植物彗星實(shí)驗(yàn)及其在生態(tài)毒理監(jiān)測中的應(yīng)用

2009年第4卷生態(tài)毒理學(xué)報(bào)v01.4,2009第2期,183—189AsianJournalofEcotoxicologyNo.2,183—189植物彗星實(shí)驗(yàn)及其在生態(tài)毒理監(jiān)測中的應(yīng)用曹玉偉,馬軍,郭長虹‘,李蕊,余建平呤爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,哈爾濱150025摘要:植物彗星實(shí)(Cometassay是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測DNA損傷的新技術(shù),具有快速、簡便、靈敏性高和可靠性強(qiáng)等特點(diǎn).本文總結(jié)了近年來國內(nèi)外植物彗星實(shí)驗(yàn)的研究成果,詳細(xì)介紹了植物彗星實(shí)驗(yàn)方法及其在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用.關(guān)鍵詞:植物彗星實(shí)驗(yàn);DNA損傷;環(huán)境污染;生態(tài)毒理文章縮號:1673—5897(20092—183—07中圈分類號:X502文簟標(biāo)識碼:APlantCometAssayandItsApplicationonEnvironmentPollutionMonitoringCAOYu-wei,MAJun,GUOChang—hong。,LIRui,YUJian-pingCollegeofLifeScienceandBiotechnology。HarbinNormalUniversity,Harbin150025Received5September2008accepted7October2008Abstract:PlantcometassayisalleWtechniquedevelopedinrecentyearstodetectingDNAdamagL舅;.Plantco嘣assayhascharacteristicsofquickresponseandsensitivity.ThispapersummarizedthelatestresearchresultsabouttheplantCOIIIetassayathomeandabroad,anddescribedindetailaboutthemethodanditsapplicationinecotoxicology.Keywords:plantcometassay;DNAdamage;environmentalpollution;ecotoxicology基金項(xiàng)目:國家科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.2006BA618A;黑龍江省科技攻關(guān)松花江水污染應(yīng)急科技專項(xiàng);哈爾濱師范大學(xué)骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(No.KG2006—05;黑龍江省研究生創(chuàng)新科研資金(No.YJSCX3啪8-163mJ作者簡介:曹玉偉(1978一。男,碩士研究生,E—m砌:caoyuweil88@sina.corn;?通訊作者(com印∞dingauthor,E-mall:kaku3008@yahoo.c哪.∞萬方數(shù)據(jù)184生態(tài)毒理學(xué)報(bào)第4卷彗星實(shí)驗(yàn)(Cometassay又稱單細(xì)胞凝膠電泳(SingleCellGelEleOTophoresis,SCGE,是一種在單細(xì)胞水平檢測DNA損傷的技術(shù).該技術(shù)最初由Ostling和Johanson于1984年在Cook、Rydberg和Johanson的方法上進(jìn)行改進(jìn)并建立的.實(shí)驗(yàn)基本過程如下:將細(xì)胞包埋于載玻片上的低熔點(diǎn)瓊脂糖中,經(jīng)高濃度鹽(NaCI和去垢劑(十二烷基硫酸鈉,SDS裂解,抽提細(xì)胞膜脂,破壞核膜和其它細(xì)胞器膜,使膜蛋白、內(nèi)源性蛋白、RNA和其它成分通過凝膠擴(kuò)散到裂解渡中后,置于中性條件下電泳,帶負(fù)電的DNA片斷從細(xì)胞核向陽極移動(dòng),經(jīng)溴化乙錠(EB染色后會(huì)看到類似彗星尾巴形狀,指向陽極,分子量較大的DNA受核骨架和分子量的影響留在原位,形成明亮的“頭部”,出現(xiàn)特有的“彗星”狀圖像,因此稱作“彗星實(shí)驗(yàn)”.此方法使DNA損傷檢出的靈敏度得到提高(Cooketa/.,1976;RydbergandJohanson,1978;OstlingandJohanson,1984.Oliver于1989年又對上述中性彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn),使95%以上的細(xì)胞蛋白質(zhì)被除去,在中性條件下電泳,進(jìn)一步提高了DNA損傷檢出的靈敏度.目前常用的彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要是smgh等在1988年改進(jìn)的彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù),將制備好的凝膠載玻片在堿性(pH>13條件下電泳,該方法能檢測出雙鏈斷裂、單鏈斷裂和堿性不穩(wěn)定位點(diǎn),極大地提高了DNA損傷檢出的靈敏度,而且堿性彗星實(shí)驗(yàn)除了具有快速、簡便、可靠性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)外,還具有樣品用量少、應(yīng)用范圍廣、耗時(shí)短、能夠促使RNA降解、降低RNA干擾等優(yōu)點(diǎn)(sillgheta/.,1988;1989;Navarreteet講.,1997.1996年Kappen首次將彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)引入到植物研究中,利用彗星實(shí)驗(yàn)檢測到遺傳毒性物質(zhì)能夠引起蠶豆根尖DNA雙鏈斷裂(KoppenandVerschaeve。