揚(yáng)州大學(xué)《現(xiàn)代分子生物學(xué)》 分子生物學(xué)方法

第五章分子生物學(xué)研究方法5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史5.2DNA操作技術(shù)5.3基因克隆技術(shù)5.4基因表達(dá)研究技術(shù)5.5蛋白質(zhì)組學(xué)及研究技術(shù)5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史40年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制，解決了基因的自我復(fù)制和遺傳信息傳遞問題。50年代末和60年代提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。

5.1.1重組DNA技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ)5.1.2關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)技術(shù)問世為重組DNA技術(shù)奠基

1、DNA分子的切割與連接技術(shù)限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，才使分子生物學(xué)家有了進(jìn)行DNA操作的基本工具。2、載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細(xì)胞經(jīng)過氯化鈣適當(dāng)處理之后，便能吸收λ噬菌體的DNA。1972年美國斯坦福大學(xué)S.Cohen報道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒DNA。大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立，對重組DNA技術(shù)的創(chuàng)立具有特別重要的意義。3、Southern雜交、DNA序列分析和聚合酶鏈反應(yīng)5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnique):是按照人們意愿，在體外對DNA分子進(jìn)行重組,再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA的大量拷貝。基因克隆(genecloning)分子克隆(molecularcloning)5.1.3重組DNA技術(shù)的概念5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史5.1.4重組DNA技術(shù)的基本步驟1、四大要素

①外源基因②載體③工具酶④受體細(xì)胞

5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史2、重組DNA技術(shù)的基本步驟

①目的基因的獲得與載體的制備②目的基因與載體DNA的連接③重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞④重組體的篩選與重組DNA的鑒定⑤克隆基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測與分離純化5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史5.1.5重組DNA技術(shù)的意義重組DNA技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝重組DNA技術(shù)縮短了進(jìn)化時間重組DNA技術(shù)使人能對生物進(jìn)行定向改造體外大量擴(kuò)增、研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制，從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域，這對醫(yī)學(xué)上各種疾病等病因的查明、診斷及治療具有重大意義。5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史酶類功能限制性核酸內(nèi)切酶識別并在特定位點(diǎn)切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶Ⅰ按5‘到3’方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNA雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5’-OH末端末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的3‘末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶Ⅲ從DNA鏈的3’末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5’末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5’或3’末端的磷酸基團(tuán)5.1.6重組DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史限制性核酸內(nèi)切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶分類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）5.1、重組DNA技術(shù)發(fā)展史第一個字母母取自產(chǎn)生生該酶的細(xì)細(xì)菌屬名，，用大寫；；第二、第三三個字母是是該細(xì)菌的的種名，用用小寫；第四個字母母代表株；；用羅馬數(shù)字字表示發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的先后次次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿桿菌d株的第三種種酶5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史Ⅱ類酶識別別序列特點(diǎn)點(diǎn)——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)即反相重復(fù)復(fù)結(jié)構(gòu)，是是DNA分子子中以某一一處為軸，，其兩側(cè)核核苷酸排列列呈回文對對稱的序列列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史DNA連接接酶:通通過磷酸酸二酯鍵把把兩個或多多個DNA片斷連接接成一個整整體DNA分子。