標記免疫技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術+標記技術來自中國最大的資料庫下載

標記免疫技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術2標記免疫技術免疫測定技術免疫組化技術示蹤物及標記技術放射免疫技術熒光免疫技術酶免疫技術化學發(fā)光技術金免疫技術???來自中國最大的資料庫下載

標記免疫技術免疫測定技術免疫組化技術示蹤物及放射免疫技術來自3第八章放射免疫技術

類型：放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術還包括放射受體分析（使用受體測量抗原）和放射配體結合分析（使用配體研究受體）。特點:靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強、重復性好等來自中國最大的資料庫下載

第八章放射免疫技術來自中國最大的資4標記物:常用的核素有兩大類γ射線：131I、125I、57Cr和60Coβ射線：14C、3H和32P。使用最廣泛的是：125I①性質活潑、易制備標記物②對被標記物的免疫活性影響?、蹨y量方法簡便、已推廣④半衰期較長、核素豐度高來自中國最大的資料庫下載

標記物:來自中國最大的資料庫下載5標記方法125I的標記原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子方法：直接標記法

氯胺T法和乳過氧化物酶法間接標記法

聯接標記法來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載6適用分子原理特點缺點直接標記肽類、蛋白質、酶存在酪氨酸、組胺殘基等基團操作簡便、易標記、比放射性高不適于活性功能區(qū)的殘基標記間接標記甾類化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、組胺殘基等基團,需添加可避免氧化／還原劑對被標記物活性的損傷等添加基團可能影響被標記物活性來自中國最大的資料庫下載

適用分子原理特點缺點直接標記肽類、蛋白質、酶存在酪氨酸、組胺7標記物純化

對游離的125I等試劑與標記物進行分離方法：分子篩凝膠過濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）；高效液相色譜（HPLC）來自中國最大的資料庫下載

標記物純化來自中國最大的資料庫下載8標記物鑒定放射化學純度

單位標記物中結合在被標記物上的放射性占總放射性的百分率。一般要求大于95％。免疫活性

標記過程中，被標記物活性損傷程度。B/T％>80％，B/T％↑抗原損傷↓。比放射性

單位化學量標記物中所含的放射性強度.常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等單位表示。比放射性↑方法更靈敏；過高輻射自損傷大，對標記物免疫活性影響大，儲存穩(wěn)定性差。來自中國最大的資料庫下載

標記物鑒定來自中國最大的資料庫下載9抗血清鑒定多克隆抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑之一，其質量直接影響方法的特異性和靈敏度。親合力選用親和常數K值大(109~1012L//mol)抗血清特異性其程度可直接影響結果的準確性

滴度最大稀釋度。在本技術方法中是指結合50％標記抗原時的抗血清的稀釋度。來自中國最大的資料庫下載

抗血清鑒定來自中國最大的資料庫下載10放射免疫分析（RIA）基本原理

采用定量的標記抗原（Ag＋）和非標記抗原（Ag）競爭性結合有限量特異性抗體（Ab）的反應。來自中國最大的資料庫下載

放射免疫分析（RIA）來自中國最大11來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載12來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載13以未結合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F與Ag的量變存在著函數關系。B/F60(％)50403020

10

0.81.62.43.24.04.85.6Ag(ng/ml)來自中國最大的資料庫下載

以未結合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F與14測定方法與步驟1.抗原抗體反應：平衡法或非平衡法2.分離結合與游離標記物沉淀劑沉淀復合物，離心分離。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分離徹底，迅速；分離試劑和過程不影響反應平衡；操作簡便，重復性好且經濟。3.放射性測定及數據處理晶體閃爍計數儀(γ射線)或液體閃爍計數儀(β射線)繪制標準曲線，計算待檢抗原濃度。來自中國最大的資料庫下載

測定方法與步驟來自中國最大的資料庫下載15免疫放射分析（IRMA）基本原理

單位點IRMA：利用過量標記抗體與待測抗原進行反應，形成抗原抗體復合物，反應平衡后，用固相抗原結合反應液中剩余的未結合標記抗體并將其分離，測定上清液的放射量。來自中國最大的資料庫下載

免疫放射分析（IRMA）來自中國最大的16來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載17雙位點IRMA先用固相抗體與抗原反應結合,然后再用過量的標記抗體與已結合于固相抗原的另一抗原決定簇結合,形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物,洗棄反應液中剩余的標記抗體,測定固相上的放射性。來自中國最大的資料庫下載