1996.近年來,植物彗星實(shí)驗(yàn)取得了豐碩的成果,先后在蠶豆、煙草、玉米、大麥等植物中取得了成功,并在植物環(huán)境監(jiān)測、污染治理和生態(tài)評估等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用.本文將對植物彗星實(shí)驗(yàn)方法及其在環(huán)境污染檢測中的應(yīng)用作一介紹.1植物彗星實(shí)驗(yàn)方法1.1材料準(zhǔn)備根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮脱芯繉ο?選取飽滿的植物種子,如煙草、小麥、菠菜、蠶豆、玉米、苜蓿等,用10%過氧化氫消毒10min或以70%酒精消毒2min,然后經(jīng)蒸餾水沖洗、浸泡后,放入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中在25℃催芽,期間注意換水(張旭紅等,2006;Gichnereta1.,2006a.根據(jù)研究目的的不同選擇不同的處理方法,如研究重金屬鎘、鋅、銅等對植物葉片和根尖DNA的損傷,需將長勢一致的植株根尖用蒸餾水沖洗干凈后放入含有待處理試劑的Feigin培養(yǎng)液中,也可將長勢一致的植株直接用試劑處理,在26℃溫室中每天光照16小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)(Fcigineta/.,1987;對其它處理試劑如H鷂、甲磺酸乙酯(EMS、除草劑等可直接將發(fā)芽的種子種植到營養(yǎng)成分均衡的土壤中,待植物長出3—5片真葉后,選取大小、長勢一致的幼苗,放人含有遺傳毒性試劑的培養(yǎng)液中處理(幼苗也可以通過組培獲得,根據(jù)處理時(shí)間長短注意更換培養(yǎng)液以保證養(yǎng)分供應(yīng)和處理試劑的濃度(張旭紅等,2006.1.2分離細(xì)胞核酶解法是分離細(xì)胞核常用的方法之一,酶處理后獲得的是植物細(xì)胞的原生質(zhì)體.將植物如蠶豆根尖清洗干凈后,用剪刀剪碎后放人微量離心管中,加入2%的纖維素酶和果膠酶,在28℃恒溫箱中處理3小時(shí),獲得的細(xì)胞懸液可用于彗星實(shí)驗(yàn).不同植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、厚度、壁齡不同,酶解時(shí)同也不同,因此在實(shí)驗(yàn)前需要做預(yù)實(shí)驗(yàn),獲得最佳的酶解時(shí)間,保證獲得完好的細(xì)胞核(Ningeta1.,2002.由于酶解法分離細(xì)胞核所需時(shí)間較長,植物會(huì)修復(fù)部分受損傷的DNA,對實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響,因此人們嘗試采用機(jī)械法分離細(xì)胞核,此方法不僅可以獲得大量實(shí)驗(yàn)需要的完整細(xì)胞核,而且操作簡單、耗時(shí)短,還可以降低植物自身防御修復(fù)系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)的影響(Navarreteeta/.,1997。萬方數(shù)據(jù)第2期曹玉偉等:植物彗星實(shí)驗(yàn)及其在生態(tài)毒理監(jiān)測中的應(yīng)用胞核的目的,此外,操作要在微暗或黃光下進(jìn)行,避免分離過程中造成人為的細(xì)胞核損傷(Gichneret02.,2004.細(xì)胞核懸液密度一般在每個(gè)視野下20—40個(gè)較好,數(shù)目太多,在電泳時(shí)容易產(chǎn)生尾部重疊,太少又不容易拍照觀察.目前的研究多采用溴化乙錠染色,熒光顯微鏡下觀察核是否完整并測量細(xì)胞核直徑,與裂解處理后得到的細(xì)胞核直徑進(jìn)行比較,分析不同處理時(shí)間對核物質(zhì)向周圍擴(kuò)散程度和細(xì)胞核面積大小的影響,這也是最初彗星實(shí)驗(yàn)的分析方法.此外也有學(xué)者采用醋酸洋紅進(jìn)行染色,觀察懸液中細(xì)胞核濃度和完整性.不同緩沖液對不同植物細(xì)胞核的分離效果不同,常用的緩沖液除Tris—HCI外,還有1xPBS、Sorensen等.林愛軍等(2006比較了上述3種緩沖液分離細(xì)胞核的效果,認(rèn)為PBS比較適合分離多數(shù)植物的細(xì)胞核,機(jī)械法和酶解法分離的細(xì)胞核在解旋時(shí)間上不同.酶解獲得的是原生質(zhì)體,細(xì)胞質(zhì)中含有大量蛋白質(zhì)、RNA和葉綠體、線粒體DNA,因此裂解和解旋時(shí)間較長,以便讓蛋白質(zhì)、RNA和更多的葉綠體、線粒體DNA通過凝膠滲入到裂解液中,可以有效降低染色時(shí)產(chǎn)生的背景;而機(jī)械法分離直接獲得細(xì)胞核,排除了以上物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響,裂解和解旋時(shí)間較短或不需要裂解.1.3凝肢制備植物彗星實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)均采用“三明治”瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳.(1將載玻片浸入到PBS配制的1%正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NormalMelting—P0缸Agarose,NMPA中,迅速取出,蓋上蓋玻片并擦去沒有磨砂面瓊脂,或取100tLLNMPA滴加到載玻片上,加蓋蓋玻片,4℃凝固10min或室溫凝固;(2取50止細(xì)胞核懸液和40"Cl%低熔點(diǎn)瓊脂糖(LowMelting—PointAgarose,LMPA50止混合均勻,滴加到第一層凝膠上,加蓋蓋玻片,4℃凝固10min;(3揭去蓋玻片,將100斗L預(yù)熱的0.5%岫滴加到載玻片上,加蓋蓋玻片(Gichneret講.,2006b.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求不同,一些研究將步驟(3省略,采用簡化的兩層凝膠法進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn),使實(shí)驗(yàn)更加簡便.1.4裂解和電泳1。5中和及染色電泳結(jié)束后,用400mmol?L~Tris—HCl反復(fù)沖洗3次,每次5min,濾紙吸干后在每張載玻片上加入30止溴化乙錠(20ttg?L--進(jìn)行染色.染色時(shí)間不宜過長,否則背景顏色加深,影響觀察效果,大多實(shí)驗(yàn)將染色時(shí)間定為5min.1.6彗星觀察及數(shù)據(jù)分析在激發(fā)光546/10nm,濾光片590nm的條件下用熒光顯微鏡觀察(該條件下和溴化乙錠結(jié)合的DNA發(fā)出紅色熒光,以CCD拍照獲取彗星圖像,并用CASP軟件(或其他相關(guān)軟件分析獲取單個(gè)細(xì)胞核彗星實(shí)驗(yàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)(Gichnereta/.,2004.一般對于每張載玻片隨機(jī)選取25個(gè)細(xì)胞核分析測量DNA遷移的各種參數(shù):尾矩、尾部DNA含量、彗尾長度、頭部DNA含量等.尾矩(TailMoment,TM:尾部DNA含量和彗尾長度的乘積,是衡量DNA損傷的基本參數(shù)(Gichnereta1.,2004.尾部DNA含量(TailDNA:真實(shí)反映DNA損傷程度的參數(shù).存在單一變量(DNA損傷物質(zhì)濃度不同,其它條件相同時(shí),DNA損傷越嚴(yán)重,尾部DNA含量越高,頭部DNA含量越低(Gichneret面.。2004.彗尾長度(TailLengOa,TL:在一定程度上反映了DNA損傷程度和DNA斷裂片斷的大小.彗尾長度與實(shí)驗(yàn)者對分析軟件極限值的設(shè)定和選擇萬方數(shù)據(jù)生態(tài)毒理學(xué)報(bào)第4卷分析背景、電泳時(shí)間有關(guān).頭部DNA含量(HeadDNA:電泳后殘留在核骨架內(nèi)的DNA含量.由于片斷較大及受殘余的核骨架作用,部分DNA遷移很慢,電泳結(jié)束時(shí)仍然殘留在核內(nèi).頭部DNA含量越高,說明DNA受到的損傷越小,從而可以從側(cè)面反映DNA損傷情況.植物彗星實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)方法是影響其發(fā)展的難點(diǎn)之一,這些年已經(jīng)有了一些新的發(fā)展.將圖像分析系統(tǒng)引入到彗星實(shí)驗(yàn),為正確、充分地分析彗星圖像提供了可能(Oliveeta1.,1990.彗星分析軟件的出現(xiàn)大大提高了彗星圖像分析的準(zhǔn)確性和客觀性,并減少了工作強(qiáng)度.目前常用的彗星圖像分析軟件主要有CASP、SicionImage、IMI等軟件.彗星實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理通常鋪膠2到3塊,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次,統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞核數(shù)在150以上,這樣可以通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對偏離較大的數(shù)據(jù)進(jìn)行取舍,以保證數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律。除上述堿性彗星實(shí)驗(yàn)外,Ofive等(1990還進(jìn)行了半堿性和中性彗星實(shí)驗(yàn).半堿性實(shí)驗(yàn)是將鋪好的載玻片在堿性解旋液中解旋后,在TBE緩沖液中電泳;中性彗星實(shí)驗(yàn)是將載玻片直接放在TBE緩沖液中電泳不需要解旋過程(Zhangeta1..2006;Oliveeta1.,1990.在半堿性條件下,彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測到DNA的單鏈斷裂、雙鏈斷裂,但檢測不到堿性不穩(wěn)定位點(diǎn);中性條件下,彗星實(shí)驗(yàn)只能檢測到雙鏈斷裂,而檢測不到單鏈斷裂和堿性不穩(wěn)定位點(diǎn);堿性條件下,彗星實(shí)驗(yàn)則可將3種損傷全部檢測出來,因此,堿性彗星實(shí)驗(yàn)比半堿性、中性彗星實(shí)驗(yàn)更加靈敏,但對遺傳毒性物質(zhì)引起損傷的形式進(jìn)行研究時(shí),應(yīng)結(jié)合半堿性和中性彗星實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行.2植物彗星實(shí)驗(yàn)在環(huán)境污染監(jiān)測中的應(yīng)用2.1生態(tài)環(huán)境中遺傳毒性物質(zhì)檢測植物彗星實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測出遺傳毒性物質(zhì)對植物細(xì)胞DNA造成的損傷,分析DNA損傷類型:如雙鏈斷裂、單鏈斷裂、堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)以及損傷修復(fù)過程中的不完全切除修復(fù)等,而且還可以檢測到DNA—DNA交聯(lián)、DNA一蛋白質(zhì)交聯(lián)等.