T4ˉDNA連接接酶EcoRI連接接酶T7ˉDNA連接接酶5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史目的基因的的來源原核細(xì)胞真核細(xì)胞：：cDNA或或gDNA文庫人工合成及及PCR擴(kuò)擴(kuò)增目的基基因天然DNA（染色體DNA、病病毒DNA(噬菌體體DNA)、質(zhì)粒DNA、線線粒體DNA和葉綠綠體DNA）5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史（八）重組組實(shí)驗(yàn)中的的主要載體體定義：為攜帶目的的基因，實(shí)實(shí)現(xiàn)其無性性繁殖或表表達(dá)有意義義的蛋白質(zhì)質(zhì)所采用的的一些DNA分子。。5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史克隆載體(cloningvector)為使插入的的外源DNA序列被被擴(kuò)增而特特意設(shè)計(jì)的的載體稱為為克隆載體體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的的外源DNA序列可可轉(zhuǎn)錄翻譯譯成多肽鏈鏈而特意設(shè)設(shè)計(jì)的載體體稱為表達(dá)達(dá)載體。5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史載體的選擇擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制制；具有兩個以以上的遺傳標(biāo)記物，便于重重組體的篩篩選和鑒定定；有克隆位點(diǎn)點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)點(diǎn)），常具具有多個單單一酶切位位點(diǎn)，稱為為多克隆位位點(diǎn)；分子量小，，以容納較較大的外源源DNA。。5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史噬菌體載體體：雙鏈DNA病毒，約約50kb,兩端有有一個12個核苷酸酸5′端突出粘粘性末端λ噬菌體黏粒、YAC、BAC：高容量載體體5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史個克隆載體體所容納的的外原DNA片段的的大小質(zhì)粒：10kbλ噬菌體：：23kb黏粒：45kbBAC：350kbYAC：1000kb5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程5.1重重組DNA技術(shù)發(fā)發(fā)展史5.2.1細(xì)菌菌轉(zhuǎn)化5.2常常見的DNA操作作技術(shù)轉(zhuǎn)化（transformation）：P151感受態(tài)細(xì)胞胞（Competentcells）：受體細(xì)胞經(jīng)經(jīng)過一些特特殊方法（（如：CaCl2等化學(xué)試劑劑法）的處處理后，細(xì)細(xì)胞膜的通通透性發(fā)生生變化，能能容許有外外源DNA的載體分分子通過，，處于這種種狀態(tài)下的的細(xì)胞稱~將異源DNA分子引引入一細(xì)胞胞株系，使使受體細(xì)胞胞獲得新的的遺傳性狀狀轉(zhuǎn)導(dǎo)？轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染？常用的轉(zhuǎn)化化方法：化學(xué)轉(zhuǎn)化（（CaCl2）法電擊法5.2常常見的DNA操作作技術(shù)化學(xué)轉(zhuǎn)化原原理：在0℃冷凍凍處理時，，處于CaCl2低滲溶液液中的大腸腸桿菌細(xì)胞膨脹脹成球形。。DNA可可吸附于其其表面。在在短暫的熱沖擊下，，細(xì)胞吸收收外源DNA，然然后在豐富富培養(yǎng)基內(nèi)內(nèi)復(fù)原并增殖殖，表達(dá)外外源基因。。5.2常常見的DNA操作作技術(shù)5.2常常見的DNA操作作技術(shù)P1535.2常常見的DNA操作作技術(shù)電擊轉(zhuǎn)化：：使用低鹽緩緩沖液或水水洗制備的的感受態(tài)細(xì)細(xì)胞，通過過高壓脈沖的的作用將載載體DNA分子導(dǎo)入入受體細(xì)胞胞。菌液：生長長對數(shù)期場強(qiáng)(最大大轉(zhuǎn)化效率率)：12.5-15kV/cm溫度：0-4℃5.2常常見的DNA操作作技術(shù)克隆的篩選選：抗生素基因因。