雙位點IRMA先用固相抗體與抗原反應結合,然后再用過量18來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載19IRMA與RIA的異同點

標記物

在RIA中核素標記抗原，抗原有不同種類，根據其化學結構，標記時需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中核素標記抗體?？贵w為蛋白質，有利于碘化標記，不同抗體標記方法基本相同。標記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。反應速率反應速度與反應物的濃度呈正比，在IRMA中標記抗體是過量的，而且不存在競爭性結合復雜的反應，所以反應速度較RIA快。在RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在IRMA中應用親和力較低的單克隆體也能得到滿意的結果。來自中國最大的資料庫下載

IRMA與RIA的異同點來自中國最大20反應原理

RIA為競爭抑制，測得放射性的量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競爭結合，劑量反應曲線為正相關的直線關系。特異性

在雙位點IRMA中，一般均應用針對不同位點的單克隆抗體，其交叉反應率低于應用多克隆抗體的RIA。檢測范圍

通常RIA的工作范圍為2-3個數量級，而RIMA可達3個數量級以上。來自中國最大的資料庫下載

反應原理RIA為競爭抑制，測得放射性的量與受檢抗原呈反21分析誤差RIA中加入的抗體和標記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴重影響測定結果。IRMA中標記和固相抗體在反應中都是過量的，只有受檢標本的加樣誤差才會影響分析結果。因此，IRMA的批內和批間變異均比較小。其他RIA可以測定大分子量與小分子量的物質，雙位點IRMA只能測定在分子上具有2個以上抗原表位的物質。在RIA中應用的為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量很少。IRMA中標記抗體和固相抗體用量較多，一般均用來源豐富、特異性較高的單克隆抗體。

來自中國最大的資料庫下載

分析誤差RIA中加入的抗體和標記抗原都是定量的，加樣誤22放射免疫技術的應用常用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標志物和藥物等微量物質的測定。問題：放射性污染、常用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定期不長不易自動化儀器分析等。來自中國最大的資料庫下載

放射免疫技術的應用來自中國最大的資料庫23第九章免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescencetechnique)是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。

是將抗原抗體反應的特異性與熒光物質檢測的敏感性和直觀性結合起來的一種方法。

來自中國最大的資料庫下載

第九章免疫熒光技術來自中國最大的資24基本原理利用熒光素標記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標本中的待檢抗原特異結合，采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，使結合在標本上的熒光素被激發(fā)而產生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。來自中國最大的資料庫下載

基本原理來自中國最大的資料庫下載25第一節(jié)熒光的基本知識來自中國最大的資料庫下載

第一節(jié)熒光的基本知識來自中國最大的資26異硫氰酸熒光素（FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，分子量為389.4，最大吸收光波長為490-495nm，最大發(fā)射光波長520-530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，是應用最廣泛的熒光素。主要優(yōu)點：①人眼對黃綠色較為敏感；②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色，降低背景干擾

。來自中國最大的資料庫下載

異硫氰酸熒光素（FITC）來自中國最大27來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載28四乙基羅丹明（RB200）

為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595－600nm，呈橘紅色熒光。常用于雙重標記或對比染色。

來自中國最大的資料庫下載

四乙基羅丹明（RB200）來自中國最大29四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）

最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。

來自中國最大的資料庫下載

四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）來自30

熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，一些化合物對熒光有猝滅作用，因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。來自中國最大的資料庫下載

熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝31熒光抗體的制備作為標記的熒光素應符合以下要求：

①應具有能與蛋白質分子形成共價健的化學基團，與蛋白質結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產物易于清除。②熒光效率高,與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。④與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質，與蛋白質的結合物穩(wěn)定，易于保存。

⑤標記方法簡單、安全無毒。來自中國最大的資料庫下載

熒光抗體的制備來自中國最大的資料庫下載32熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學方式共價結合而成。

標記方法：攪拌法(適合大樣品)透析法(適合小樣品)標記抗體的純化：透析法層析分離法

來自中國最大的資料庫下載

熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學方式共價結33熒光抗體的鑒定F/P比率：將制備的熒光抗體稀釋至A280≈1.0，分別測讀A280（蛋白質特異吸收峰）和標記熒光素的特異吸收峰來自中國最大的資料庫下載

熒光抗體的鑒定F/P比率：來自中國最大34F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細胞染色的以F/P＝2.4為宜。

來自中國最大的資料庫下載

F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一35抗體效價：效價越大標記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價在1:16-1:32者較為理想抗體特異性：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強烈熒光來自中國最大的資料庫下載

