植物種質資源離體超低溫保存課件

植物種質資源離體超低溫保存植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述植物種質資源保存主要有原地保存、異地保存和設施保存3種方式.設施保存是當前最有效、最安全的保存方式,它包括種子低溫保存、超低溫保存及種質離體保存等方法.植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述植物種質資源保存主要有原地保存、異地保存和2第一節(jié)概述原地保存是指在植物資源豐富的地區(qū)建立自然保護區(qū)、原地保存林等，以保護植物種質資源及其生境；異地保存是指當天然群體的遺傳組成發(fā)生嚴重的變化，或存在潛在破壞威脅的物種，在植物種的非本地群體中收集種子或繁殖材料，營建異地保存林(圃)進行集中保存。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述原地保存是指在植物資源豐富的地區(qū)建立自然保護區(qū)3第一節(jié)概述設施保存，也叫設備保存、離體保存，就是利用種質資源庫(冷藏庫、超低溫庫、組織培養(yǎng)室)等保存設施長期保存種子、配子體、器官、組織、細胞等種質材料，來達到保存植物種質資源的目的，它也可以被看作是異地保存中的一種形式。設施保存可以大批量貯藏種質材料于一個較小的可以人工控制的空間，并能安全地保存種質30-50年以上，具有種質不易丟失、便于交換和利用等特點，是一種行之有效的保存方式。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述設施保存，也叫設備保存、離體保存，就是利用種質4第一節(jié)概述世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)在1978年出版的《植物紅皮書》一書中指出:在全世界分布的約25萬種維管束植物中，估計約有2萬一萬種(占整個區(qū)系成分的10%)處于很稀少或受嚴重威脅的狀況，這意味著人類賴以生存的植物資源陷人了生存危機。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)在1978年5第一節(jié)概述我國是一個植物資源豐富的國家，約有高等植物3萬多種，占世界第三位，位居北半球之首，并且特有程度高，生物區(qū)系起源古老，是世界上屈指可數(shù)的植物遺傳資源起源中心之一，但其物種流失的態(tài)勢也不容樂觀。據(jù)估計，我國有高等植物萬種，受到滅絕威脅的約有4000-5000種，占總數(shù)的12%一15%左右。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述我國是一個植物資源豐富的國家，約有高等植物6第一節(jié)概述早在上個世紀中葉，世界各國就已經開始進行植物(包括作物和森林植物)種質資源的收集和保存工作。聯(lián)合國糧農組織(FAO)在1947-1948年成立了“動植物遺傳資源委員會”，1967年成立了森林遺傳資源專家組。FAO/IBPGR支持和協(xié)調國家與地區(qū)的遺傳資源的調查、保存和利用，負責咨詢有關提案和計劃，并在利用有限資金保存作物種質資源。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述早在上個世紀中葉，世界各國就已經開始7第一節(jié)概述目前，發(fā)達國家的種質資源研究已進人到常規(guī)方法與分子技術相結合的研究階段，分子標記技術的利用大大加快了種質資源鑒定的速度和準確性。美國田間種植圃保存的10萬份無性繁殖生物種質資源，已有56%進行了同功酶,RAPD,AFLP和SSR等分子標記的種質學評價，33%的資源圃建立了核心種質資源。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述目前，發(fā)達國家的種質資源研究已進8第一節(jié)概述保存種子、配子、器官或組織等，在人工條件下使植物的基因(載體)能得到延續(xù)，為未來的植物利用、培育計劃服務，這是當前世界各國生物多樣性保護工作的重點之一。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述保存種子、配子、器官或組織等，9第一節(jié)概述全世界到1996年已建成1300多座植物種質資源保存庫，共保存各類植物種質610萬份(含重復)，其中低溫庫保存550萬份，田間種植保存庫52.7萬份，試管苗保存萬份。1958年建成的美國國家種質庫是世界上第一座現(xiàn)代化種質庫，該庫于1992年擴建成庫容100萬份的現(xiàn)代化國家種質庫，已保存各類植物種質資源55萬份，在科羅拉多FortCollins的種子庫則在一196℃保存了26萬份含水量6%的植物種子。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述全世界到1996年已建成130010第一節(jié)概述發(fā)展中國家印度也于1976年成立國家植物種質資源局(NBPGR)，下設30個單位組成全印植物種質資源保存體系，已保存20萬份種質，每年用于植物種質資源保存維護費110萬美元；1997年建成庫容100萬份的國家植物種質資源庫，成為世界植物種質資源大國。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述發(fā)展中國家印度也于1976年成立國11第一節(jié)概述英國皇家植物園邱園的千年種子庫工程(ms-BP)，是目前世界上最大的種質設施保存庫。該庫于2001年建成并投人使用，MSBP計劃到2010年使得全世界干早地區(qū)2.4萬種以上(約10%)的植物種子得到收集和保存，目前已收集保存了全英國95%的植物種質資源，并與澳大利亞、埃及、肯尼亞、南非等12個國家開展了合作，收集以干早地區(qū)為主的植物種質資源，計劃到2025年完成收集保存全球萬種植物(約占1000)種質資源的目標。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述英國皇家植物園邱園的千年種12第一節(jié)概述我國是植物種質資源豐富的國家，植物種質設施保存工作近幾年也有較大的發(fā)展，我國也已有一些科研單位建立了一批大、中、小型種質基因庫。特別是在農作物品種資源保存方面已初步形成體系，中國農科院在1984年和1986年分兩期在北京建立了一座較大型的國家農作物種質庫，包括一座長期庫和一座中期庫，而于90年代初又在青海建立了一個“復份庫”，至2000年，已保存了33萬份材料。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述我國是植物種質資源豐富的國家，植物13第一節(jié)概述但是，我國的林木及野生植物種質資源設施保存仍處于起步階段，中科院于1996年在西雙版納熱帶植物園建立了一個小型的熱帶瀕危植物種質庫，其實施保存的種質范圍僅限于熱帶地區(qū)的瀕危植物;中國林科院于2001年建成了一座小型低溫庫，目前保存了我國部分主要造林樹種的種質資源，尚未完成搶救保存任務，離全面保存我國森林植物的種質資源目標相去甚遠。目前，中國林科院牽頭的國家森林植物種質低溫庫正處于籌建當中，該庫能夠容納30萬份以上的林木種質，該庫的建成將完成搶救保存林木種質資源的任務。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述但是，我國的林木及野生植物種質資源14第一節(jié)概述一、植物種質資源低溫保存意義防止資源滅絕

