白木香種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018白木香種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了白木香[Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.]種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于白木香種子的超低溫長期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程其他項(xiàng)目檢驗(yàn)術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。白木香Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（AquilariaLam.）常綠喬木，高5~15m。葉革質(zhì)，圓形、橢圓形至長圓形或近倒卵形，傘形花序。漸危種，國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。該植物老莖受傷后所積得的樹脂為《中國藥典》收載的名貴藥沉香，用于治療胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急。白木香果實(shí)Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.fruits果實(shí)為蒴果，其蒴果果梗短，卵球形，幼時(shí)綠色，長2cm～3cm，直徑約2cm，頂端具短尖頭，基部漸狹，密被黃色短柔毛，2瓣裂，2室，每室具有1粒種子。白木香種子Aquilariasinensis（Lour.）Gilg.seeds白木香的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子褐色、卵球形，長約1cm，寬約5.5mm，疏被柔毛，基部具有附屬體，附屬體長約1.5cm，上端寬扁，寬約4mm，下端成柄狀。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過前處理的白木香種子置于液氮（-196℃）中保存。種子的選擇果實(shí)采收5月底至6月中旬，當(dāng)果皮顏色由綠轉(zhuǎn)為黃白，果實(shí)自然開裂，種子呈棕褐色時(shí)即可采收，去除果皮和附屬體，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過15d）。種子前處理生活力檢測參照GB/T3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法檢測種子生活力。隨機(jī)抽取30粒種子，剝?nèi)ネ鈱臃N皮，沿種脊小心將種子分成2爿后放培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)側(cè)面向下，滴入TTC溶液浸沒種子，室溫（25℃）避光放置4h后觀察染色結(jié)果。生活力計(jì)算直接用肉眼對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有活力的種子；否則為無生活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的白木香種子生活力應(yīng)≥85%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹白木香種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為5000:1，室溫條件下干燥處理24~32h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由35%~45%降至11%~13%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量白木香種子保存量不少于240粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式白木香種子超低溫保存的冷凍方式為直接冷凍法，即將待保存的白木香種子放入5mL凍存管中（每管20粒種子），迅速投入液氮中保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中凍存24h后取出凍存管，取出2個(gè)凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min。凍后種子生活力檢測取出1管解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測。當(dāng)種子生活力≥80%時(shí)視為保存成功。恢復(fù)培養(yǎng)將剩下1管解凍后的白木香種子，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中，溫度25℃~30℃，濕度70%~85%條件下培養(yǎng)，出芽周期大概20d。附錄TTC的配制和保存方法精密稱取TTC1.00g，溶于100mL磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為1%的TTC溶液，調(diào)pH至6.5~7.5，置棕色瓶內(nèi)4℃冰箱備用。磷酸緩沖液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氫鉀溶于1L無菌水中；溶液II：35.81g磷酸二氫鈉溶于1L無菌水中；I：II=2：3的比例混合制成磷酸鹽緩沖液）參考文獻(xiàn)[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].XX，中國醫(yī)藥科技出版社，2015，185-186[2]中國科學(xué)院中國植物志委員會(huì).中國植物志.第52（1）卷[M].科學(xué)出版社，2004（1999）：290[3]WangYinzheng.MichaelG.Gilbert.BrianMathew.ChristopherD.Brickell.LorinI.Nevling.Thymelaeaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2007.13:214-215.[4]傅家瑞，宋松泉.頑拗性種子生物學(xué)[M].中國科學(xué)文化出版社，2004:1[5]ReedBM.Pla