分子生物學(xué)實驗DNA片段擴(kuò)增及DNA連接-PCR講解

一、PCR實驗背景二、PCR基本原理三、PCR引物設(shè)計原則四、PCR反應(yīng)注意事項五、常見問題與對策六、PCR的應(yīng)用講解內(nèi)容

第二次實驗課、DNA片段擴(kuò)增及DNA連接一．實驗背景

Thepolymerasechainreaction(PCR)isinventedbyK.Mullisin1985.ThistechniqueisusedtoamplifyaspecificsequenceofDNAinvitrobysimulatingthereplicationprocedureofnaturalDNAinvivo.PCRenableustounlimitedlyamplifyDNAfragments.TheNobelPrizeinChemistry1993體外擴(kuò)增特異DNA片段二．PCR基本原理3’5’3’5’PCR3’5’5’3’5’5’targetsequence在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。模板（DNA或cDNA）2

l10PCRbuffer（含MgCl2）

5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物

(10mol/L)1l3’引物

(10mol/L)1l去離子水（補(bǔ)足反應(yīng)體系）

39lTaqDNApol.(2U/l)1l

輕彈管底混合（用離心機(jī)甩一下）50l在一微量離心管中依次加入下列試劑：加入順序不是隨機(jī)的：DNA聚合酶一定要最后加入。PCR儀設(shè)定的反應(yīng)條件：94oC45SDNA變性55

oC45SDNA復(fù)性72

oC1min產(chǎn)物鏈延伸

25-30個循環(huán)后72

oC10min

一般地，基因片段在500-1000bp左右時，可按下列條件進(jìn)行PCR：介紹：PCR儀如果上蓋加熱的PCR儀，可以直接放入儀器中進(jìn)行PCR；如果下面加熱的PCR儀，加入2滴礦物油后，加入儀器中，不過這種儀器現(xiàn)在已經(jīng)很少用到。PCR儀內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)變性退火延伸551234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束

PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA產(chǎn)物逐漸積累，在引物、模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比例時，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，又稱“平臺期”。到達(dá)平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率等因素。pre-denaturation95℃for5min;Denaturation:95℃for30~60sAnnealing:37~68℃for30~60sextension:72℃for30s~2min72℃extensionfor10min

30cycles反應(yīng)分三步：①變性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension）PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個關(guān)鍵條件在于引物的正確設(shè)計。引物設(shè)計的總原則就是提高擴(kuò)增的特異性，這取決于引物與模板的特異結(jié)合。PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′引物和3′引物。三、PCR引物的設(shè)計引物設(shè)計的基本原則引物的設(shè)計實例

(＊)

PCR引物設(shè)計的基本原則2.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。在NCBI上搜索該基因。通過序列同源性比較軟件（比如DNAman）比對（Alignment），相同的序列就是其保守區(qū)。1.引物的方向永遠(yuǎn)是5→3

引物長度一般在15~30核苷酸之間。

引物長度（primerlength）常用的是18-27bp。過短會使PCR的特異性降低；過長沒有必要。引物3′端要避開密碼子的第3位。因為密碼子的第3位易發(fā)生不改變aa突變。3.引物3’端是DNA延伸的起點，因此一定要嚴(yán)格與模板DNA配對。尤其是引物3′末端連續(xù)8個堿基要求與模板嚴(yán)格互補(bǔ)。但引物的3′端最好沒有連續(xù)3個G和C。否則會使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯誤配對。引物3′端最好選擇T？引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異。當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。引物3′端的從結(jié)合的角度講最佳堿基選擇是G和C。

a3'thymidine

ismorepronetomisprimingthantheothernucleotides.引物3’端堿基模板3’端堿基T1.01.01.0－C1.0<0.0111.0G1.0－1.0<0.01A－

1.0<0.05TCGA3ofGorCbasesat3’end.Thismaystabilizenonspecificannealingoftheprimer.4.堿基要隨機(jī)分布。引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象。5.引物GC含量在45-55%