抗體效價：效價越大標記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價在36第二節(jié)免疫熒光顯微技術基本原理：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。

來自中國最大的資料庫下載

第二節(jié)免疫熒光顯微技術來自中國最大37直接法

熒光抗體染色來自中國最大的資料庫下載

直接法熒光抗體染色來自中國最大的資料38直接法優(yōu)點：操作簡便、特異性高、非特異熒光染色因素少，缺點：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應的特異熒光抗體來自中國最大的資料庫下載

直接法來自中國最大的資料庫下載39間接法

來自中國最大的資料庫下載

間接法來自中國最大的資料庫下載40間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。來自中國最大的資料庫下載

間接法來自中國最大的資料庫下載41免疫熒光技術在醫(yī)學檢驗中的應用在細菌學檢驗中主要用于菌種的鑒定。免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測是梅毒特異性診斷常用方法之一。用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。在寄生蟲感染診斷中，間接免疫熒光試驗（IFAT）是當前公認的最有效的檢測瘧疾抗體的方法。來自中國最大的資料庫下載

免疫熒光技術在醫(yī)學檢驗中的應用來自中國42免疫熒光法還是檢測自身抗體的好工具，在自身免疫病的實驗診斷中應用廣泛。其突出優(yōu)點是能以簡單方法同時檢測抗體和與抗體起特異反應的組織成分，并能在同一組織中同時檢查抗不同組織成分的抗體。熒光抗體技術的一種特殊應用是流式細胞分析（flowcytometry）?？捎糜跈z測細胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于T細胞亞群等的檢測。來自中國最大的資料庫下載

免疫熒光法還是檢測自身抗體的好工具，在自身免疫病的實驗診斷中43第十章酶免疫技術

來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載44第一節(jié)酶免疫技術概述基本原理利用酶催化底物反應的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學反應的檢測敏感性的一種標記免疫技術。

來自中國最大的資料庫下載

第一節(jié)酶免疫技術概述來自中國最大的資45基本特點：①標記后保留酶和抗原(抗體)的活性②酶促反應專一性，保證特異性③底物反應放大作用，提高敏感性④酶標試劑保存穩(wěn)定⑤操作簡便，安全易行來自中國最大的資料庫下載

基本特點：來自中國最大的資料庫下載46主要試劑的制備與要求來自中國最大的資料庫下載

主要試劑的制備與要求來自中國最大的資料47一、酶與酶作用底物（一）用于標記酶的要求：酶活性高標記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標記抗原與抗體的免疫反應性酶催化底物后信號易判定或測定酶活性不受樣品中其他成分的影響酶、輔助因子及底物理化性質穩(wěn)定，安全無害，價廉來自中國最大的資料庫下載

一、酶與酶作用底物來自中國最大的資料庫48（二）常用酶及其底物1.辣根過氧化物酶（HRP）常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應顯橙黃色，應避光，致癌性四甲基聯苯胺（TMB）：反應后呈藍色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。來自中國最大的資料庫下載

（二）常用酶及其底物來自中國最大的資料49來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載502.堿性磷酸酶（AP）

常用底物為對硝基苯磷酸酯（p-NPP），產物為黃色。

*AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標記物收率低于HRP，且價高，故應用不如HRP普及。來自中國最大的資料庫下載

2.堿性磷酸酶（AP）來自中國最大的51二、酶標記抗體或抗原基本要求：酶標記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價高，親和力強，比活性高以及易于批量生產和分離純化來自中國最大的資料庫下載

二、酶標記抗體或抗原來自中國最大的資料52酶標記方法

1.交聯法以雙功能交聯劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結合物。如戊二醛交聯法。2.直接法

用過碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標記物制備。來自中國最大的資料庫下載

酶標記方法來自中國最大的資料庫下載53三、固相載體基本要求結合容量高，結合穩(wěn)定；可與抗原抗體復合物等大分子蛋白結合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡便易行、快捷經濟。來自中國最大的資料庫下載

三、固相載體來自中國最大的資料庫下載54固相載體的種類與選擇1.塑料制品材料經濟，操作簡便，易于自動化，最常用。2.微顆粒結合容量大，反應迅速，逐漸普遍用于自動化分析。3.膜載體硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜等微孔濾膜，廣泛應用于定性或半定量的斑點ELISA。來自中國最大的資料庫下載

固相載體的種類與選擇來自中國最大的資料55四、免疫吸附劑原理：非共價鍵吸附或共價鍵化學偶聯（包被）。一般采用偏堿性（pH9.6）的碳酸鹽溶液（ELISA板）。封閉：1％－5％牛血清白蛋白或5％－20％小牛血清。來自中國最大的資料庫下載