應(yīng)用植物彗星實(shí)驗(yàn)已成功檢測出重金屬、EMS、苯衍生物、有機(jī)烴類等對煙草、蠶豆、菜豆等作物遺傳物質(zhì)的損傷(林愛軍等,2006;Gichnereta1.,2006b;Zhangeta1.,2006.Gichner等(2008a;2008b采用EMS和1一rays作為陽性對照,檢測到馬鈴薯經(jīng)Cd處理2小時(shí)后,根尖DNA損傷顯著增加;Cd處理兩星期后,葉片DNA損傷顯著增加;用不同濃度的Pb處理煙草不同時(shí)間,DNA損傷也存在明顯不同.Chakraborty等(2008采用植物彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)電煤粉塵能夠引起蔥屬植物根尖DNA損傷”.張旭紅等(2006將植物根尖直接暴露于受污染的土壤和水中,處理一定時(shí)間后,分離細(xì)胞核,進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cd污染土壤和水體能引起植物基因組的損傷,并有可能通過植物果實(shí)向食物鏈上游傳遞,對上游生物造成危害.Saghirzadeh等(2008采用植物彗星實(shí)驗(yàn)檢測到伊朗拉姆薩爾地區(qū)高劑量輻射污染的土壤具有高強(qiáng)度的遺傳毒性.Feretfi等(2008采用植物彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),比意大利和WTO規(guī)定還要低的氯酸鹽、亞氯酸鹽仍能夠?qū)е翧Uiumcepa和TradescantiaDNA損傷,且在洋蔥根尖發(fā)生顯著的染色體畸變.因此,運(yùn)用植物彗星實(shí)驗(yàn)可以對相關(guān)毒性物質(zhì)的生態(tài)毒害作用和致突變效應(yīng)進(jìn)行有效評價(jià).2.2土壤生態(tài)毒理學(xué)分析現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)和突發(fā)事件造成的環(huán)境污染日益嚴(yán)重,礦山、電廠、化工企業(yè)等排出的廢水中含有大量的Cd、Cu、Pb、Zn等重金屬和苯衍生物、有機(jī)烴類、電煤粉塵等物質(zhì),對土壤生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重危害,給農(nóng)作物造成了嚴(yán)重的遺傳損傷,進(jìn)而影響到農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì).植物在受到環(huán)境脅迫時(shí)不能像動(dòng)物那樣躲避,只能通過自身的防御和修復(fù)系統(tǒng)來適應(yīng)環(huán)境、消除環(huán)境對自身的影響.因此,對這些遺傳毒性物質(zhì)的毒害作用進(jìn)行有效檢測,對污染物的土壤生態(tài)毒理學(xué)作用進(jìn)行有效分析已成為當(dāng)務(wù)之急.Saghirzadeh等(2008分析了北波西米亞受污染Su-imice和未受污染Jezeri兩地重金屬Cd、Cu、Pb、zD的含量,采用植物彗星實(shí)驗(yàn)研究了受污染土壤對煙草和菜豆的毒害作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重金屬污染導(dǎo)致DNA損傷明顯增加,除Cd外.cll、Pb、Zn主要?dú)埩粼诩?xì)胞根部,說明重金萬方數(shù)據(jù)第2期曹玉偉等:植物彗星實(shí)驗(yàn)及其在生態(tài)毒理監(jiān)測中的應(yīng)用187屬可能是以間接作用方式導(dǎo)致DNA損傷,而且重金屬污染對煙草、菜豆株高、葉面積等均起到顯著抑制作用.Lin等(2008采用植物彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)砷酸鹽對蠶豆根尖和葉片DNA的損傷與其濃度具有協(xié)同效應(yīng),當(dāng)濃度達(dá)到10retool?L-1時(shí),砷酸鹽雖然沒有明顯的植物危害,但根尖和葉片生長受到抑制,體內(nèi)抗氧化酶活性發(fā)生變化,推測這可能是導(dǎo)致蠶豆體內(nèi)DNA損傷的原因之一.2.3生態(tài)評估和污染治理效果評價(jià)彗星實(shí)驗(yàn)在篩查環(huán)境介質(zhì)中的遺傳毒性物質(zhì)、檢測這些物質(zhì)潛在危害和研究其遺傳毒性作用機(jī)理時(shí)具有重要作用.由于DNA損傷關(guān)系到生物個(gè)體遺傳信息的表達(dá),并且與種群密度和生態(tài)群落可能存在直接或間接聯(lián)系,該效應(yīng)標(biāo)記方法將不僅僅是從生物個(gè)體角度起到環(huán)境預(yù)警的作用,從區(qū)域管理的角度也可能作為反映生態(tài)和健康效應(yīng)的重要指標(biāo),因此,采用植物彗星實(shí)驗(yàn)監(jiān)測污染物對生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)者遺傳物質(zhì)的毒害作用,評估對生態(tài)系統(tǒng)的潛在影響具有重要意義.目前植物彗星實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功應(yīng)用于生態(tài)評估:通過對污染區(qū)植物進(jìn)行研究,確定環(huán)境污染物含量的安全范圍.此外通過彗星實(shí)驗(yàn),能夠發(fā)現(xiàn)降低污染物遺傳毒性的物質(zhì)或微生物.