腦彌漫性軸索損傷實驗裝置的研制及動物模型的建立

腦彌漫性軸索損傷實驗裝置的研制及動物模型的建立

作者：劉曉斌，宋錦寧，陳景宇，張芬茹，劉守勛【摘要】

目的自制一種腦彌漫性軸索損傷(DAI)裝置并成功建立DAI動物模型。方法自制頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置，使大鼠頭顱在瞬間(<3ms)旋轉(zhuǎn)90°造成剪切損傷。觀察損傷后大鼠的生命體征及行為學改變；于傷后2、6、12、24、36、72h及10d分別處死損傷組動物，制備腦石蠟切片，行鍍銀及HE染色，光鏡下觀察神經(jīng)軸索變化。結(jié)果傷后大鼠均即刻出現(xiàn)原發(fā)昏迷，其中2只于損傷后20min內(nèi)死亡，余持續(xù)時間1-30min不等；傷后大鼠呼吸節(jié)律紊亂，瞳孔對光反射減弱或消失，醒后均有程度不等的反應(yīng)性下降，肢體活動遲緩；肉眼可見廣泛蛛網(wǎng)膜下腔出血或腦室出血；光鏡下可見皮髓交界區(qū)、胼胝體區(qū)、腦干、小腦白質(zhì)等部位的神經(jīng)軸索有不同程度的腫脹、斷裂、軸索球形成，后期有小膠質(zhì)細胞增生，局部呈巢樣聚集。結(jié)論本裝置能造成大鼠腦DAI，且具有簡便、可控、確切的特點，適合進行中、小型動物DAI模型的實驗研究?！娟P(guān)鍵詞】

彌漫性軸索損傷實驗裝置動物模型大鼠ABSTRACT:Objective

Todesignanewexperimentalfacilitytoinduceratdiffuseaxonalinjurymodel.Methods

Ratdiffuseaxonalinjurywasinducedbyanewexperimentalfacility,whichwasdevelopedtolettheratheadspin90degreeatthemomenttocauseshearinginjury.Vitalsignandbehaviorofratweremeasuredsimultaneously.Theratsweresacrificedat2h,6h,12h,24h,36h,72hand10dafterinjury,respectively,andthebraintissueswereremovedtoprepareparaffinsection.ThensilverstainingandHEstainingwereconductedtoinvestigatechangesofaxonalfibers.Results

Therewereunconsciousness,respiratoryrhythmdisturbanceandhyporeflexiaofpupillightrefleximmediatelyafterinjury,andreactivenessdecreaseandactivityretardationstillexistedevenafterresumingconsciousness.Atanatomicalscene,subarachnoidhemorrhageorcerebroventricularhaemorrhagewerewidespread.Atanearlystage,therewereswelling,collapse,andaxonalretractionballformationatcortico-medullajunction,callosum,brainstem,andcerebellarwhitematterundermicroscope.Butatthelaterstage,gittercellproliferationandnest-likeaggregationweremajorpathophysiologicalchangesatfocalbraintissue.Conclusion

Thenewexperimentalfacilityissuitabletobeusedtoinduceratdiffuseaxonalinjury,sinceitisconvenient,controlable,andprecise.KEYWORDS:diffuseaxonalinjury;experimentalfacility;animalmodel;rat彌漫性軸索損傷(diffuseaxonalinjury,DAI)是一種常見的特殊類型的腦外傷，致殘率和死亡率高，其致傷機制目前仍在不斷地研究、探索中。因此，使用可靠的致傷裝置建立一個合理且可重復的DAI動物模型，對深入細致地研究DAI具有重要意義。根據(jù)DAI可能的生物力學機制，我們參照Smith和賀氏旋轉(zhuǎn)損傷裝置［1-2］，自制了大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置并成功建立了大鼠腦DAI模型。1