常用的抗生生素有：氨氨芐青霉素素、卡那霉霉素、氯霉霉素、四環(huán)環(huán)素、鏈霉霉素等-互補(bǔ)藍(lán)白斑斑篩選營養(yǎng)條件（（自養(yǎng)、異異養(yǎng)）5.2常常見的DNA操作作技術(shù)-互補(bǔ)篩篩選5.2常常見的DNA操作作技術(shù)β-半乳糖糖苷酶基因因（LacZ）的調(diào)調(diào)控序列和和氨基端（（N端）146個氨氨基酸編碼碼序列的質(zhì)質(zhì)粒編碼β-半半乳糖苷酶酶羧基端（（C端）部部分序列的的宿主細(xì)胞胞IPTG/X-gal的培養(yǎng)養(yǎng)基上篩選選藍(lán)白斑藍(lán)白斑篩選選LacZ,IPTGX-galX+gal（白色）（（藍(lán)色））LacZ（失活））,IPTGX-galX-gal（白色）（（白色色）5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)藍(lán)白斑5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)轉(zhuǎn)化率的計(jì)計(jì)算：轉(zhuǎn)化體總數(shù)數(shù)＝菌落數(shù)數(shù)×（轉(zhuǎn)化化反應(yīng)原液液總體積/涂板菌液液體積）插入頻率＝＝白色菌落落數(shù)/藍(lán)色色菌落數(shù)+白色菌落落數(shù)轉(zhuǎn)化頻率＝＝轉(zhuǎn)化體總總數(shù)/加入入質(zhì)粒DNA的量（（計(jì)算出每每微克的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化菌落數(shù)數(shù)）5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)5.2.2聚合酶酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng)（PCR）技術(shù)1985年年，K.Mullis等研究究成功的一一種在體外外快速擴(kuò)增增特定基因因DNA序序列的方法法原理：類似于天天然的DNA復(fù)制過過程。將待待擴(kuò)增的DNA片段段和兩側(cè)互互補(bǔ)的兩段段寡核苷酸酸引物，經(jīng)經(jīng)過變性，，退火和延延伸若干個個循環(huán)后，，DNA擴(kuò)擴(kuò)增倍數(shù)可可達(dá)2n倍5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)反應(yīng)體系模板DNA：待擴(kuò)增的目目的片段特異性引物物：人工合成的的與待擴(kuò)增增的靶DNA兩端序序列互補(bǔ)的的寡核苷酸酸片段，15-30bpDNA聚合合酶dNTP含有Mg2+的緩沖液5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)PCR的基基本反應(yīng)步步驟：1.變性：95℃，，模板DNA變性性為單鏈；；2.退火：50℃左左右，使引引物與模板板DNA退退火結(jié)合；；3.延伸：72℃，，DNA聚合酶以以dNTP為底物催催化DNA的合合成反應(yīng)。。上述三個步步驟為一個個循環(huán)，經(jīng)經(jīng)25-30次循環(huán)后，可將將模板DNA擴(kuò)增達(dá)達(dá)百萬倍。。5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)PCR技術(shù)術(shù)在基因克克隆方面的的應(yīng)用（1）目的基因因的直接克克隆，（2）通過過RT-PCR進(jìn)行行cDNA的克??；；（3）制備備DNA探探針，進(jìn)行行分子檢測測等。5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)5.2.3cDNA文庫cDNA文文庫(complementaryDNAlibrary)以組織細(xì)細(xì)胞中的mRNA為為模板，反反轉(zhuǎn)錄合成成雙鏈cDNA，，各cDNA分子分分別插入載載體形成重重組子，再再導(dǎo)入宿主主細(xì)胞克隆隆擴(kuò)增。這這些在重組組體內(nèi)的cDNA的的集合即cDNA文文庫。5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)構(gòu)建步驟：：1、高質(zhì)量量mRNA制備：純純化試劑盒盒，生物素素P1562、反轉(zhuǎn)錄錄生成cDNA:反反轉(zhuǎn)錄酶酶，olig(dt),R63、與噬菌菌體載體分分子連接4、噬菌體體的包裝5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)文庫中篩選選目的基因因DNA探針針：帶有特殊殊堿基序列列的單鏈DNA或RNA分子子,可以用用放射性物物質(zhì)或免疫疫性物質(zhì)標(biāo)標(biāo)記,通過過雜交,DNA探針常用于檢測測互補(bǔ)的堿堿基序列。。5.2常常見的的DNA操操作技術(shù)5.2.3SNP技技術(shù)應(yīng)用（singlenucleotidepolymorphism）單單核苷酸多多態(tài)性，指指基因組DNA序列列中由于單單個核苷酸酸的突變而而引起的多多態(tài)性一個SNP表示在基基因組某個個位點(diǎn)上有有一個核苷苷酸的變化化，源于單單個堿基的的轉(zhuǎn)換或顛顛換應(yīng)用用：：遺遺傳傳病病研研究究、、動動植植物物遺遺傳傳育育種種5.2常常見見的的DNA操操作作技技術(shù)術(shù)5.2.4基基因因敲敲除除技技術(shù)術(shù)（（geneknock-out））通過過一一定定的的途途徑徑使使特特定定的的基基因因失失活活或或缺缺失失的的技技術(shù)術(shù)。。通通常常意意義義上上的的基基因因敲敲除除主主要要是是應(yīng)應(yīng)用用DNA同同源源重重組組原原理理，，用用同同源源片片段段替替代代靶靶基基因因片片段段，，進(jìn)進(jìn)行行精精確確的的定定位位修修飾飾和和基基因因改改造造，，同同染染色色體體一一起起穩(wěn)穩(wěn)定定遺遺傳傳二、、常常見見的的DNA操操作作技技術(shù)術(shù)完全全基基因因敲敲除除條件件型型基基因因敲敲除除植物物基基因因敲敲除除株株系系篩篩選選（（T-DNA插插入入失失活活））5.2常常見見的的DNA操操作作技技術(shù)術(shù)5.3基基因因克克隆隆技技術(shù)術(shù)簡簡介介5.3.1RACE(rapidamplificationofcDNAends)一種種通通過過PCR進(jìn)進(jìn)行行cDNA末末端端快快速速克克隆隆的的技技術(shù)術(shù)，，是是以以mRNA為為模模板板反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄成成cDNA第第一一鏈鏈后后用用PCR技技術(shù)術(shù)擴(kuò)擴(kuò)增增出出某某個個特特異異位位點(diǎn)點(diǎn)到到3′或5′端之之間間未未知知序序列列的的方方法法。。