四、免疫吸附劑來自中國最大的資料庫下載56酶免疫技術的分類

酶免疫組化用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原和抗體

酶免疫技術均相酶免疫測定酶免疫測定固相酶免疫測定異相酶免疫測定（ELISA）液相酶免疫測定來自中國最大的資料庫下載

酶免疫技術的分類來自中國最大的資料庫57均相酶免疫測定Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E基本原理：利用酶標抗體結合抗原形成復合物后，標記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復合物與游離酶標抗體分離的情況下，直接測定系統(tǒng)中總的標記酶活性的改變，進而推算出待檢樣品中的抗原量。來自中國最大的資料庫下載

均相酶免疫測定Ag+Ab-EAgAb-E58異相酶免疫測定（enzymeimmunoassay,EIA）基本原理：在抗原抗體反應后，先將抗原抗體復合物與游離的酶標抗體分離，再測定酶標記的復合物催化底物顯色的活性，最后推算出樣品中抗原的含量。液相EIA：分離劑分離游離的和結合的標記物。固相EIA：固相載體結合酶標復合物，經洗滌去除游離的酶標抗體。如ELISA。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E來自中國最大的資料庫下載

異相酶免疫測定（enzymeimmunoassay,EIA）59

第二節(jié)酶聯免疫吸附試驗enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)

來自中國最大的資料庫下載

第二節(jié)酶聯免疫吸附試驗來自中國最大60基本原理：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應來自中國最大的資料庫下載

基本原理：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活61用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析來自中國最大的資料庫下載

用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，62ELISA技術類型：

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，酶作用的底物。來自中國最大的資料庫下載

ELISA技術類型：ELISA可用于測定抗原，也可用于測定63來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載641．雙抗體夾心法

來自中國最大的資料庫下載

1．雙抗體夾心法來自中國最大的資料庫65來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載66特點：非競爭結合反應常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇

來自中國最大的資料庫下載

特點：來自中國最大的資料庫下載672．間接法

來自中國最大的資料庫下載

2．間接法來自中國最大的資料庫下載68來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載693.競爭法

來自中國最大的資料庫下載

3.競爭法來自中國最大的資料庫下載70特點：用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進行測定。酶標Ag（Ab）與樣品或標準品中的非標記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結合的能力。反應體系中，固相Ab（Ag）和酶標Ag（Ab）是固定限量的，且前者的結合位點少于酶標記與非標記Ag（Ab）的分子數量和。反應后，結合與固相載體上復合物中被測定的酶標Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標記Ag（Ab）的濃度成反比。來自中國最大的資料庫下載

特點：來自中國最大的資料庫下載714.捕獲法（反向間接法）

主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定?；驹恚?/p>

固相抗IgM待檢標本(IgM)抗原(與特異抗體結合)E酶標抗體底物來自中國最大的資料庫下載

4.捕獲法（反向間接法）固相抗IgM待檢標本(IgM)抗原(72

第三節(jié)膜載體的酶免疫測定固相膜免疫測定與ELISA相類似,其特點是以微孔膜作為固相.標記物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。常用固相膜為硝酸纖維素膜。類型：免疫滲濾試驗：穿流形式免疫層析試驗：橫流形式斑點酶免疫吸附試驗（dot-ELISA）免疫印跡法(Westernblot)來自中國最大的資料庫下載

第三節(jié)膜載體的酶免疫測定來自中國73免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）亦被稱為Westernblot分三個階段進行:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電轉移酶免疫定位

來自中國最大的資料庫下載

免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）74SDS抗原等蛋白樣品經SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）

來自中國最大的資料庫下載

SDS來自中國最大的資料庫下75來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載76電轉移將在凝膠中已經分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1-2A），通電45min轉移即可完成。此分階段分離的蛋白質條帶肉眼仍不可見。來自中國最大的資料庫下載

電轉移來自中國最大的資料庫下載77酶免疫定位將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區(qū)帶染色。陽性反應的條帶清晰可辨，并可根據SDA加入的分子量標準，確定各組分的分子量。來自中國最大的資料庫下載

酶免疫定位來自中國最大的資料庫下載78來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載79來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載80第四節(jié)酶免疫測定的應用來自中國最大的資料庫下載