材料與方法1.1

DAI損傷裝置的設(shè)計及制作1.1.1

原理DAI最常見于車禍顱腦損傷患者。車禍傷患者受力復雜，同時混有旋轉(zhuǎn)加速-減速運動。根據(jù)這一受傷機制，我們參照國內(nèi)、外有關(guān)旋轉(zhuǎn)損傷裝置，自制一瞬間旋轉(zhuǎn)加-減速損傷裝置，可使大鼠頭顱在瞬間旋轉(zhuǎn)15°-90°，并在極短時間內(nèi)減速停止運動，造成大鼠腦損傷。

1.1.2

組成

①固定部分：包括門齒孔、一對橫向桿及雙側(cè)耳棒(門齒孔長2cm，門齒孔距耳棒4cm；橫向桿長度7cm，間距6cm)。②驅(qū)動彈簧：由優(yōu)質(zhì)粗鋼絲制成，經(jīng)烘烤定型后安裝固定在旋轉(zhuǎn)裝置的軸承上，預先扭轉(zhuǎn)180°使其處于備用狀態(tài)，此時與軸承連帶之橫向桿呈上下排列。驅(qū)動彈簧備有5圈7mm、6圈6mm、7圈6mm等不同規(guī)格，可根據(jù)不同要求進行更換。本實驗使用的是6圈6mm規(guī)格的驅(qū)動彈簧。③回位旋紐：用扳子將其順時針擰動90°，可使橫向桿由上下排列變?yōu)樗脚帕?。④扳機：向下按動，彈簧可獲釋放，固定部分遂以橫向桿連線中點為軸心逆時針轉(zhuǎn)動90°。⑤旋轉(zhuǎn)角度限位孔：備有15°、30°、45°、60°、75°、90°限位孔，將限位銷插入任一孔，按下扳機后固定部分即由水平位逆時針轉(zhuǎn)至該孔所標角度。⑥驅(qū)動彈簧力量調(diào)節(jié)孔：備有6個與旋轉(zhuǎn)角度限位孔對應(yīng)的調(diào)節(jié)孔，可調(diào)節(jié)驅(qū)動彈簧的力量以用于不同的實驗要求。⑦限位盤：限位盤有90弧度的空間，通過與限位孔中的限位銷撞擊，可產(chǎn)生角加速旋轉(zhuǎn)后的減速運動，更能模擬DAI的實際致傷狀況(圖1)。1.1.3

使用

使用時裝置固定在一個穩(wěn)定的實驗臺上。動物麻醉后頭顱經(jīng)耳棒及門齒孔固定于橫向桿上,軀干與實驗臺成30°角俯臥于厚20cm的海綿墊上，選定旋轉(zhuǎn)角度，按動扳機，彈簧驅(qū)動固定部分旋轉(zhuǎn)，使頭顱于冠狀面逆時針快速轉(zhuǎn)動至預定角度，隨即限位盤與限位銷撞擊產(chǎn)生瞬間急速停止，完成致傷。順時針擰動回位旋鈕，卸下動物，使裝置處于備用狀態(tài)進行下次致傷。1.2

DAI模型的建立

選取健康成年清潔級SD大鼠24只，雌雄各半，體重250-355g，隨機分為正常對照組和致傷組，其中致傷組又分為傷后2、6、12、24、36、72h、10d七個亞組，每組3只。各組大鼠經(jīng)100g/L水合氯醛麻醉(0.2-0.3mL/100g)后，固定于旋轉(zhuǎn)裝置上。致傷組大鼠蘇醒后出現(xiàn)較劇烈掙扎后，在掙扎間歇期，按動扳機，致其頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)90°。正常對照組大鼠蘇醒后即從裝置上卸下。記錄各組大鼠生命體征及行為變化。損傷組在預定時間、正常組在觀察6h后，用100g/L水合氯醛腹腔麻醉，快速開胸，左心室插管至主動脈，灌注9g/L生理鹽水至流出液清亮后，換40g/L多聚甲醛溶液灌注，至大鼠四肢及尾巴抽搐、雙肺及肝臟變白為止(灌注壓：12.5-15.6kPa，以上操作于10min內(nèi)完成)；灌注完成后即迅速取腦，完整剝離全腦(腦干、小腦及大腦)同時肉眼觀察大體病理變化，每組標本組織投入40g/L多聚甲醛溶液于4℃下后固定48h；大腦、小腦沿冠狀面自中線切開，腦干沿正中矢狀面切開，分別洗滌24h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，包埋制成蠟塊備切片用。每組標本的蠟塊均自后向前行連續(xù)切片，片厚5μm，取連續(xù)6張切片裱片，其中3張用于HE染色，另外3張用于Glees-Marsland鍍銀染色。2