(40%~60%)之間，Tm值最好接近72℃。上下游引物的GC含量不能相差太大。具有相似的Tm值。

引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃。Tm值最好接近72℃。

退火溫度：一般低于Tm值2~10℃。引物長度要確保Tm值不低于54°C。6.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)。尤其在引物3’末端。按經(jīng)驗，不能有連續(xù)4(5)個堿基的互補(bǔ)。引物3’末端一般不達(dá)到3bp。引物間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)，以免形成引物二聚體。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）PrimersThatFormHairpins?Aprimermaybeself-complementaryandbeabletofoldintoahairpin.?The3′endoftheprimerisbase-paired,preventingitannealingtothetargetDNA.5′-GTTGACTTGATAT3′-GAACTCTPrimersThatFormDimers?Primerpairsshouldbecheckedforcomplementarityatthe3'-end.Thisoftenleadstoprimer-dimerformationwithitselforwiththeotherprimer.?Primerdimerscanbeanexcellent,butunwanted,substratefortheTaqpolymerase.5′-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3′

3′-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5′7.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。

引物5′端修飾包括：加酶切位點；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；加入其它短序列包括起始密碼子，終止密碼子。引入啟動子序列等。標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等；引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。在PCR的起始反應(yīng)中，引物5′端游離的堿基并不影響引導(dǎo)新生鏈DNA合成的能力。但在后續(xù)的擴(kuò)增循環(huán)中，這些與初始模板不配對的序列被帶到PCR產(chǎn)物的雙鏈中去，所以如此引物參與的PCR產(chǎn)物，既含有目的擴(kuò)增片段又含有兩側(cè)引入的核苷酸序列。8.引物5′端和中間△G值應(yīng)該相對較高，而3′端△G值較低。△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進(jìn)行分析）9.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實驗了。10.引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。與模板之間的特異性結(jié)合序列一般不少于15-18bp。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。引物設(shè)計

1、GC比值：堿基對中的GC之間有三條氫鍵，AT之間有兩條氫鍵，GC和AT在引物序列中的合理比例是設(shè)定PCR退火溫度的重要依據(jù)。通常在一個引物中GC和AT各半。

2、引物特異序列的長度至少為15-18bp。

3、引物的方向：引物的方向永遠(yuǎn)是5‘→3’方向，正向（Sense）引物是與一股模板DNA序列相一致的，而反向（Antisense）引物則與這股模板DNA序列相互補(bǔ)。

4、引物的酶切位點：通常在引物的5‘-端設(shè)計適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c。兩種酶切位點使克隆具有方向性。

5、引物上啟始和終止密碼：如果想表達(dá)DNA片段，所用的載體又不含啟始密碼和終止密碼，應(yīng)將其設(shè)計在引物的酶切位點之后、特異性DNA序列之前。

6、如果表達(dá)的蛋白用親合層析方法純化，可將必要的序列設(shè)計在引物中以使所表達(dá)的融合蛋白易于純化。specificity:

conservedgenomicregion.

<75%homologouswithotherregion.Specially,8basesat3’end.(2)specificsequencelength:15/18～30base.(3)G+Ccontents＝45-55%.ATCGrandomdistributed(4)Avoidhairpinineachprimer,speciallyat3’end.(5)Avoidcomplementbetweenprimers(4bp以上）,speciallyat3’end.

(6)uniquerestrictionenzymesites

canonlybeaddedtothe5’endoftheprimers.(7)Tisthebestcandidateat3’end？

小結(jié):引物設(shè)計時應(yīng)遵循的原則(＊)GeneralrulesforPrimerdesign引物的設(shè)計實例

(＊)已知IFN-cDNA序列,你該如何設(shè)計引物？atgaaatataca

agttatatct

tggcttttca

gctctgcatc

gttttgggtt

ctcttggctg

ttactgccag

gacccatatg

taaaagaagc

agaaaacctt

aagaaatatt

ttaatgcagg

tcattcagat

gtagcggata

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tttcttaggc

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ggagagtgac

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ttttacttca

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aaacagggaa

gcgaaaaagg

agtcagatgc

tgtttcaagg

tcgaagagca

tcccagtaaatgaaatataca

agtgaagagca

tcccagtaaatgaaatataca

agt3’5’3’5’上游(5’)引物的結(jié)合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的結(jié)合設(shè)計引物時:

5′引物與位于待擴(kuò)增片段5′上游的一小段DNA序列相同，以信息鏈的互補(bǔ)鏈為模板，引導(dǎo)信息鏈的合成;

3′引物與擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)，引導(dǎo)互補(bǔ)鏈的合成。PCR反應(yīng)擴(kuò)增的就是這一對引物之間的DNA片段。答：5’引物照抄，3’引物互補(bǔ)倒讀；酶切位點加在引物的5’；調(diào)GC含量的堿機(jī)放在最前邊；此外無發(fā)夾結(jié)構(gòu)、與基因組其它區(qū)域的同源性較差。atgaaatataca

agtgaagagca

tcccagtaaatg

aaatataca

agt3’5’3’5’上游(5’)引物的結(jié)合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的結(jié)合----:ForG+CcontentSenseprimer:

5’－GCAGCGGATCCATG

AAATATACAAGT－3’15bpGC=11AT=15Anti-Senseprimer:5’－ATCGGAATTCTTA

CTGGGATGCTCTTC－3’17bpBamHIstartcodonGC=12AT=15EcoRIstopcodon引物的方向是5→3：特異性序列是否少了點?通常在引物的5‘-端設(shè)計適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c引物設(shè)計軟件介紹：PrimerPremier5.0顧名思義，該軟件就是用來進(jìn)行引物設(shè)計的。可以簡單地通過手動拖動鼠標(biāo)以擴(kuò)增出相應(yīng)片段所需的引物，而在手動的任何時候，下面顯示各種參數(shù)的改變和可能的二聚體、異二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。也可以給定條件，讓軟件自動搜索引物，并將引物分析結(jié)果顯示出來。而且進(jìn)行這些操作非常簡單Oligo6.57引物分析著名軟件，主要應(yīng)用于核酸序列引物分析設(shè)計軟件，同時計算核酸序列的雜交溫度（Tm）和理論預(yù)測序列二級結(jié)構(gòu)。PrimerD'Signer1.1免費的引物設(shè)計輔助軟件，專門用于pASK-IBA和pPR-IBA表達(dá)載體，簡化引物設(shè)計工作。四．PCR反應(yīng)注意事項OptimizationofPCRcondition

＊

PCR方法操作簡便，但影響因素頗多。去離子水（補(bǔ)足反應(yīng)體系）

39l模板2

l10PCRbuffer（含MgCl2）

5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物

(sense10mol/L)0.5~1

l3’引物

(anti-sense10mol/L)0.5~1

lTaqDNApol.(2U/l)1l

輕彈管底混合（用離心機(jī)甩一下）（一）、PCR反應(yīng)體系

-----finalvolume

50l加各種成分最好在冰上進(jìn)行。

1.模板DNA不是越多越好：2

l

1)在一定范圍內(nèi)PCR產(chǎn)量隨模板濃度的升高而顯著升高，2)但模板濃度過高會導(dǎo)致引物無法與模板結(jié)合，反應(yīng)的非特異性增加。3)一般采用102105拷貝的待擴(kuò)增片段作為模板:微克水平的基因組DNA、重組質(zhì)粒DNA用ng水平的量。4)模板過多還能大量消耗鎂離子。Theamountoftemplate—“moreisless”.Don’taddtoomuchtemplateTemplateDNA不能含有其提取時所用試劑：提取genomicDNA的基本過程：（1）裂解細(xì)胞，消化蛋白質(zhì)，抑制DNaseactivity

proteinaseK＋SDS＋EDTA

（2）然后用酚－氯仿多次抽提，去除蛋白質(zhì)（3）用RNase去除RNA

（4）用乙醇沉淀DNA，airdry,無菌水溶解。2.引物：0.5lPrimer1:OD=5

PCR反應(yīng)引物濃度為0.1~0.5μmol/L,引物與模板的摩爾比至少為108：1。

如此過量的引物才能確保模板DNA一旦變性就與引物退火，而不能與其自身退火。但引物濃度太高，（1）會增大引物結(jié)合到不嚴(yán)格配對區(qū)域的機(jī)會，這樣的錯配會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增;（2）可增加引物之間形成二聚體的幾率，降低擴(kuò)增效率。但如果該比例太低，PCR效率也會降低。primers