mRNA的的獲獲取取去磷磷酸酸化化加寡寡聚聚接接頭頭（（5′′））反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄合合成成第第一一條條cDNA5′′RACE，，擴(kuò)擴(kuò)增增5未未知知序序列列3′′RACE擴(kuò)擴(kuò)增增3′未知知序序列列5′′已已知知的的接接頭頭序序列列；；基因因特特異異反反向向序序列列3′′寡寡聚聚dT下下游游序序列列；；基因因特特異異反反向向序序列列5.3基基因因克克隆隆技技術(shù)術(shù)簡簡介介5.3.1cDNA差差示示分分析析法法(cDNA-RDA法法)差減減雜雜交交與與RT-PCR方方法法相相結(jié)結(jié)合合，，通通過過降降低低cDNA群群體體復(fù)復(fù)雜雜性性和和更更換換cDNA兩兩端端接接頭頭等等方方法法，，特特異異擴(kuò)擴(kuò)增增目目的的基基因因片片段段5.3基基因因克克隆隆技技術(shù)術(shù)簡簡介介5.3基基因因克克隆隆技技術(shù)術(shù)簡簡介介主要要步步驟驟是是：：mRNA逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄為為cDNA，，用用4堿堿基基識識別別酶酶消消化化，，與與接接頭頭1連連接接，，PCR擴(kuò)擴(kuò)增增；；去去除除接接頭頭1，，擴(kuò)擴(kuò)增增子子接接上上接接頭頭2，，與與驅(qū)驅(qū)逐逐子子雜雜交交，，PCR擴(kuò)擴(kuò)增增；；去去除除接接頭頭2，，加加上上接接頭頭3，，再再與與driver雜雜交交，，再再擴(kuò)擴(kuò)增增，，篩篩選選出出目目的的片片段段、、克克隆隆、、測測序序。。5.3.3酵酵母母雙雙雜雜交交體體系系（（Yeasttow-hybridsystem））基于于對對真真核核生生物物調(diào)調(diào)控控轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄起起始始過過程程的的認(rèn)認(rèn)識識，，高高靈靈敏敏度度的的研研究究蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)之之間間關(guān)關(guān)系系的的技技術(shù)術(shù)。。。。細(xì)胞胞起起始始基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄需需要要有有反反式式轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄激激活活因因子子的的參參與與。。反式式轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄激激活活因因子子GAL4：：DNA結(jié)結(jié)合合功功能能域域(DNAbindingdomain,DNA-BD)轉(zhuǎn)錄錄激激活活結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)域域（（activationdomain，，DNA-AD））被分分開開的的兩兩者者通通過過適適當(dāng)當(dāng)?shù)牡耐就緩綇皆谠诳湛臻g間上上較較為為接接近近時時，，才才能能重重新新呈呈現(xiàn)現(xiàn)完完整整的的GAL4轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄因因子子活活性性，，并并可可激激活活上上游游激激活活序序列列（（upstreamactivatingsequence,UAS））的的下下游游啟啟動動子子，，使使下下游游基基因因得得到到轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄。。5.3基基因因克克隆隆技技術(shù)術(shù)簡簡介介5.3基基因因克克隆隆技技術(shù)術(shù)簡簡介介主要要實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)過過程程：：a.選選擇擇缺缺失失GAL4編編碼碼基基因因的的酵酵母母寄寄主主菌菌株株b.研研究究的的獵獵物物(或或稱稱靶靶蛋蛋白白)蛋蛋白白的的基基因因與與編編碼碼AD的的序序列列結(jié)結(jié)合合c.誘誘餌餌(bait)蛋蛋白白的的基基因因與與編編碼碼BD的的序序列列結(jié)結(jié)合合,形形成成兩兩段段融融合合基基因因d.將將共共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化的的酵酵母母菌菌株株涂涂布布于于選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上，，篩篩選選表表達(dá)達(dá)相相互互作作用用的的雜雜種種蛋蛋白白（（激激活活報報告告基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄））的的陽陽性性菌菌落落。。5.3基基因因克克隆隆技技術(shù)術(shù)簡簡介介酵母母雙雙雜雜交交系系統(tǒng)統(tǒng)的的應(yīng)應(yīng)用用：：發(fā)現(xiàn)現(xiàn)新新蛋蛋白白和和蛋蛋白白的的新新功功能能研究究抗抗原原和和抗抗體體的的作作用用（（細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)））篩選選藥藥物物的的作作用用位位點(diǎn)點(diǎn)建立立基基因因組組蛋蛋白白連連鎖鎖圖圖5.3基基因因克克隆隆技技術(shù)術(shù)簡簡介介1986年年提提出出，，根根據(jù)據(jù)目目的的基基因因在在染染色色體體上上的的位位置置進(jìn)進(jìn)行行的的，，無無需需預(yù)預(yù)先先知知道道基基因因的的DNA順順序序，，也也無無需需預(yù)預(yù)先先知知道道其其表表達(dá)達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物物的的有有關(guān)關(guān)信信息息，，但但必必須須建建立立遺遺傳傳