結(jié)果2.1

大鼠傷后生命體征及行為學變化

致傷組大鼠傷后均立即出現(xiàn)不同程度的原發(fā)性昏迷，表現(xiàn)為無自主活動，刺痛無防御性反應(yīng)；瞳孔對光反應(yīng)消失或遲鈍，角膜反射減弱或消失，閉眼或無睜眼活動?；杳猿掷m(xù)時間1-30min不等，平均11.67min。其中1例損傷嚴重者于致傷后5min出現(xiàn)口鼻及雙側(cè)外耳道流血，四肢抽搐呈去大腦強直狀，隨即呼吸停止，死亡。觀察生命體征變化發(fā)現(xiàn)，致傷組大鼠傷后均有呼吸節(jié)律紊亂，表現(xiàn)為呼吸深慢到淺快，最后清醒恢復正常節(jié)律；有6只大鼠傷后出現(xiàn)小便失禁現(xiàn)象。致傷組昏迷清醒后(昏迷清醒的判斷標準：①出現(xiàn)復正體位；②瞳孔對光反應(yīng)恢復；③刺痛反應(yīng)明顯)的表現(xiàn)：①反應(yīng)遲鈍，不思飲食，持續(xù)約10h；②四肢活動減少、遲緩，行走不穩(wěn)，持續(xù)約8h。正常對照組大鼠麻醉清醒后從裝置上卸下，其生命體征正常，活動自如，反應(yīng)敏捷，迅速逃跑。

2.2

大鼠神經(jīng)病理學改變

正常對照組大鼠肉眼無病理改變。光鏡下HE染色見神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，膠質(zhì)細胞分布正常；微血管管壁完整，內(nèi)皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，管腔內(nèi)無微血栓形成；死亡的大鼠死后立即解剖取腦，肉眼見腦干區(qū)硬膜下血腫形成及廣泛蛛網(wǎng)膜下腔出血。致傷組大鼠肉眼可見廣泛蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦室出血，腦底面可見小針尖樣出血灶，無腦挫裂傷；光鏡下HE染色軸索球難與神經(jīng)元胞體區(qū)別，故HE染色不易發(fā)現(xiàn)軸索球，但可觀察到傷后12h神經(jīng)元腫脹，至24h神經(jīng)元壞死達高峰，36h后開始出現(xiàn)膠質(zhì)細胞增生聚集現(xiàn)象，10d后仍明顯(圖2)。正常對照組大鼠腦組織光鏡下Glees-Marsland鍍銀染色見大、小腦白質(zhì)及腦干神經(jīng)軸索走行自然、光滑，粗細基本均勻，排列緊密；致傷組大鼠傷后6h在大腦矢狀竇旁皮髓交界區(qū)、腦干頭端、小腦白質(zhì)區(qū)可見迂曲腫脹的軸突，12h后可見明顯的軸索球形成，至24h后，軸索球最明顯、典型，數(shù)量最多；72h后軸索球減少，但膠質(zhì)細胞增生明顯，10d后軸突損傷性改變明顯減輕，膠質(zhì)細胞彌漫性增生(圖3)。3