引物的配制Primer1:OD=5注意：凍干品，計算一管引物的總含量或克分子數(shù)先配成100mM的濃度作為儲存液工作液:10mol/L,-20℃保存。50l反應(yīng)體系中加：0.5～1l,

終濃度：0.1~0.2mol/L如果需要反復(fù)應(yīng)用的引物，配制后一定要分裝保存，一段時間后棄掉。切記：不要將合成回來的引物一次性配成工作液！primersRT的引物選擇：

Oligo(dT)15-18Specificanti-senseprimerRandomprimer因為基因序列與mRNA序列是一致的。病毒RNA作為RT模板時，一定要知道病毒是屬于哪一種病毒：正鏈RNA病毒？負(fù)鏈RNA病毒？正鏈RNA病毒：RT引物用anti-senseprimer；負(fù)鏈RNA病毒：RT引物用senseprimer。ThermostableDNApolymerase3.DNA聚合酶活性：5`--3`方向的聚合酶活性。在75~80℃具有最高的聚合酶活性。半衰期：95℃，40分鐘缺乏3`--5`外切酶活性。因此沒有校正功能。Fidelity（保真度）：PCR反應(yīng)的錯配率一般為1~2X10-4AnextraA（3.1）TaqDNA聚合酶(2U/l)1l保存:在-20℃至少6個月。抑制劑:乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS等。內(nèi)源DNA污染:制備過程中殘留的原細(xì)菌DNA等。會在無模板對照管出現(xiàn)擴(kuò)增帶。在50μl反應(yīng)體系中加Taq:一般為0.5~2U，

TooLowConc.:lowactivity，PCR產(chǎn)物的量減少TooHighConc.:non-specificamplification.加各種成分最好在冰上進(jìn)行。操作時先加水，最后加酶（3.2）PfuDNA聚合酶此酶耐熱性極好，在97.5℃半衰期>3小時，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠實性比TaqDNA聚合酶高12倍。3→5proofreadingexonucleaseactivity.

withgreateraccuracy.

noextraA.（3.3）Vent-TMDNA聚合酶半衰期：100℃

，95分鐘

97.5℃

，

130分鐘其擴(kuò)增產(chǎn)物的長度可達(dá)10~13kb?；钚裕壕哂?5外切酶活性，具有校對功能，錯誤摻入率為1/31000。忠實性比TaqDNA聚合酶提高510倍。（3.4）TthDNA聚合酶半衰期：950C，20分鐘

活性：具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，可簡化RT-PCR。但不具35外切酶活性，沒有校對功能，催化聚合反應(yīng)的錯誤摻入率為1/500。緩沖液含50mmol/L的KCl可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會抑制TaqDNA聚合酶的活性。

4、10XPCRbuffer5lBuffer:10-50mmol/LTris-HCl

(pH8.3-8.8,20℃)。

5、Mg2+：20~25mmol/L3l

ForTaqpolymeraseactivity.

鎂離子濃度：1.5~2.0mmol/L

Concentration:tooLow:lowactivitytooHigh:non-specificamplificationTaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+

濃度過低，會顯著降低酶活性。Mg2+濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)體系中含有高濃度的primers、dNTP、EDTA時:

?上述分子中的磷酸基團(tuán)可與Mg2+結(jié)合而降低游離Mg2+濃度，從而影響TaqDNA聚合酶的活性。

?Vary[Mg2+]instepsof0.5mMWithin1.5~5.0mM;?Sometimesacompromisebetweenyieldandspecificity.dNTPs

貯備液：濃度為10mmol/L。（注：dNTP

具有較強(qiáng)的酸性，使用時應(yīng)用1mol/LNaOH將pH值調(diào)至中性(7.0~7.5)。分裝，－20℃存放，反復(fù)凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTPs濃度在20~200μmol/L。

dNTP濃度過高會增加非特異性配對堿機(jī)的錯誤摻入率。低濃度的dNTP會導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，減少PCR產(chǎn)物量，但可提高反應(yīng)的特異性及實驗的精確性。4種dNTP