節(jié)約人力物力

便于交流植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述一、植物種質資源低溫保存意義植物種質資源離體15第一節(jié)概述二、超低溫保存的概念一般來說，低溫所涉及的溫度范圍是不確定的。習慣上，人們將－80℃以下的低溫稱為超低溫，干冰溫度（－70℃）稱為極低溫，低溫則從4℃往下推（李廣武等，1998）。對植物而言，低溫常常是指那些比常溫稍低一些的溫度。如果低溫超過細胞原生質所能忍受的臨界溫度，就會致使植物細胞遭受凍害而死亡。如甜橙樹發(fā)生凍害的臨界溫度通常在－6.5℃，枳殼通常在－20℃左右（沈德緒等，1986）。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述二、超低溫保存的概念植物種質資源離體超低溫保存16第一節(jié)概述目前常用的超低溫保存方法可分為兩類，即冷凍誘導保護性脫水的超低溫保存和玻璃化處理的超低溫保存。在超低溫條件下，生物的代謝和衰老過程大大減慢，甚至完全停止，因此可以長期保存植物材料。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述目前常用的超低溫保存方法可分為兩類，即冷凍17第一節(jié)概述三、超低溫保存的研究概況1．超低溫保存技術的發(fā)展種質材料的超低溫保存，傳統(tǒng)的技術有干凍法、預凍法和兩步法，上世紀80年代末和90個代初玻璃化法和包埋脫水法開始應用于植物材料的超低溫保存。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述三、超低溫保存的研究概況植物種質資源離體超低溫18第一節(jié)概述2．用于離體超低溫保存的植物材料超低溫保存技術在保存植物花粉、種子和胚、芽、莖尖、胚狀體、原生質體、愈傷組織和懸浮細胞等方面有應用和報道。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述2．用于離體超低溫保存的植物材料植物種質資源離19第一節(jié)概述3．超低溫保存的植物種類目前主要應用在作物、果樹和園林花卉種質資源保存方面，林木種質資源的超低溫保存也有少量報道。超低溫保存已涉及到不同的植物種類，如野生及人工創(chuàng)造的谷類、豆類、薯類、油類、糖類、纖維類、蔬菜類、果樹、樹木、藥用植物和藻類等。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述3．超低溫保存的植物種類植物種質資源離體超低溫20第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎

一、細胞內外水的凍結狀態(tài)是細胞凍存技術的關鍵植物細胞中含有大量的水分，約占細胞總重量的60～90％。細胞中的水是由游離水和束縛水組成，其中游離水約占90％，很容易凍結。由于細胞內含有復雜的化合物，細胞內的溶液并不象純水那樣在0℃左右結冰。植物種質資源離體超低溫保存第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎一、細胞內外水的凍結21第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎理論上講，細胞外水的凍結溫度為－5～－15℃，細胞內游離水的凍結在－25℃。－30℃時，細胞幾乎沒有非凍結狀態(tài)的游離水存在，而結合水在－100℃溫度下也不凍結。根據(jù)Luyet的凍結理論（Luyet1937），細胞游離水的凍結溫度（－30℃）可被認為是細胞凍存的安全溫度，因而細胞凍存的兩步凍結法是以－30℃為基礎的?？刂萍毎麅韧馑膬鼋Y狀態(tài)是細胞凍存技術的關鍵。植物種質資源離體超低溫保存第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎理論上講，細胞外水的凍22第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎二、植物細胞超低溫保存過程中的致死損傷細胞超低溫保存有三個重要操作步驟：

一是細胞預凍；二是細胞在－196℃下長期貯存；三是細胞解凍。植物種質資源離體超低溫保存第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎二、植物細胞超低溫保存23第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎植物超低溫保存技術建立在生物細胞凍害和抗凍機理的基礎之上。種質超低溫保存成功的關鍵，在于降溫冰凍過程中避免細胞內結冰。為此，針對不同種類的植物材料，篩選適合的冰凍保護劑，采用適當?shù)慕禍乇鶅鏊俣群突瘍龇绞?，可能使細胞不受損傷或使損傷減小到最低程度。植物種質資源離體超低溫保存第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎植物超低溫保存技術24第三節(jié)超低溫保存的方法超低溫保存植物種質資源的程序包括下面幾個步聚：(1)前培養(yǎng):對培養(yǎng)體短期的生長鍛煉處理，使其提高耐液氮保存的能力。(2)防凍:培養(yǎng)體放人防凍液中，使其細胞降低冰點，減少因形成冰晶可能造成的損傷。(3)變溫冷凍:按照不同變溫模式降溫冷凍，降溫速度依不同種質材料采用特定的速度。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法超低溫保存植物種質資源的程序包25第三節(jié)超低溫保存的方法(4)超低溫保存:將冷凍材料保存到有效低溫環(huán)境中，以防止冰的游移或解體。(5)解凍:一般認為快速解凍更好。從液氮環(huán)境中取出封裝好的材料，與其容器一同放人+40℃的無菌水浴中，直到解凍后才回到室溫下，未封裝的材料放到20-30℃的液體培養(yǎng)基中解凍。(6)生命力測定:如用TTC染色法等。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法(4)超低溫保存:將冷凍材料保存到有26第三節(jié)超低溫保存的方法一、傳統(tǒng)的降溫冰凍方法1．快速冰凍法

2．慢速冰凍法

3．兩步法

4．逐級冰凍法植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法一、傳統(tǒng)的降溫冰凍方法植物種質資源離27第三節(jié)超低溫保存的方法二、玻璃化保存方法玻璃化（vitrification）是指液體轉變?yōu)榉蔷w（玻璃態(tài)）的固化過程。