第四節(jié)酶免疫測定的應用來自中國最大81病原體及其抗體廣泛應用于傳染病的診斷。病毒如肝炎病毒、風疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細菌如鏈球菌、結核分枝桿菌、幽門螺桿菌和布氏桿菌等；寄生蟲如弓形體、阿米巴、瘧原蟲等。蛋白質如各種免疫球蛋白、補體組分、腫瘤標志物（例如AFP、CEA、PSA）、多種血漿蛋白質、同工酶、激素（如HCG、TSH）。非肽類激素如T3、T4、雌激素、皮質醇等。藥物和毒品如地高辛、苯巴比妥、慶大霉素、嗎啡等。

來自中國最大的資料庫下載

病原體及其抗體廣泛應用于傳染病的診斷。病毒如肝炎病毒、風疹病82ABC-ELISA(應用親和素和生物素的ELISA)來自中國最大的資料庫下載

ABC-ELISA來自中國最大的資料83生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)，是70年代后期應用于免疫學，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應，并與熒光素、酶、同位素等免疫標記技術有機地結合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。來自中國最大的資料庫下載

生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidin84親和素是一種糖蛋白，可以和4個生物素分子親密結合?，F在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）。卵黃、肝組織提取用化學方法制成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）。末端羧基可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。來自中國最大的資料庫下載

親和素是一種糖蛋白，可以和4個生物素分子親密結合?，F在使用更85

親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。來自中國最大的資料庫下載

親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和86橋聯法ABC-ELISA（avidinbiotincomplex-ELISA）夾心法測抗原的過程來自中國最大的資料庫下載

橋聯法ABC-ELISA（avidinbiotincompl87廣泛應用于生物醫(yī)學實驗研究的各個領域，既可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質用于上述各類反應體系中反應物的分離、純化。

來自中國最大的資料庫下載

廣泛應用于生物醫(yī)學實驗研究的各個領域，既可用于微量88標記免疫技術醫(yī)學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室二OO四年三月標記免疫技術89標記免疫技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術+標記技術來自中國最大的資料庫下載

標記免疫技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術90標記免疫技術免疫測定技術免疫組化技術示蹤物及標記技術放射免疫技術熒光免疫技術酶免疫技術化學發(fā)光技術金免疫技術???來自中國最大的資料庫下載

標記免疫技術免疫測定技術免疫組化技術示蹤物及放射免疫技術來自91第八章放射免疫技術

類型：放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術還包括放射受體分析（使用受體測量抗原）和放射配體結合分析（使用配體研究受體）。特點:靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強、重復性好等來自中國最大的資料庫下載

第八章放射免疫技術來自中國最大的資92標記物:常用的核素有兩大類γ射線：131I、125I、57Cr和60Coβ射線：14C、3H和32P。使用最廣泛的是：125I①性質活潑、易制備標記物②對被標記物的免疫活性影響?、蹨y量方法簡便、已推廣④半衰期較長、核素豐度高來自中國最大的資料庫下載

標記物:來自中國最大的資料庫下載93標記方法125I的標記原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子方法：直接標記法

氯胺T法和乳過氧化物酶法間接標記法

聯接標記法來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載94適用分子原理特點缺點直接標記肽類、蛋白質、酶存在酪氨酸、組胺殘基等基團操作簡便、易標記、比放射性高不適于活性功能區(qū)的殘基標記間接標記甾類化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、組胺殘基等基團,需添加可避免氧化／還原劑對被標記物活性的損傷等添加基團可能影響被標記物活性來自中國最大的資料庫下載

適用分子原理特點缺點直接標記肽類、蛋白質、酶存在酪氨酸、組胺95標記物純化

對游離的125I等試劑與標記物進行分離方法：分子篩凝膠過濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）；高效液相色譜（HPLC）來自中國最大的資料庫下載

標記物純化來自中國最大的資料庫下載96標記物鑒定放射化學純度

單位標記物中結合在被標記物上的放射性占總放射性的百分率。一般要求大于95％。免疫活性

標記過程中，被標記物活性損傷程度。B/T％>80％，B/T％↑抗原損傷↓。比放射性

單位化學量標記物中所含的放射性強度.常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等單位表示。比放射性↑方法更靈敏；過高輻射自損傷大，對標記物免疫活性影響大，儲存穩(wěn)定性差。來自中國最大的資料庫下載

標記物鑒定來自中國最大的資料庫下載97抗血清鑒定多克隆抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑之一，其質量直接影響方法的特異性和靈敏度。親合力選用親和常數K值大(109~1012L//mol)抗血清特異性其程度可直接影響結果的準確性