濃度應(yīng)相同:錯誤堿基的摻入率降至最低。1kbgene:1l;2kbgene:2l6、底物:dNTPs（脫氧核苷三磷酸）

(10mmol/L)1l（被稀釋了50倍,即濃度：200mol/L）

7、

添加劑：

DMSO（二甲基亞砜）2.5l

相當(dāng)于將退火溫度提高了5℃。

但>10％的DMSO會對聚合酶活性產(chǎn)生不良影響。加入適量二甲基亞砜（終濃度：

5％）有利于引物、模板的解鏈，減少其二級結(jié)構(gòu)，1）為什么有時候需要進(jìn)行熱啟動？（二）、如何確定PCR的變性、退火和延伸溫度和時間？熱啟動：TaqDNA聚合酶在DNA雙鏈充分打開之后再加入PCR反應(yīng)體系中，這樣可保證模板DNA、引物變性充分，避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它二級結(jié)構(gòu)影響引物的退火，使引物能更加順利地、特異性地結(jié)合到模板上。熱啟動結(jié)束后暫停PCR反應(yīng)，在PCR儀上直接趁熱加入DNApol。OptimizingthePCRReactionprogram

變性溫度：一般選用94～

95

℃

。變性時間：可根據(jù)模板長短、G和C含量確定，一般采用30秒。

2）變性但過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性損失。HalflifeofTaqDNApolymerase：

92.5oC2h，

95oC40mins，

97oC5mins.

30cycleswillneed15min

3）退火溫度和時間PCR的基本流程：94oC,45sec55oC,1min72oC,2min退火溫度的變化是根據(jù)引物的GC比例、引物的長度調(diào)整的。AnnealingFrom45oCto60oC.

Usuallyitisaround55℃

for1min.

退火

溫度與引物序列關(guān)系非常密切，退火時間與引物長度和GC含量有關(guān)。引物長度一般在15-25bp之間。

Tm=4(G+C)+2(A+T)(a)AnnealingtemperatureistoohighPrimersandtemplatesremaindissociated.(b)Annealingtemperatureistoolow.Mismatchedhybrid.(c)Correctannealingtemperature.Primingoccuresonlyatthedesiredtargetsites.Howtodecideannealingtemperature?(a)(b)(c)溫度越高，特異性

(specificity)越高。Tm(meltingtemperature):atthistemperature,thecorrectlybase-pairdissociates(‘melts’).CalculatetheTmofaprimer(低于20個堿基的引物)

:Primer:5-AGACTCAGAGAGAACCC-3Tm=4℃×(G+C)+2℃×(A+T)=4℃×9+2℃×8=36℃+16℃=52℃Annealingtemperatureis1－4℃belowtheTmTwoprimers:identical/similar

Tm(above60℃)?Temperaturemustbeconfirmedpractically.引物中G、C含量高、長度長時，應(yīng)提高溫度。溫度：72℃，74℃，是Taq

酶的最適工作溫度。時間：根據(jù)待擴(kuò)增基因片段的大小確定延伸時間。

過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。

酶的延伸效率：1000bp/1min。

小于500bp，一般采用1分鐘即可；

500~2000bp:2min。

超過2000bp，一般可適當(dāng)延長延伸時間，3分鐘。

4）延伸溫度和時間典型的PCR條件：94～95℃30S，55℃1min，72℃2min

25～30個cycles后72℃延伸10min。循環(huán)次數(shù)：

25～30cycles

循環(huán)過多會增加堿基的錯配幾率。

4）循環(huán)次數(shù)總結(jié)：其他因素1）熱啟動：提高擴(kuò)增的特異性2）添加劑：DMSO消除引物與模板的二級結(jié)構(gòu)，降低DNA的解鏈溫度，增進(jìn)DNA復(fù)性時的特異配對。3）液體石蠟：防止反應(yīng)液蒸發(fā)后反應(yīng)成分的改變。HowbigisatargetDNA??typicallyinthesizerange100-1500bp.?Longertargetsareamplifiable—>25kb.?Requiresmodifiedreactionbuffer,cocktailsofpolymerases,andlongerextensiontimes.五、常見問題與對策PCR常見問題之一無擴(kuò)增產(chǎn)物---假陰性1.模板:①提取的模板核酸中含有雜蛋白質(zhì)、酚、EDTA等抑制了Taq