使溶液玻璃化有兩條途徑：

一是大幅度提高冷卻速率；二是增加溶液濃度。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法二、玻璃化保存方法植物種質資源離體超28第三節(jié)超低溫保存的方法1．玻璃化法

是將生物材料經極高濃度的玻璃化溶液快速脫水后，直接投入液氮，使生物材料連同玻璃化溶液發(fā)生玻璃化轉變，進入玻璃態(tài)。此間水分子沒有發(fā)生重排，不形成冰晶，也不產生結構和體積的改變，因而不會對材料造成傷害。保存終止后，復溫時要快速化凍，防止去玻璃化的發(fā)生。材料能安全度過冷卻和化凍兩個關口，就可保證凍存的成功。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法1．玻璃化法

是將生物材料經極高29第三節(jié)超低溫保存的方法2．包埋玻璃化法

是包埋－脫水法和玻璃化法的結合。

保存材料先用藻酸鈣包埋，然后經蔗糖濃度梯度脫水和玻璃化溶液處理后直接浸入液氮保存，其材料存活率比用包埋—脫水法要高，可能是藻酸鈣包埋后減輕了玻璃化溶液的毒性。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法2．包埋玻璃化法

是包埋－脫水法30第三節(jié)超低溫保存的方法三、其它超低溫凍存方法1．干凍法（desiccation）利用無菌空氣流、干燥硅膠或飽和溶液表面的氣相等對種質材料進行脫水處理，然后快速將其投人液氮貯存。2．預培養(yǎng)法（pregrowth）也叫預凍法:將種質材料在添加保護劑(如蔗糖、二甲亞礬、甘油等)后置于低溫冰箱或液氮蒸汽箱(-10~-700C)中冰凍若干小時后投人液氮貯存。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法三、其它超低溫凍存方法植物種質資源離31第三節(jié)超低溫保存的方法3．預培養(yǎng)-干燥法(pregrowth-desiccation)

也叫兩步法，種質材料在添加保護劑后，用程序降溫儀以某個速率(每分鐘0.1~0.50C)降溫至轉移溫度(－40~－700C)，然后投人液氮中貯存，兩步法較預凍法更為嚴格。4．包埋脫水法（encapsulation-dehydration）莖尖、分生組織和體細胞胚等種質材料用褐藻酸鈣包埋后，第一階段先在含高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中脫水，第二階段用無菌空氣流或干燥硅膠脫水，然后投人液氮貯存。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法3．預培養(yǎng)-干燥法(pregrowt32第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素

一、材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗凍性及器官、組織和細胞的年齡以及生理狀態(tài)。不同基因型的植物離體材料對超低溫凍存的反應各不相同。植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素一、材料的基本特性植物33第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素二、預培養(yǎng)和低溫鍛煉預處理對于調整植物離體材料的生理狀態(tài)非常有效。通過預處理的植物材料，減少了細胞內自由水的含量，使細胞能經受低溫脅迫，減少或避免了冷凍傷害，可大大提高材料的抗凍力。植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素二、預培養(yǎng)和低溫鍛煉植物34第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素三、冰凍保護劑的應用

一般的生物體在沒有添加冰凍保護劑的情況下經歷低溫后是很難存活下來的。所以，生物體的低溫保存離不開冰凍保護劑（cryoprotectiveagent，CPA）。冰凍保護劑也稱作抗凍劑，合理地選擇冰凍保護劑，對低溫保存至關重要。植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素三、冰凍保護劑的應用

35第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素冰凍保護劑應具有以下特點：易溶于水，對細胞無毒，容易從組織細胞中清除。冰凍保護劑的作用主要表現(xiàn)在增加膜透性，加速細胞內的水流到細胞外結冰，穩(wěn)定細胞膜結構，阻止低溫傷害，降低冰點，提高溶液的粘滯性，阻止冰晶生長。

植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素冰凍保護劑應具有以下特點36第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素滲透型冰凍保護劑：多屬低分子中性物質，在溶液中易結合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的粘性增加，從而弱化了水的結晶過程，達到保護的目的。常用的滲透型冰凍保護劑有：甘油、二甲亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。但滲透型冰凍保護劑使用濃度、滲入細胞的能力、對水分子活性的影響等各不相同，如甘油適宜于慢速冷卻，而DMSO卻易于滲入細胞，并在常溫下稍有毒性。