滴度最大稀釋度。在本技術方法中是指結合50％標記抗原時的抗血清的稀釋度。來自中國最大的資料庫下載

抗血清鑒定來自中國最大的資料庫下載98放射免疫分析（RIA）基本原理

采用定量的標記抗原（Ag＋）和非標記抗原（Ag）競爭性結合有限量特異性抗體（Ab）的反應。來自中國最大的資料庫下載

放射免疫分析（RIA）來自中國最大99來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載100來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載101以未結合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F與Ag的量變存在著函數關系。B/F60(％)50403020

10

0.81.62.43.24.04.85.6Ag(ng/ml)來自中國最大的資料庫下載

以未結合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F與102測定方法與步驟1.抗原抗體反應：平衡法或非平衡法2.分離結合與游離標記物沉淀劑沉淀復合物，離心分離。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分離徹底，迅速；分離試劑和過程不影響反應平衡；操作簡便，重復性好且經濟。3.放射性測定及數據處理晶體閃爍計數儀(γ射線)或液體閃爍計數儀(β射線)繪制標準曲線，計算待檢抗原濃度。來自中國最大的資料庫下載

測定方法與步驟來自中國最大的資料庫下載103免疫放射分析（IRMA）基本原理

單位點IRMA：利用過量標記抗體與待測抗原進行反應，形成抗原抗體復合物，反應平衡后，用固相抗原結合反應液中剩余的未結合標記抗體并將其分離，測定上清液的放射量。來自中國最大的資料庫下載

免疫放射分析（IRMA）來自中國最大的104來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載105雙位點IRMA先用固相抗體與抗原反應結合,然后再用過量的標記抗體與已結合于固相抗原的另一抗原決定簇結合,形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物,洗棄反應液中剩余的標記抗體,測定固相上的放射性。來自中國最大的資料庫下載

雙位點IRMA先用固相抗體與抗原反應結合,然后再用過量106來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載107IRMA與RIA的異同點

標記物

在RIA中核素標記抗原，抗原有不同種類，根據其化學結構，標記時需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中核素標記抗體?？贵w為蛋白質，有利于碘化標記，不同抗體標記方法基本相同。標記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。反應速率反應速度與反應物的濃度呈正比，在IRMA中標記抗體是過量的，而且不存在競爭性結合復雜的反應，所以反應速度較RIA快。在RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在IRMA中應用親和力較低的單克隆體也能得到滿意的結果。來自中國最大的資料庫下載

IRMA與RIA的異同點來自中國最大108反應原理

RIA為競爭抑制，測得放射性的量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競爭結合，劑量反應曲線為正相關的直線關系。特異性

在雙位點IRMA中，一般均應用針對不同位點的單克隆抗體，其交叉反應率低于應用多克隆抗體的RIA。檢測范圍

通常RIA的工作范圍為2-3個數量級，而RIMA可達3個數量級以上。來自中國最大的資料庫下載

反應原理RIA為競爭抑制，測得放射性的量與受檢抗原呈反109分析誤差RIA中加入的抗體和標記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴重影響測定結果。IRMA中標記和固相抗體在反應中都是過量的，只有受檢標本的加樣誤差才會影響分析結果。因此，IRMA的批內和批間變異均比較小。其他RIA可以測定大分子量與小分子量的物質，雙位點IRMA只能測定在分子上具有2個以上抗原表位的物質。在RIA中應用的為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量很少。IRMA中標記抗體和固相抗體用量較多，一般均用來源豐富、特異性較高的單克隆抗體。

來自中國最大的資料庫下載

分析誤差RIA中加入的抗體和標記抗原都是定量的，加樣誤110放射免疫技術的應用常用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標志物和藥物等微量物質的測定。問題：放射性污染、常用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定期不長不易自動化儀器分析等。來自中國最大的資料庫下載

放射免疫技術的應用來自中國最大的資料庫111第九章免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescencetechnique)是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。

是將抗原抗體反應的特異性與熒光物質檢測的敏感性和直觀性結合起來的一種方法。

來自中國最大的資料庫下載

第九章免疫熒光技術來自中國最大的資112基本原理利用熒光素標記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標本中的待檢抗原特異結合，采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，使結合在標本上的熒光素被激發(fā)而產生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。來自中國最大的資料庫下載

基本原理來自中國最大的資料庫下載113第一節(jié)熒光的基本知識來自中國最大的資料庫下載

第一節(jié)熒光的基本知識來自中國最大的資114異硫氰酸熒光素（FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，分子量為389.4，最大吸收光波長為490-495nm，最大發(fā)射光波長520-530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，是應用最廣泛的熒光素。主要優(yōu)點：①人眼對黃綠色較為敏感；②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色，降低背景干擾

