BCA法和考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)濃度

分光光度法介紹分光光度法是利用溶液中特定溶質(zhì)的光吸收測定其濃度的方法，其基本原理是根據(jù)Lambert和Beer定律。一Lambert定律當(dāng)一束平行單色光垂直照射于一均勻物質(zhì)溶液時，溶液將吸收一部分光能，使光的強度減弱。若溶液的濃度不變，則在溶液中的光程越長，光線強度的減弱也越顯著。設(shè)：入射光強度為I0,透射光強度為I,L代表光在溶液中的光程。lg--=KiLK是常數(shù)，受光線波長，溶液性質(zhì)，溶液濃度影響。二Beer定律當(dāng)一束光通過一溶液時，光能被溶液介質(zhì)吸收一部分，若光程不變，則溶液的濃度越大，光吸收越強，透射光強度的減弱也越顯著，光線減弱的比例與溶液濃度呈正比。I0lg丁=k2cK2為吸收系數(shù)，是常數(shù)。溶液對光吸收的強弱與溶液濃度C成正比。三Lambert-Beer定律將以上兩個定律合并：Iolg—=KCL令A(yù)=lgfT=已貝UA=KCL=-lgTT為透光度，A為吸光度，K為消光系數(shù)四待測樣品濃度的計算A標(biāo)=KC標(biāo)LA樣=KC樣L由于是同一物質(zhì)及相同的光程，則:A樣A樣/A標(biāo)=KC樣L/KC標(biāo)L=C卞￥/C標(biāo)即：C樣=（A樣/A標(biāo)）*C樣故已知標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度及吸光度，依據(jù)公式可計算出待測樣品溶液的濃度。實驗名稱：BCA法測定蛋白質(zhì)含量實驗原理：BCA即二奎琳甲酸。在堿性條件下，蛋白的肽鍵結(jié)構(gòu)將二價銅離子還原為亞銅離子，亞銅離子與BCA試劑形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，并在562nm處有最大的光吸收值，該復(fù)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，故可通過吸收值的大小對蛋白質(zhì)進行定量。實驗步驟:1.5ml離心管編號，按表加入下列試劑：BCAfc標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品測定1.5ml離心管編號，按表加入下列試劑：BCAfc標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品測定3)4)5)1.2ml離心ddHO(lL2mg/mLBSAlL蛋白質(zhì)終濃度（gg/m管))L)A050仙L標(biāo)準(zhǔn)品2000B125375pL標(biāo)準(zhǔn)品1500C325325pL標(biāo)準(zhǔn)品1000D175175卜LBt混合液750E325325世LCt混合液500F325325lLEt混合液250G325325叱LF管混合液125H400100卜LGT混合液25I400B配置BCA工作液：00=Blank依據(jù)樣品數(shù)量，將試劑A和試劑B按體積比50:1配制適量BCA工作液，并C標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的測定：1）分別取252）每孔中加入科L上表中新鮮配制的BSA標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品，加入到微孔板中;200LBCA工作液，并充分混勻；將9支干燥的調(diào)零點，于562nm處測定各管吸光度口V目充分混勻。加蓋，37c孵育30min后冷卻至室溫或室溫放置2h;以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算樣品的蛋白濃度。ASTANDARC1.8311.95120001.3371.45715001.0311.25110007500.6110.7555000.3290.4492500.1620.2821250.0490.1692500.1200.6030.723D（加粗?jǐn)?shù)據(jù)是樣品吸光度）四實驗結(jié)果：實驗數(shù)據(jù)如下:將樣品數(shù)據(jù)代入方程：得出：x=726.89gg/mL,即樣品中的蛋白質(zhì)濃度為726.89心g/mL五討論：1從標(biāo)準(zhǔn)曲線中可以看出，溶液的蛋白質(zhì)含量和吸光度成正相關(guān)，蛋白質(zhì)含量越高，吸光度就越高。2配制溶液時一定要細心，不要配錯，正確使用移液槍，及時換槍頭，避免污染；3當(dāng)離心管中已經(jīng)注入溶液，小心不要因為過失而導(dǎo)致其漏液，造成損失；4測定吸光度時注意調(diào)整波長；5該方法快速，靈敏度高，試劑穩(wěn)定性好，對不同種類蛋白質(zhì)的檢測的變異系數(shù)小，而且BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中化學(xué)物質(zhì)的影響，低濃度的去垢劑不影響檢驗結(jié)果，在微孔板中進行測定，可以大大節(jié)約樣品和試劑用量。6此種方法的測定范圍是20~2000心g/mL一實驗名稱：考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量：二實驗原理：考馬斯亮藍在酸性條件下和蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料最大吸收值從465nm變?yōu)?95nm,在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進行蛋白定量。測定范圍為50科g-1000科g/ml三實驗步驟：A考馬斯亮藍染液在使用前應(yīng)平衡溫度至室溫并溫和的顛倒混勻；B標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將7支干燥試管編號，按表加入下列試劑：考馬斯亮藍法標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品測定試齊0123456BS儆（仙l）2mg/ml05102030600PBSQl）15014514013012090150蛋白質(zhì)終含量（mg/mL）00.0670.130.270.40.80C標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的測定1）將5dL體積的樣品加入到試管中，并用PBS補足到150dL;2）向各個試管中加入2.85mL考馬斯亮藍染液，混勻，室溫放置5-10min;3）以0號管調(diào)零點，于595nm處測定各管吸光度；4）以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算樣品的蛋白濃度。四實驗結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線：樣品對應(yīng)的吸光度為1.148將樣品數(shù)據(jù)代入方程：得出：x=949.6心g/mL,即樣品中的蛋白質(zhì)濃度為0.9496mg/mL五討論1考馬斯亮藍可以和石英比色皿產(chǎn)生強烈的結(jié)合，建議使用玻璃或塑料比色皿；2不同的蛋白可以和CBBG勺結(jié)合程度不同，因此使用被測蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得到更準(zhǔn)確的結(jié)果；3應(yīng)按蛋白濃度從低到高的順序進行測定，測定過程請連續(xù)進行，不要清洗比色皿，因為水質(zhì)會影響測定結(jié)果；4測定吸光度時注意調(diào)整波長；5從標(biāo)準(zhǔn)曲線中可以看出，溶液的蛋白質(zhì)含量和吸光度成正相關(guān)，蛋白質(zhì)含量越高，吸光度就越高；6此種方法的測定范圍是50~1000ag/mL；7使用分光光度計時，每一次打開蓋子后，都需要再次矯正，不然會產(chǎn)生誤差；8在使用可見光分光光度計時，注意往裝液體時不可過多，以防灑出損傷儀器。也不能過少，可能導(dǎo)致無法測量液體的分光度；9由考馬斯亮藍法測得的蛋白質(zhì)濃度和用BCA法測得的蛋白質(zhì)濃度有很大差距，原因我們分析有以下幾點：）我們可能在操作的過程中沒有注意細節(jié)，比如試管中殘留的蒸儲水沒有完全除去，或者比色皿中的