植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素滲透型冰凍保護劑：植物種37第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素非滲透型冰凍保護劑：能溶于水，但不能進入細胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，可在特定溫度下降低溶質（電解質）濃度，從而起到保護作用。非滲透型冰凍保護劑主要有：聚乙烯吡咯烷酮（polyvingylpyrollidone，PVP）、蔗糖（sucrose）、葡聚糖（右旋糖酐，dextrane）、聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）、白蛋白（albumin）、羥乙基淀粉（hydroxyethylstarch，HES）等。此類冰凍保護劑對快速、慢速冷卻均有保護效果。植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素非滲透型冰凍保護劑：植物38第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素四、化凍方法液泡小、含水量少的細胞（如莖尖分生組織），可采用快速化凍的方法。液泡大、含水量高的細胞則一般需要采用慢速化凍法。生長季節(jié)中的材料，一般在37～40℃溫水浴中快速化凍比在室溫下慢速化凍要好。木本植物的冬芽，在超低溫保存后，必須在0℃低溫下進行慢速化凍才能達到良好的效果。玻璃化凍存的材料在保存終止后，要求快速化凍，以防止由于次生結冰對組織細胞造成的傷害。植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素四、化凍方法植物種質資源39第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素五、再培養(yǎng)

經凍存的材料會不可避免地受到不同程度的傷害。為了減少再培養(yǎng)中的光抑制，利于離體材料恢復生長，凍存的材料一般在黑暗或弱光下培養(yǎng)1～2周，再轉入正常光下培養(yǎng)。再培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基一般是與保存前的相同，但有時需將大量元素或瓊脂含量減半，有時則在培養(yǎng)基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生長的恢復。植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素五、再培養(yǎng)