。來自中國最大的資料庫下載

異硫氰酸熒光素（FITC）來自中國最大115來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載116四乙基羅丹明（RB200）

為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595－600nm，呈橘紅色熒光。常用于雙重標記或對比染色。

來自中國最大的資料庫下載

四乙基羅丹明（RB200）來自中國最大117四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）

最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。

來自中國最大的資料庫下載

四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）來自118

熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，一些化合物對熒光有猝滅作用，因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。來自中國最大的資料庫下載

熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝119熒光抗體的制備作為標記的熒光素應符合以下要求：

①應具有能與蛋白質分子形成共價健的化學基團，與蛋白質結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產物易于清除。②熒光效率高,與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。④與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質，與蛋白質的結合物穩(wěn)定，易于保存。

⑤標記方法簡單、安全無毒。來自中國最大的資料庫下載

熒光抗體的制備來自中國最大的資料庫下載120熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學方式共價結合而成。

標記方法：攪拌法(適合大樣品)透析法(適合小樣品)標記抗體的純化：透析法層析分離法

來自中國最大的資料庫下載

熒光抗體是將熒光素（如FITC）與特異性抗體以化學方式共價結121熒光抗體的鑒定F/P比率：將制備的熒光抗體稀釋至A280≈1.0，分別測讀A280（蛋白質特異吸收峰）和標記熒光素的特異吸收峰來自中國最大的資料庫下載

熒光抗體的鑒定F/P比率：來自中國最大122F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細胞染色的以F/P＝2.4為宜。

來自中國最大的資料庫下載

F/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一123抗體效價：效價越大標記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價在1:16-1:32者較為理想抗體特異性：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強烈熒光來自中國最大的資料庫下載

抗體效價：效價越大標記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價在124第二節(jié)免疫熒光顯微技術基本原理：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。

來自中國最大的資料庫下載

第二節(jié)免疫熒光顯微技術來自中國最大125直接法

熒光抗體染色來自中國最大的資料庫下載

直接法熒光抗體染色來自中國最大的資料126直接法優(yōu)點：操作簡便、特異性高、非特異熒光染色因素少，缺點：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應的特異熒光抗體來自中國最大的資料庫下載

直接法來自中國最大的資料庫下載127間接法

來自中國最大的資料庫下載

間接法來自中國最大的資料庫下載128間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。來自中國最大的資料庫下載

間接法來自中國最大的資料庫下載129免疫熒光技術在醫(yī)學檢驗中的應用在細菌學檢驗中主要用于菌種的鑒定。免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測是梅毒特異性診斷常用方法之一。用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。在寄生蟲感染診斷中，間接免疫熒光試驗（IFAT）是當前公認的最有效的檢測瘧疾抗體的方法。來自中國最大的資料庫下載

免疫熒光技術在醫(yī)學檢驗中的應用來自中國130免疫熒光法還是檢測自身抗體的好工具，在自身免疫病的實驗診斷中應用廣泛。其突出優(yōu)點是能以簡單方法同時檢測抗體和與抗體起特異反應的組織成分，并能在同一組織中同時檢查抗不同組織成分的抗體。熒光抗體技術的一種特殊應用是流式細胞分析（flowcytometry）?？捎糜跈z測細胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于T細胞亞群等的檢測。來自中國最大的資料庫下載

免疫熒光法還是檢測自身抗體的好工具，在自身免疫病的實驗診斷中131第十章酶免疫技術

來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載132第一節(jié)酶免疫技術概述基本原理利用酶催化底物反應的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學反應的檢測敏感性的一種標記免疫技術。

來自中國最大的資料庫下載

第一節(jié)酶免疫技術概述來自中國最大的資133基本特點：①標記后保留酶和抗原(抗體)的活性②酶促反應專一性，保證特異性③底物反應放大作用，提高敏感性④酶標試劑保存穩(wěn)定⑤操作簡便，安全易行來自中國最大的資料庫下載

基本特點：來自中國最大的資料庫下載134主要試劑的制備與要求來自中國最大的資料庫下載

主要試劑的制備與要求來自中國最大的資料135一、酶與酶作用底物（一）用于標記酶的要求：酶活性高標記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標記抗原與抗體的免疫反應性酶催化底物后信號易判定或測定酶活性不受樣品中其他成分的影響酶、輔助因子及底物理化性質穩(wěn)定，安全無害，價廉來自中國最大的資料庫下載

