載體構(gòu)建流程

載體構(gòu)建流程載體構(gòu)建流程載體構(gòu)建流程載體構(gòu)建流程編制僅供參考審核批準(zhǔn)生效日期地址：電話：傳真:郵編:載體構(gòu)建SOP流程:GenBank查詢目的基因序列→根據(jù)ORF序列利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物→表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞總RNA提取→RT-PCR獲取目的基因→酶切目的基因和載體→分別純化酶切的目的基因和載體并建立連接反應(yīng)→轉(zhuǎn)化→初步篩選陽性克隆→陽性克隆測序→測序正確的質(zhì)粒保種并重提質(zhì)粒I.獲取目的基因/序列片段一.獲取序列信息通過GENBANK數(shù)據(jù)和生物信息的方法設(shè)計(jì)目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。

PCR引物的設(shè)計(jì)原則：①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。②產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。③引物長度一般在15~30堿基之間。④G+C含量在40%~60%之間。⑤堿基要隨機(jī)分布。⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。⑧引物5′端可以修飾。⑨引物3′端不可修飾。⑩避免在引物的3’端使用堿基A。在實(shí)際設(shè)計(jì)引物中由于ORF兩末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的設(shè)計(jì)原則，但也切記引物不能過長或過短。過長的引物不容易打開其二級結(jié)構(gòu)，與模板結(jié)合緩慢，也容易形成引物二聚體，通常不超過35bp(不包括酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)。過短的引物特異性差，擴(kuò)出其它不相關(guān)片段，最終很難得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基)。要將目的基因定向克隆至相應(yīng)載體，需要在上下游引物兩端設(shè)計(jì)不同的酶切位點(diǎn)，由于酶切位點(diǎn)位于線性末端時酶對其識別切割能力大大降低，需依據(jù)NEB目錄添加相應(yīng)保護(hù)堿基，酶切時可相應(yīng)增加時間。二.制備模板1.分離高質(zhì)量RNA：成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質(zhì)量決定了能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值?，F(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室通常使用Trizol試劑法提取總RNA，可以從多種組織和細(xì)胞中提取高質(zhì)量的非降解RNA。Trizol試劑法可以從最少100個細(xì)胞或1mg組織中提取RNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因?yàn)閏DNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNaseA，B，C對RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。制備好的RNA應(yīng)立即RT合成cDNA，若不馬上使用應(yīng)立即存于-80℃冰箱。也可以在細(xì)胞或組織加入Trizol試劑后立即凍入-80℃冰箱，待用時再制備。我們通常都是從組織或細(xì)胞中提取RNA。從細(xì)胞提取RNA是要掌握細(xì)胞的量，注意Trizol加量，從組織中提取RNA研磨過程液氮一定不能干，盡量研碎，速度要快，提完后立即進(jìn)行下步反應(yīng)。對擴(kuò)增片段較長、豐度較低、復(fù)雜度較高的片段，對RNA質(zhì)量要求很高，可采取oligodT纖維柱制備較純的mRNA,有利于制備高質(zhì)量的cDNA。防止RNA酶污染的措施：所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間；塑料器皿可用%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）；我們實(shí)驗(yàn)室采取連續(xù)高壓兩次，效果也不錯；有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用%DEPC水沖洗，晾干；配制的溶液應(yīng)盡可能的用%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)μm濾膜過濾除菌；操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換；設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。制備cDNA:（1）反轉(zhuǎn)錄酶的選擇

a．Money鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。

b．禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。

c．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)。

d．MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH-突變體：商品名為Superscript和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。（2）合成cDNA引物的選擇