經40第五節(jié)超低溫保存過程中的遺傳變異及其檢測技術無論哪種種質資源的保存方法都是以保持物種原有的遺傳特性為出發(fā)點。在超低溫保存過程中，植物材料是否發(fā)生變異是育種工作者十分關心的問題。在超低溫保存之前，外植體材料、培養(yǎng)繼代時間、培養(yǎng)基成分以及自然突變等因素都可能影響到保存材料的遺傳穩(wěn)定性。植物種質資源離體超低溫保存第五節(jié)超低溫保存過程中的遺傳變異及其檢測技術無論哪種種41第五節(jié)超低溫保存過程中的遺傳變異及其檢測技術為了掌握超低溫保存材料的遺傳變異情況，有必要在保存材料的恢復和再生階段建立有效的檢測體系。目前，形態(tài)學觀察、細胞學方法、同功酶、分子標記如RFLP和RAPD等檢測方法常常單獨或結合起來用于遺傳變異分析。植物種質資源離體超低溫保存第五節(jié)超低溫保存過程中的遺傳變異及其檢測技術為了掌握超42小結與展望自從人們認識到植物種質資源保存的重要意義之后，已從不同的角度，不同的層次對此問題展開了研究。近幾十年來取得了不少進展，但均因其本身的局限性或技術上的不成熟，而在實際應用中受到極大的限制。傳統(tǒng)的建立種質庫、常規(guī)的低溫保存或利用組織培養(yǎng)技術保存植物體的某一部分，均因其保存過程繁雜、保存下來的材料不穩(wěn)定、需耗費大量的人力物力等原因而受到限制。植物種質資源離體超低溫保存小結與展望自從人們認識到植物種質資源保存的重要意義之后，43小結與展望相對而言，超低溫保存卻顯示了其廣闊前景。超低溫保存材料的生理代謝可以得到最有效的控制，生活力下降和基因特異性喪失的可能性可降至最低限度，病原微生物的活動可受到足夠抑制。超低溫保存技術可以保護重要而稀有的基因型，保存無病材料，保持愈傷組織和細胞系的特殊生化能力，降低代謝、延遲衰老，保持形態(tài)發(fā)生潛能等。植物種質資源離體超低溫保存小結與展望相對而言，超低溫保存卻顯示了其廣闊前景。超低溫44小結與展望作為一種新穎的種質資源保存方法，它克服了其它保存方法的很多不足，但也存在涉及的試驗材料面窄，長期連續(xù)使用凍存材料的再生能力衰退，組織培養(yǎng)后代遺傳穩(wěn)定性仍未解決(莖尖生長點有可能解決這一問題)等問題。植物種質資源離體超低溫保存小結與展望作為一種新穎的種質資源保存方法，它克服了其它保45植物種質資源離體超低溫保存植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述植物種質資源保存主要有原地保存、異地保存和設施保存3種方式.設施保存是當前最有效、最安全的保存方式,它包括種子低溫保存、超低溫保存及種質離體保存等方法.植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述植物種質資源保存主要有原地保存、異地保存和47第一節(jié)概述原地保存是指在植物資源豐富的地區(qū)建立自然保護區(qū)、原地保存林等，以保護植物種質資源及其生境；異地保存是指當天然群體的遺傳組成發(fā)生嚴重的變化，或存在潛在破壞威脅的物種，在植物種的非本地群體中收集種子或繁殖材料，營建異地保存林(圃)進行集中保存。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述原地保存是指在植物資源豐富的地區(qū)建立自然保護區(qū)48第一節(jié)概述設施保存，也叫設備保存、離體保存，就是利用種質資源庫(冷藏庫、超低溫庫、組織培養(yǎng)室)等保存設施長期保存種子、配子體、器官、組織、細胞等種質材料，來達到保存植物種質資源的目的，它也可以被看作是異地保存中的一種形式。設施保存可以大批量貯藏種質材料于一個較小的可以人工控制的空間，并能安全地保存種質30-50年以上，具有種質不易丟失、便于交換和利用等特點，是一種行之有效的保存方式。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述設施保存，也叫設備保存、離體保存，就是利用種質49第一節(jié)概述世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)在1978年出版的《植物紅皮書》一書中指出:在全世界分布的約25萬種維管束植物中，估計約有2萬一萬種(占整個區(qū)系成分的10%)處于很稀少或受嚴重威脅的狀況，這意味著人類賴以生存的植物資源陷人了生存危機。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)在1978年50第一節(jié)概述我國是一個植物資源豐富的國家，約有高等植物3萬多種，占世界第三位，位居北半球之首，并且特有程度高，生物區(qū)系起源古老，是世界上屈指可數(shù)的植物遺傳資源起源中心之一，但其物種流失的態(tài)勢也不容樂觀。據(jù)估計，我國有高等植物萬種，受到滅絕威脅的約有4000-5000種，占總數(shù)的12%一15%左右。