討論DAI在重型顱腦損傷中占28%-42%，病死率高達42%-62%，是導致顱腦損傷患者重殘和植物生存的最常見原因［3］。各種暴力均可造成頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)，使腦在慣性趨導下作非線性加/減速運動，期間產(chǎn)生的一種與旋轉(zhuǎn)軸相垂直的剪切力。這一剪切力作用于橋靜脈，引起蛛網(wǎng)膜下腔出血，作用于腦實質(zhì)微血管，可致腦組織內(nèi)點狀出血，作用于神經(jīng)纖維，致軸索損傷。DAI以交通事故傷多見。這是因為車禍時頭部處于活動狀態(tài)，由于腦各組織間的物理質(zhì)量不同，其運動速度不均，易受剪力作用引起白質(zhì)廣泛損傷造成DAI［4-6］。有關(guān)DAI研究的動物模型，國內(nèi)外已有較多研究。目前主要用于研究DAI的模型有液壓損傷模型、加減速損傷模型、牽拉損傷模型及瞬間旋轉(zhuǎn)損傷模型。因旋轉(zhuǎn)角速度使腦內(nèi)產(chǎn)生剪切力的損傷模型比其他模型更符合DAI的受傷機制，故目前認為，頭顱瞬間高速旋轉(zhuǎn)是制作腦DAI動物模型的理想致傷方式［7-8］。本實驗在參照Smith及賀氏旋轉(zhuǎn)損傷裝置的基礎(chǔ)上，根據(jù)旋轉(zhuǎn)角加速度及減速性損傷機制，自行設(shè)計、制作了一套瞬間旋轉(zhuǎn)加/減速損傷裝置，以大鼠為研究對象進行DAI研究。本裝置以大鼠腦質(zhì)量為中心，通過一個性能可靠、重復性好的彈簧為驅(qū)動力，帶動與固定鼠頭部件相連的軸承在瞬間作沿冠狀面的高速側(cè)向旋轉(zhuǎn)，當轉(zhuǎn)動至預定角度時，通過與軸承同軸轉(zhuǎn)動的限位盤撞擊限位銷，使運動突然停止。本裝置在致傷過程中經(jīng)過兩次加速度：一是驅(qū)動彈簧通過頭部固定部件使鼠頭作弧形角加速度旋轉(zhuǎn)，此過程為加速性角加速度；當撞擊固定桿后，使運動突然停止，帶動鼠頭作第2次加速度，此次加速度為減速性角加速度。因此，鼠頭在旋轉(zhuǎn)過程中經(jīng)歷了一個加速度－減速度的變化。本裝置致傷的大鼠，傷后均出現(xiàn)原發(fā)性昏迷，且有呼吸節(jié)律紊亂等腦干功能的異常，嚴重者可以死亡。大體病理可見蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦室出血，其中死亡的大鼠在腦干區(qū)有硬膜下血腫形成；組織切片嗜銀染色在腦干、大腦灰白質(zhì)交界區(qū)、小腦白質(zhì)等區(qū)域可見軸索腫脹、斷裂，軸索球形成等DAI特征病理像，腦干和胼胝體的纖維束間可見點狀出血灶。上述病理與臨床表現(xiàn)是一致的，這不但表明本裝置可用于制作大鼠腦DAI模型，而且也提示了旋轉(zhuǎn)剪切性損傷是導致腦DAI的確切生物力學機制。

本裝置與其他旋轉(zhuǎn)損傷裝置最大的不同點是：增加了一個與旋轉(zhuǎn)軸承同軸轉(zhuǎn)動的限位盤。在按下扳機釋放驅(qū)動彈簧，使大鼠以其腦質(zhì)量為中心逆時針瞬間側(cè)向旋轉(zhuǎn)(經(jīng)門齒孔及雙側(cè)耳棒固定大鼠頭部，其腦組織即位于旋轉(zhuǎn)受力的中心)后，在旋轉(zhuǎn)到預定角度時，限位盤與限位銷撞擊而突然停止旋轉(zhuǎn)，隨即產(chǎn)生一次減速性角速度損傷。這樣一種加速度－減速度損傷過程更加符合臨床實際。臨床上DAI患者多見于交通事故傷，頭部致傷力以旋轉(zhuǎn)暴力和直線加減速暴力為主［9］，故在實際受傷過程中，頭部將會經(jīng)歷加速度-減速度性的損傷作用。此外，本裝置還設(shè)計了驅(qū)動彈簧限位孔，可以通過改變驅(qū)動彈簧的力矩來調(diào)節(jié)驅(qū)動彈簧的力量，從而滿足不同的實驗要求；本