a．隨機(jī)六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

b．Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。

c．特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。三.擴(kuò)增目的片段高保真酶擴(kuò)增目的片段，優(yōu)化PCR條件獲取特異的高保真的條帶,由于此步為獲取正確的目的基因，所以盡量避免PCR的突變格外重要。其中所采取的措施有：使用高保真酶、循環(huán)次數(shù)控制在25cycle左右、引物設(shè)計(jì)合理等。PCR常出現(xiàn)三種情況：1.假陽性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。2.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。3.什么條帶都沒有。出現(xiàn)狀況的原因和解決方法：1.假陽性的原因及解決方法：可能引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。還有就是靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。2.非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：①必要時重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，653.什么條帶都沒有，其原因可能是少加?xùn)|西，酶已經(jīng)失活了，或退火溫度太高，模板的質(zhì)量問題等。解決方法：檢查是否少加?xùn)|西了，換一下酶，降低退火溫度或做個梯度，摸一下條件?？梢韵鄳?yīng)地提高M(jìn)g2+的濃度。如果再擴(kuò)不出來可以考慮二次PCR。II.獲取陽性克隆一.酶切1.將雙酶切的目的基因定向克隆入載體并轉(zhuǎn)化。使用高質(zhì)量無核酸酶污染的限制性內(nèi)切酶（如NEB，fermentas）,20μl體系（2μgDNA）加μl10U/μl的酶消化小時，可根據(jù)DNA濃度、酶的活力、酶的量、反應(yīng)時間可適當(dāng)改變條件，PCR產(chǎn)物酶切時間可增至2-3小時。酶切反應(yīng)時避免星活性，導(dǎo)致星號活性的因素：較高甘油濃度（不超過10%）、低鹽濃度（<25<mM))、高pH值〉、內(nèi)切酶用量過大>100u/ugDNA、有機(jī)溶劑、其它二價(jià)離子。2.雙酶切兩種酶切的條件不同時，分別進(jìn)行兩次酶切，切完一個純化后再切；溫度要求不同，先酶切低溫要求的，再酶切高溫要求的；若鹽濃度要求不同，先酶切低鹽濃度要求的，再酶切高鹽濃度要求的；只要其中一種酶需要添加BSA，則應(yīng)在雙酶切反應(yīng)體系中加入BSA。BSA不會影響任何內(nèi)切酶的活性；先用難切的酶切，電泳鑒定確定切開，再用第二個酶切，以防單酶切，也可以去磷酸化。3.單酶切一定要去磷酸化。4.酶切跑電泳時，要酶切前和酶切后一起跑，有必要時跑個Marker。5.酶切完，純化時為了提高純化回收率，可以適當(dāng)?shù)赝饧右稽c(diǎn)NaAc，注意NaAc的pH值要在。常見的問題及原因二.連接對于有效的連接體系來說合適的載體和目的基因分子數(shù)比值控制在一定范圍內(nèi)是有必要的，這個比值為1：3-1：10，較大的片段可適當(dāng)提高比值。連接時，PCR產(chǎn)物濃度可以盡可能的大。連接通常是16℃或4℃過夜連接。PCR產(chǎn)物最好進(jìn)行切膠回收純化，以去除PCR產(chǎn)物中的非特異性片段和引物等雜質(zhì)。切膠回收PCR產(chǎn)物時，避免DNA在紫外線下暴露時間過長從而形成嘧啶二聚體，造成PCR產(chǎn)物不能連接。三.轉(zhuǎn)化復(fù)蘇對于氨卞和氯霉素抗性不是必須的，但對卡那霉素則是必須的，42℃熱激對轉(zhuǎn)化率的影響較大，DH5A/TOP10轉(zhuǎn)化率較高可適當(dāng)少加些產(chǎn)物。對于慢病毒載體在DH5A/TOP10中易發(fā)生重組導(dǎo)致克隆失敗，可選擇Stbl系列的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以確?？寺〉恼_性，但要注意其轉(zhuǎn)化率較低的問題，可以采用電轉(zhuǎn)化或優(yōu)化感受態(tài)的方式?；静襟E：（1）將100μl感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍。（2）取5μl連接產(chǎn)物或～2μl質(zhì)粒加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次以混勻內(nèi)容物。在冰上放置30分鐘。（3）將管放入預(yù)加溫到42℃的水浴中，熱激90秒?？焖賹⒐苻D(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1~2分鐘。（4）每管中加700μlLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，進(jìn)行復(fù)蘇。（5）室溫4,000rpm離心5分鐘，棄去上清后，用剩余100μl培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面。注意：細(xì)胞用量應(yīng)根據(jù)連接效率和感受態(tài)細(xì)胞的效率進(jìn)行調(diào)整。（6）將平板置于室溫直至液體被吸收。（7）倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12~16小時后可出現(xiàn)菌落。轉(zhuǎn)化常出現(xiàn)的結(jié)果及解決方法：（1）板上什么都沒有長出來：首先要考慮感受態(tài)細(xì)胞有沒有問題，可以將感受態(tài)細(xì)胞涂于無抗性的LB培養(yǎng)板上，看是否長；再者要看一下抗性有沒有搞錯；最后再確定一下是不是去磷酸化去過頭了。（2）長的滿板都是菌落：首先要考慮感受態(tài)細(xì)胞有沒有被污染，驗(yàn)證方法是將感受態(tài)細(xì)胞涂于有抗性的板上，看是否會長菌；再考慮是否是載體酶切不完全，單酶切。四