如張旭紅等(2008通過植物彗星實(shí)驗(yàn)研究了我國浙江富陽地區(qū)污染土壤中的污染物Cu、Zn、Pb、CA等重金屬和磷對蠶豆的毒害作用,發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi。AMF可以減輕重金屬對蠶豆的毒害,這為今后生態(tài)治理、生態(tài)保護(hù)和在受污染土壤上復(fù)種提供了依據(jù)和可能.隨著我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,環(huán)境污染治理問題倍受關(guān)注,特別是土壤和水資源污染,對農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民群眾的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅,如何搞好環(huán)境治理和對治理效果進(jìn)行準(zhǔn)確評價(jià)是一個(gè)不小的難題。植物彗星實(shí)驗(yàn)為這方面的研究提供了簡便、有效的途徑.林愛軍等(2007研究證實(shí),骨炭灰能夠有效降低水溶態(tài)和交換態(tài)Pb、Cr、CIl的濃度,從而可以有效降低重金屬在植物體內(nèi)累積,減少因重金屬污染對食物鏈上游生物的危害,通過植物彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),加入骨炭灰后植物細(xì)胞DNA損傷明顯降低.鄭明霞等(2007通過在土壤中添加螯合劑EDTA、EGTA、DTPA,改變了土壤中Cd的賦存形態(tài),增加了土壤溶液中CA的濃度,通過植物彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法可以有效提高土壤中重金屬的可利用量,降低土壤重金屬污染程度,提高生物修復(fù)的效果.2.4植物遺傳損傷修復(fù)機(jī)制研究此前,人們對植物遺傳毒性物質(zhì)損傷修復(fù)的分子機(jī)制并不清楚,目前可利用植物彗星實(shí)驗(yàn)對植物遺傳損傷修復(fù)機(jī)制進(jìn)行研究.Hossain和Huq(2002及Valverde等(2001推測Cd可能通過與DNA上的A、G、和T堿基發(fā)生反應(yīng),直接結(jié)合在一起引起DNA損傷,也可能間接引起DNA損傷.最近通過植物彗星實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),CA主要通過間接作用引起DNA損傷,通過大量消耗細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑,特別是含硫的抗氧化劑和酶,使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的活性氧(Reactiveoxygenspecies。ROS反應(yīng)產(chǎn)物增加,如羥基氧分子OH一、超氧化物分子02一、H202等(Giclmereta1.,2004;Gichnereta1.,2006b.ROS反應(yīng)產(chǎn)物破壞了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng),對細(xì)胞產(chǎn)生一定的氧化壓力,造成多種脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的損傷,使細(xì)胞產(chǎn)生多種功能紊亂(Ercaleta1.,2001.細(xì)胞修復(fù)則是抗氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生的抗氧化劑如過氧化氫酶(CAT、超氧化物歧化酶(SOD、過氧化物酶(POD、巰基化合物等來清除體內(nèi)各種氧化反應(yīng)因子,減少由于生物氧化造成的損傷(Gichner,2003.與動(dòng)物類似,不同植物和同種植物的不同部分損傷修復(fù)能力不同,Gicher等(2004在彗星實(shí)驗(yàn)中檢測到根的DNA損傷,但沒有觀察到葉片的突變或同源重組。相對根而言,煙草葉片具有很強(qiáng)的抗氧化防御能力,在CA或H鼽處理時(shí),煙草葉片過氧化氫酶含量可達(dá)到根的30倍,從而阻止那些具有氧化能力的分子與DNA發(fā)生反應(yīng),起到保護(hù)作用(Gichner,2003.Georgieva和Stoilov(2008通過彗星實(shí)驗(yàn)證實(shí)博來霉素引起大麥DNA的雙鏈斷裂集中在loop區(qū),而且受損DNA可以被快速修復(fù),說明大麥體內(nèi)存在高效的自我修復(fù)機(jī)制.最近的植物彗星實(shí)驗(yàn)研究表明,遺傳毒性物質(zhì)和ROS因子造成的雙重?fù)p傷壓力會(huì)使細(xì)胞發(fā)生DDR反應(yīng)(DNA—damageresponses,使細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂前可以通過光復(fù)活(Photoreactivation、核苷酸切除修復(fù)(Nucleotideexcisi叩repair,NER和堿基切除修復(fù)(Baseexcisionrepair,BER等修復(fù)機(jī)制使DNA損傷得到修復(fù),維持基因組和物種的穩(wěn)定性(Tuteja萬方數(shù)據(jù)１８８生態(tài)毒理ＦｅｉｇＩｎｍｅｌｏｎｎｕｔｒｉｅｎｔ學(xué)報(bào)第４卷Ａ。ＳｈａｌｈｅｖｅｔＪ．１９８７．Ｒｅｓｐｏｌｌ∞ｏｆｔｏ甜ａ／．．２００９）．３展望彗星實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)可以在單細(xì)胞水平上研究ＤＮＡ損傷程度的技術(shù)，具有簡便、快速、可靠性高、靈敏性強(qiáng)等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于遺傳毒性物質(zhì)的檢測．