一、酶與酶作用底物來自中國最大的資料庫136（二）常用酶及其底物1.辣根過氧化物酶（HRP）常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應顯橙黃色，應避光，致癌性四甲基聯苯胺（TMB）：反應后呈藍色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。來自中國最大的資料庫下載

（二）常用酶及其底物來自中國最大的資料137來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載1382.堿性磷酸酶（AP）

常用底物為對硝基苯磷酸酯（p-NPP），產物為黃色。

*AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標記物收率低于HRP，且價高，故應用不如HRP普及。來自中國最大的資料庫下載

2.堿性磷酸酶（AP）來自中國最大的139二、酶標記抗體或抗原基本要求：酶標記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價高，親和力強，比活性高以及易于批量生產和分離純化來自中國最大的資料庫下載

二、酶標記抗體或抗原來自中國最大的資料140酶標記方法

1.交聯法以雙功能交聯劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結合物。如戊二醛交聯法。2.直接法

用過碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標記物制備。來自中國最大的資料庫下載

酶標記方法來自中國最大的資料庫下載141三、固相載體基本要求結合容量高，結合穩(wěn)定；可與抗原抗體復合物等大分子蛋白結合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡便易行、快捷經濟。來自中國最大的資料庫下載

三、固相載體來自中國最大的資料庫下載142固相載體的種類與選擇1.塑料制品材料經濟，操作簡便，易于自動化，最常用。2.微顆粒結合容量大，反應迅速，逐漸普遍用于自動化分析。3.膜載體硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜等微孔濾膜，廣泛應用于定性或半定量的斑點ELISA。來自中國最大的資料庫下載

固相載體的種類與選擇來自中國最大的資料143四、免疫吸附劑原理：非共價鍵吸附或共價鍵化學偶聯（包被）。一般采用偏堿性（pH9.6）的碳酸鹽溶液（ELISA板）。封閉：1％－5％牛血清白蛋白或5％－20％小牛血清。來自中國最大的資料庫下載

四、免疫吸附劑來自中國最大的資料庫下載144酶免疫技術的分類

酶免疫組化用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原和抗體

酶免疫技術均相酶免疫測定酶免疫測定固相酶免疫測定異相酶免疫測定（ELISA）液相酶免疫測定來自中國最大的資料庫下載

酶免疫技術的分類來自中國最大的資料庫145均相酶免疫測定Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E基本原理：利用酶標抗體結合抗原形成復合物后，標記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復合物與游離酶標抗體分離的情況下，直接測定系統(tǒng)中總的標記酶活性的改變，進而推算出待檢樣品中的抗原量。來自中國最大的資料庫下載

均相酶免疫測定Ag+Ab-EAgAb-E146異相酶免疫測定（enzymeimmunoassay,EIA）基本原理：在抗原抗體反應后，先將抗原抗體復合物與游離的酶標抗體分離，再測定酶標記的復合物催化底物顯色的活性，最后推算出樣品中抗原的含量。液相EIA：分離劑分離游離的和結合的標記物。固相EIA：固相載體結合酶標復合物，經洗滌去除游離的酶標抗體。如ELISA。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E來自中國最大的資料庫下載

異相酶免疫測定（enzymeimmunoassay,EIA）147

第二節(jié)酶聯免疫吸附試驗enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)

來自中國最大的資料庫下載

第二節(jié)酶聯免疫吸附試驗來自中國最大148基本原理：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應來自中國最大的資料庫下載

基本原理：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活149用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析來自中國最大的資料庫下載

用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，150ELISA技術類型：

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體，在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，酶作用的底物。來自中國最大的資料庫下載

ELISA技術類型：ELISA可用于測定抗原，也可用于測定151來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載1521．雙抗體夾心法

來自中國最大的資料庫下載

1．雙抗體夾心法來自中國最大的資料庫153來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載154特點：非競爭結合反應常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇

來自中國最大的資料庫下載

特點：來自中國最大的資料庫下載1552．間接法

來自中國最大的資料庫下載

2．間接法來自中國最大的資料庫下載156來自中國最大的資料庫下載

來自中國最大的資料庫下載1573.競爭法

來自中國最大的資料庫下載

3.競爭法來自中國最大的資料庫下載158特點：用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進行測定。酶標Ag（Ab）與樣品或標準品中的非標記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結合的能力。反應體系中，固相Ab（Ag）和酶標Ag（Ab）是固