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述我國是一個植物資源豐富的國家，約有高等植物51第一節(jié)概述早在上個世紀中葉，世界各國就已經開始進行植物(包括作物和森林植物)種質資源的收集和保存工作。聯(lián)合國糧農組織(FAO)在1947-1948年成立了“動植物遺傳資源委員會”，1967年成立了森林遺傳資源專家組。FAO/IBPGR支持和協(xié)調國家與地區(qū)的遺傳資源的調查、保存和利用，負責咨詢有關提案和計劃，并在利用有限資金保存作物種質資源。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述早在上個世紀中葉，世界各國就已經開始52第一節(jié)概述目前，發(fā)達國家的種質資源研究已進人到常規(guī)方法與分子技術相結合的研究階段，分子標記技術的利用大大加快了種質資源鑒定的速度和準確性。美國田間種植圃保存的10萬份無性繁殖生物種質資源，已有56%進行了同功酶,RAPD,AFLP和SSR等分子標記的種質學評價，33%的資源圃建立了核心種質資源。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述目前，發(fā)達國家的種質資源研究已進53第一節(jié)概述保存種子、配子、器官或組織等，在人工條件下使植物的基因(載體)能得到延續(xù)，為未來的植物利用、培育計劃服務，這是當前世界各國生物多樣性保護工作的重點之一。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述保存種子、配子、器官或組織等，54第一節(jié)概述全世界到1996年已建成1300多座植物種質資源保存庫，共保存各類植物種質610萬份(含重復)，其中低溫庫保存550萬份，田間種植保存庫52.7萬份，試管苗保存萬份。1958年建成的美國國家種質庫是世界上第一座現(xiàn)代化種質庫，該庫于1992年擴建成庫容100萬份的現(xiàn)代化國家種質庫，已保存各類植物種質資源55萬份，在科羅拉多FortCollins的種子庫則在一196℃保存了26萬份含水量6%的植物種子。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述全世界到1996年已建成130055第一節(jié)概述發(fā)展中國家印度也于1976年成立國家植物種質資源局(NBPGR)，下設30個單位組成全印植物種質資源保存體系，已保存20萬份種質，每年用于植物種質資源保存維護費110萬美元；1997年建成庫容100萬份的國家植物種質資源庫，成為世界植物種質資源大國。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述發(fā)展中國家印度也于1976年成立國56第一節(jié)概述英國皇家植物園邱園的千年種子庫工程(ms-BP)，是目前世界上最大的種質設施保存庫。該庫于2001年建成并投人使用，MSBP計劃到2010年使得全世界干早地區(qū)2.4萬種以上(約10%)的植物種子得到收集和保存，目前已收集保存了全英國95%的植物種質資源，并與澳大利亞、埃及、肯尼亞、南非等12個國家開展了合作，收集以干早地區(qū)為主的植物種質資源，計劃到2025年完成收集保存全球萬種植物(約占1000)種質資源的目標。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述英國皇家植物園邱園的千年種57第一節(jié)概述我國是植物種質資源豐富的國家，植物種質設施保存工作近幾年也有較大的發(fā)展，我國也已有一些科研單位建立了一批大、中、小型種質基因庫。特別是在農作物品種資源保存方面已初步形成體系，中國農科院在1984年和1986年分兩期在北京建立了一座較大型的國家農作物種質庫，包括一座長期庫和一座中期庫，而于90年代初又在青海建立了一個“復份庫”，至2000年，已保存了33萬份材料。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述我國是植物種質資源豐富的國家，植物58第一節(jié)概述但是，我國的林木及野生植物種質資源設施保存仍處于起步階段，中科院于1996年在西雙版納熱帶植物園建立了一個小型的熱帶瀕危植物種質庫，其實施保存的種質范圍僅限于熱帶地區(qū)的瀕危植物;中國林科院于2001年建成了一座小型低溫庫，目前保存了我國部分主要造林樹種的種質資源，尚未完成搶救保存任務，離全面保存我國森林植物的種質資源目標相去甚遠。目前，中國林科院牽頭的國家森林植物種質低溫庫正處于籌建當中，該庫能夠容納30萬份以上的林木種質，該庫的建成將完成搶救保存林木種質資源的任務。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述但是，我國的林木及野生植物種質資源59第一節(jié)概述一、植物種質資源低溫保存意義防止資源滅絕