運(yùn)用合適的細(xì)胞核分離方法，可將彗星實(shí)驗(yàn)用于多種植物，研究其ＤＮＡ受環(huán)境中遺傳毒性物質(zhì)損傷程度，探討ＤＮＡ損傷修復(fù)機(jī)制，檢測在輻射誘變育種中ＤＮＡ損傷情況，以及對環(huán)境惡化區(qū)域進(jìn)行生物監(jiān)測，為環(huán)境評估、生態(tài)治理和生態(tài)保護(hù)等提供依據(jù)．植物彗星實(shí)驗(yàn)在遺傳毒性物質(zhì)檢測方面急需在不同作物間實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，使檢測具體毒性物質(zhì)過程有一個(gè)共同的參照標(biāo)準(zhǔn)；彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果如何統(tǒng)計(jì)還需要進(jìn)一步探討和研究，為植物彗星實(shí)驗(yàn)在更廣范圍的應(yīng)用做鋪墊；同時(shí)關(guān)于植物彗星實(shí)驗(yàn)檢測到的ＤＮＡ損傷結(jié)果與其它毒性指標(biāo)如姐妹染色體交換（ＳＥＣ）、突變、微核的關(guān)系還不清楚，所觀察到的ＤＮＡ損傷的生物學(xué)意義也有待深入闡明；具有直接損傷效應(yīng)和通過ＲＯＳ因子等間接損傷效應(yīng)的遺傳毒性物質(zhì)造成相同ＤＮＡ損傷時(shí)，產(chǎn)生的ＤＮＡ結(jié)構(gòu)改變是否具有同一性等尚需要進(jìn)一步明確；此外，涉及修復(fù)的相關(guān)基因和這些基因如何開啟的分子機(jī)制也需要進(jìn)一步研究，為將來提高植物抗遺傳毒性物質(zhì)的能力和分子育種提供技術(shù)支持．實(shí)驗(yàn)中所需的低溫層析冷柜、熒光顯微鏡和彗星分析軟件較為昂貴，很大程度上限制了彗星實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用．雖然目前有免費(fèi)的分析軟件，但其分析結(jié)果與專業(yè)軟件還存在很大差距．希望更多學(xué)者參與進(jìn)來并開發(fā)出分析效果更好、價(jià)格更加低廉的軟件，為彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)展與應(yīng)用做出貢獻(xiàn)．通訊作者簡介：邦長虹（１９６８一），女，黑龍江哈爾濱人，博士，教授。主要從事植物遺傳學(xué)及基因工程研究．ＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓＣｏｏｋＰＡ，Ｒｙ蛐Ｉ，Ｍｅｉｒｉａｎｄｔｏｍａｔｏｐ／ａｎｔｓｃ／Ⅱｏｄｄｅ—ｎ／ＷａｔｔＰｌａｎｔｒａｔｉｏ血ｓ宣ｌ遍ｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，１０（９—１６）：１７８７一１７９４ＦｅｒｅｔｔｉＦａｔｉｇｏｎｉＤ，壓：ｒｂｉｎｉＩ。ＣｅｒｅｔｆｉＥ，Ｖ＇ｄｌａｒｉｎｉＭ，ＺａｎｉＣ，ＭｏｒｅｔｆｉＭ，Ｃ，ＯｒｉｚｉｏＧ，ＤｏｎａｔｏＦ．Ｍｏｎｍ＇ｃａＳ．２００８．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａｎｄｃｈｌｏｒａｔｅｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙｕｓｉｎｇｄａｌｘｈｌ窖ｅ婦泗［Ｊ】．ＷａｔｅｒｃｈｌｏｒｉｔｅｖｉｔｒｏＤＮＡＲ船渤。４２（１５）：４０７５一ｓｔｒａｎｄｐｌａｎｔｂｉｏａｓｓａｙｓａｎｄｉｎ柏８２ＧｅｏｆｇｉｅｖａＭ，ＳｔｏｉｌｏｖＬ．２００８．ＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＤＮＡｉｎｄｕｃｅｄｂｙｂｌｅｏｍｙｃｉｎａｎｄｂｒｅａｋｓＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｓｓａｙ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．４９（５）：３８１－３８７ｂａｒｌｅｙｂｙＣＯｌｉ地ｔｉｎｔｈｅＧｉｃｈｎｅｒＴ．２００３．ＤＮＡａｃｔｉｎｇｄａｍａｇｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｉｎｄｉｒｅｃｔａｎｄｄｉｒｅｃｔｍｕｔａｇｅｕｓｉｎｃａｔａｌａｓｏ—ｄｅｆｉｃｉｅｎｔＣｏｍｅｔａｎｄｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄａｃｅｌｌｕｌａｒａｓｓａｙｓ［Ｊ］．ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅ般ａｒｃｈｌＧｅｎｅｆｉｃＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＦ．ｎｖｉｎｍｍｃｎｔａｌＭ刪卅｝Ｅｎｅｓｉｓ，５３５（２）：１８７－１９３ＧｉｃｂｕｅｒＴ．ＭｕｋｈｃＩｊｅｅＡ，Ｖｅｌｅｎｆｆｕｓ姆Ｊ．２００６ａ．ＤＮＡｗｉｔｈｔｈｅｂｙ肚ｍｉａｗｉｔｈＧｉｃｈｎｅｒｔｏｂａｃｃｏｔ【＇ｂａｃ∞ｐｌａｎｔｓ緬血ｅａｎｎｅｎｔＴ。ＰａｔｋｏｖｆｉｆｉｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓＥｔＢｒ．ＤＡＰＩａｎｄＹＯＹＯ一１ｉｎ吐時(shí)ｃ咄ｔｓｔａｉｎｉｎｇａｓｓａｙｗｉｔｈｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ．ａｎｄＤＮａｓｅ－Ｉ［１］．ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅｎｒｃｌｇＧｅｎｅｔｉｃＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ鋤ｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．６０５（１－２）：１７—２１Ｚ．Ｓｚ（ｘｋｏｖ６Ｊ，Ｄｅｎｍｅｍｖ６ｔｏｂａｃｃｏＫ．２００４．ｎｏＣａｄｍｉｕｍｉｎｄｕｃｅｓＤＮＡｄａⅢ楚黟ｉｎｄａｍａｇｅ．ｓｏｍａｔｉｃｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｒｒｏｏｔｓ，ｂｕｔＤＮＡｉｎａｎｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｌｅａｖｅｓ［Ｊ］．ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ／ＧｅｎｅｔｉｃＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ。５５９（１—２）：４９—５７Ｚ。Ｓｚ６ｋｏｖ６ｔｏｂａｃｃｏＧｉｃｂｕｅｒｓｏｉｌＴ。ＰａｔｋｏｖｆｉＤＮＡＪ，Ｄｅｎｍｅｒｏｖ６Ｋ．２００６ｂ．ｇｒｏｗｉｎｇＴｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｐｏｌｌｕｔｅｄｄａｍａｇｅｉｎａｎｄｐｏｔａｔｏｐｌａｎｔｓａｎｄｏｎｍｅ，ａｌｓ．ＥＪ］．ＥｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙＳａｆｅｔｙ．６５（３）：４２０－４２６ｈｅａｖｙｗｉｔｈＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＧｉｃｌｍｃｒＴ，Ｐａｔｋｏｖ６Ｚ，Ｓｚ６ｋ刪丘Ｊ，ＺｎｉｄａｒｉｎＩ，ＭｕｋｈｅｌｊｅｅｂｙａｎｄＡ．２００８ａ．ＤＮＡｄａｍａｇｅｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅａｎｄｐｏｔａｔｏｐｌａｎｔｓｉｎｄｕｃｅｄｃａｄｍｉｕｍ．ｅｔｈｙｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＹ—ｒａｙｓ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ．６２（２）：１１３－１１９ＧｉｃｈｎｅｒＴ，Ｚｎｉｄａｒｂｄａ／ｎａｇｃａａｄＩ．ＳｚＩｔｋｏｖａｉｎｄｕｃｅｄＪ．２００８ｂ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｂｙｏｆＤＮＡｐｌａｎｔｓ［Ｊ】．ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙｌｅａｄｉｎｔｏｂａｃｃｏＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ。６５２（２）：１８６—１９０ｌｔｏｓｓａｌｎｚ。ＨｕｑＦ．２００２．ＳｔｕｄｉｅｓａｎｄｏｎｔｈｅｉＩ蚰ａ急ｃｔｉｏｎｂ嘎ｗ嘲Ｃｄ２＋ｉｏｎｓａａｄｕｕｃｌｅｏｂａｓｍｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｏ喀ａｎｉｃＢｉｏｃｈｅｍｉｍｙ，９０（３－４）：９７—１０５ＫｏｐｐｅｎＧ．ＶｅｒｓｃｈａｅｖｅＬ．１９９６．Ｔｈｅａｌｋａｌｉｎｅｃｏｍｅｔｔｅｓｔｏｎｐｌａｎｔｎ呻ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙｔｅｓｔｆｏｒＤＮＡｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓｉｎＶ／ｃ／ａｃｅｌｌｓ：Ａｆａｂａｍｏｔｃｅｌｌ［Ｊ］．ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ／ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＲｅｌａｔｅｄＳｕｂｊｅｃｔｓ。３６０（３）：１９３－２００／ＡｎＲ。ＢｒａｚｅｌｌｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＩＡ。ＪｏｓｔＥ．１９７６．Ｃｈ刪ｏｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉａｏｆｎｕｃｌｅ缸ｍｔＬｉｎＬｉｎＡＡＪ．動(dòng)衄ｇＸＨ．ＳｕＹｏｆＨ，ｍｉｎＹ，ＣａｏｓｏｉｌｕｓｉｎｇＱ。７ｈｕｂｏｎｅＹＧ．ａｎｄ２００７。Ｃｈｅｍｉｃａｌｆｉｘａｔｉｏｎｍｅｔａｌｓｃｈａｒｓｌｌ＇ｕｃｔｕｒｅｓｍｐｅｒｈｅｌｉｃａｌＤＮＡ［Ｊ】．ＣｅｌｌＳｃｉｅｎ∞，２２（２）：ｏｆｔｈｅｓｏｉｌｇｅｎｏｍｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２８（２）：２３２—２３７（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）３０Ｂ一３２４ＦａｒａｄａｎｄＮ，Ｇｍ玎一ＯｒｂａｎｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｌｒｅｓｓＨ。Ａｙｋｌｎ－ＢｕｒｎｓｐａｒｔＮ。２００１．Ｔｏｘｉｃｉｎｍ咖ｋｍｅｔａｌ—Ｉ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｄｕｃｅｄＣｈｅｍ呻，１（６）：５２９—５３９萬方數(shù)據(jù)ｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ［Ｊ】．ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓＭｅｄｉｃｉｎａｌＡＪ．ＺｌｍｎｇＸＨ．刁ｌａｎｇＺＬ，ＣｅｏＱ，刁珊ＹＧ．２００６．ＡｃｏｍｐａｎｕｉｏｎｍｌｄｙｕｓｉｎｇｃｏｍｅｔａｓｓａｙｔｏｄｅｔｅｃｔＤＮＡｄａｍａｇ∞ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＡｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ。１（２）：１６５—１７１（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）Ｊ，撕ＸＨ，踟ＹＧ。動(dòng)∞ＦＪ．２００８．加蜘疵－第２期ｉｎｄｕｃｅｄ曹玉偉等：植物彗星實(shí)驗(yàn)及其在生態(tài)毒理監(jiān)測中的應(yīng)用１８９ｔｏｘｉｃｉｔｙ：ｃｌ觚ｏｎＭａｎｌｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓａｎｄＤＮＡ１ｆ、ｌ畫ａｓｔｒｅｓｓＮ，Ａｈ】口ｌａｄＰ，ＰａｎｄａｉｎＢｔｉｇｌａｔＢ，ｌ＂ｕｔｏａＲ．２００９．Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ０１１ｄａｍａｇｅｉｎＶ／ｃ／ａ向ｋ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏＤｍｅｉｌｔ丑ｌＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄＱ吼ｎｉｓ舡ｙ．２７（２）：４１３—４１９ｌＮｌｓｖａｒｒｅｔｅＡｆａｓｔＤＮＡ哪ｌａｅｆｉｃａｓｅ８［Ｊ］．ＭｕｔａｔａｆｉｏｎＲｅ∞ａｒｅｌａ，醯ｌ（２－３）：１３４—１４９Ｖａｌｖｅｒｄｅａｃｅｔａｔｅｐｌａｎｔｓ：ＳｈｅｄｄｉｎｇＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ／Ｒｅｖｉｅｗｓｄｌｌｌｎａｇｃ．ｒ?。幔椋蛎螅洌椋睿停酰簦幔簦椋铮睿龋妙荆校模澹停椋纾酰澹欤停模澹欤幔裕铮睿澹茫保梗梗罚幔螅螅澹螅螅恚澹睿簦悖铮恚澹簦幔螅螅幔觯幔颍椋恚幔簦妫铮颍螅铮欤椋洌保椋螅螅酰澹悖澹欤欤螅裕瑁澹停ⅲ颍颍澹辏铮?，ｌＲｏｊｓｓＥ．２，００１．１ｓｔｈｅｃａｐａｃｉｔｙｏｆｌｅａｄｔｏｄａｍａ薩ｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｅｈｌＣ＿＿把．ｎｅｆｉｅＴｏｘｉｅｏｌｏｓｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｍｌｍｔａｌＭｔｌｔａｇｅｎｅｓｉｓ．３８９（２－３）：２７１—２７７／ｑ＇ｍｇＳＢ，ＳｏｎｇＹｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｓｕｓｉｎｇｃＯＤｌＣｔｏｆＤＮＡａｎｄｃａｄｍｉｕｍｅｌａｌｏｒｉｄｅｉｎｄｕｃｅｇｅｎｏｔｏｘｉｃｄａｍａｇｅｄＩｌｅｔＯｄｉｒｅｃｔＤＮＡ—ｍｃｔａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ？［Ｊ］．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．１６（３）：２６５－２７０Ｃ。Ｖ鋤ＤｎｍｍｃＰ．２００２．ａｂ缸ａｃ魄ｊｚ撕∞ｏｆｃｅｌｌｄｅａｔｌｌｉｎｍａｉｚｅｏｆｃｅｌｌｒｏｏｔ７１１”ｇＸｔｔ，ＧｉｏＹＬ，ＩＡｎＡｎｒｂｕｓｅｕｌａｒｍｙｅｏｒｒｌｆｉｚａｌｆｌｍｇｉＪ，ｔｌｔｍｇＩ，＇／ｃ／ａＹＺ．２∞８．Ｆ＿，ｆｆｅｅｔｓ０ｎｏｆｏｆ珥Ｄ】驢珊ｍｅｄａｎｄｃｅｌｌｓｂｙｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｓｏｉｌａｓｓａｙｔｈｅｅｏｍｂｉｌ扭ｔｉｏＤｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｅｏｌａｔａｍｉｎａｔｅｄｂｙｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓｏｆｗｉｔｈａｌｍｅｘｉｎｂｉｎａｉｎｇｒＪ］．Ｅｌｅａｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２３（１３）：２０９６—２１０２ＯｌｉｖｅＰＬ．１９８９．Ｃｅｌｌｌ＿ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ越ａ０ｆｔｈｅｃｏｌｌｔ，籃ｔＥｎｖｉｒ伽蚴ｌａｌ踟班吣．２（２）：２７４—２７８（ｉｎＸＨ，Ｉ．ｉｎＡｆａｂａ［Ｊ］．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒａａｌＣｈｉｎｅｓｅ）Ｓ，ＳｍｉｔｈＯｌｌＲａｄｉｌｌｌｉｏｎＲｅ斌ｌａ．ｎ７（１）：７９—９２ＤＮＡｄａｍａｇｅｅｔｆｅｅｔｉｎＣｈｉｎｅ鴕ｈａｍ燈Ｖ７９ｒｅｑｕｉｒｅ，ｍ∞ｔｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｍＳｌｆｌｋｒｏｉＡｓ［Ｊ］．刁ａａｎｇＪ．西即ＢＤ，Ｗ哪ＹｉｌｌｏｓｓｅａｅＳＥ，ｏｆＳｍｉｔｈＦＡ．２００６．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓｔｏＧｌｏｍｍｔｌａｅｔｏｘｉｃｉｔｙＦ／ｃ／ａ．ｆａｂａ［Ｊ］．ＪｏｕｍａｌｏｆＥｎｖｉｎｍｍ咖Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１５（４）：７２１—７２６ＯｌｉｖｅＰＬ，Ｂｎｎ（ＩｔｌａＪＰ，ＤｕｒｎｎｄＲＥ．１９９０．ＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｉｎｒｌｌｄｉａｌＪＯｌｌｌ—ｉｎｄｕ暇ｌ（１）：８６—９４Ｏｓｔｌｉｎｇｃｅｌｌｓｍｅａｓｕｒｅｄｕｓｉｎｇｔｈｃ。刪”ｍｙ［Ｊ］．ＲａｄｉａａｔＫｄａｌｎｌｌｇｃｓｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｎｎｄ托ｐａｉｒｉｎｔｕｍｏｒａｎｄｌｒｌｏｒｌｎａｌ７１１”ｇＸＩ－Ｉ，ＬｊｎＡＪ，ＳｔｔＹＨ，刁ｍＹＧ．２００６．ＤＮＡＲｅ鰣Ｊｒｅｈ．１２２觸［Ｊ］．臣ｗｉｌｌ咂ｍｃｍａｌａｎｄ卻１０