節(jié)約人力物力

便于交流植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述一、植物種質資源低溫保存意義植物種質資源離體60第一節(jié)概述二、超低溫保存的概念一般來說，低溫所涉及的溫度范圍是不確定的。習慣上，人們將－80℃以下的低溫稱為超低溫，干冰溫度（－70℃）稱為極低溫，低溫則從4℃往下推（李廣武等，1998）。對植物而言，低溫常常是指那些比常溫稍低一些的溫度。如果低溫超過細胞原生質所能忍受的臨界溫度，就會致使植物細胞遭受凍害而死亡。如甜橙樹發(fā)生凍害的臨界溫度通常在－6.5℃，枳殼通常在－20℃左右（沈德緒等，1986）。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述二、超低溫保存的概念植物種質資源離體超低溫保存61第一節(jié)概述目前常用的超低溫保存方法可分為兩類，即冷凍誘導保護性脫水的超低溫保存和玻璃化處理的超低溫保存。在超低溫條件下，生物的代謝和衰老過程大大減慢，甚至完全停止，因此可以長期保存植物材料。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述目前常用的超低溫保存方法可分為兩類，即冷凍62第一節(jié)概述三、超低溫保存的研究概況1．超低溫保存技術的發(fā)展種質材料的超低溫保存，傳統(tǒng)的技術有干凍法、預凍法和兩步法，上世紀80年代末和90個代初玻璃化法和包埋脫水法開始應用于植物材料的超低溫保存。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述三、超低溫保存的研究概況植物種質資源離體超低溫63第一節(jié)概述2．用于離體超低溫保存的植物材料超低溫保存技術在保存植物花粉、種子和胚、芽、莖尖、胚狀體、原生質體、愈傷組織和懸浮細胞等方面有應用和報道。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述2．用于離體超低溫保存的植物材料植物種質資源離64第一節(jié)概述3．超低溫保存的植物種類目前主要應用在作物、果樹和園林花卉種質資源保存方面，林木種質資源的超低溫保存也有少量報道。超低溫保存已涉及到不同的植物種類，如野生及人工創(chuàng)造的谷類、豆類、薯類、油類、糖類、纖維類、蔬菜類、果樹、樹木、藥用植物和藻類等。植物種質資源離體超低溫保存第一節(jié)概述3．超低溫保存的植物種類植物種質資源離體超低溫65第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎

一、細胞內外水的凍結狀態(tài)是細胞凍存技術的關鍵植物細胞中含有大量的水分，約占細胞總重量的60～90％。細胞中的水是由游離水和束縛水組成，其中游離水約占90％，很容易凍結。由于細胞內含有復雜的化合物，細胞內的溶液并不象純水那樣在0℃左右結冰。植物種質資源離體超低溫保存第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎一、細胞內外水的凍結66第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎理論上講，細胞外水的凍結溫度為－5～－15℃，細胞內游離水的凍結在－25℃。－30℃時，細胞幾乎沒有非凍結狀態(tài)的游離水存在，而結合水在－100℃溫度下也不凍結。根據(jù)Luyet的凍結理論（Luyet1937），細胞游離水的凍結溫度（－30℃）可被認為是細胞凍存的安全溫度，因而細胞凍存的兩步凍結法是以－30℃為基礎的。控制細胞內外水的凍結狀態(tài)是細胞凍存技術的關鍵。植物種質資源離體超低溫保存第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎理論上講，細胞外水的凍67第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎二、植物細胞超低溫保存過程中的致死損傷細胞超低溫保存有三個重要操作步驟：

一是細胞預凍；二是細胞在－196℃下長期貯存；三是細胞解凍。植物種質資源離體超低溫保存第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎二、植物細胞超低溫保存68第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎植物超低溫保存技術建立在生物細胞凍害和抗凍機理的基礎之上。種質超低溫保存成功的關鍵，在于降溫冰凍過程中避免細胞內結冰。為此，針對不同種類的植物材料，篩選適合的冰凍保護劑，采用適當?shù)慕禍乇鶅鏊俣群突瘍龇绞剑赡苁辜毎皇軗p傷或使損傷減小到最低程度。植物種質資源離體超低溫保存第二節(jié)植物材料超低溫凍存的細胞學基礎植物超低溫保存技術69第三節(jié)超低溫保存的方法超低溫保存植物種質資源的程序包括下面幾個步聚：(1)前培養(yǎng):對培養(yǎng)體短期的生長鍛煉處理，使其提高耐液氮保存的能力。(2)防凍:培養(yǎng)體放人防凍液中，使其細胞降低冰點，減少因形成冰晶可能造成的損傷。(3)變溫冷凍:按照不同變溫模式降溫冷凍，降溫速度依不同種質材料采用特定的速度。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法超低溫保存植物種質資源的程序包70第三節(jié)超低溫保存的方法(4)超低溫保存:將冷凍材料保存到有效低溫環(huán)境中，以防止冰的游移或解體。(5)解凍:一般認為快速解凍更好。從液氮環(huán)境中取出封裝好的材料，與其容器一同放人+40℃的無菌水浴中，直到解凍后才回到室溫下，未封裝的材料放到20-30℃的液體培養(yǎng)基中解凍。(6)生命力測定:如用TTC染色法等。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法(4)超低溫保存:將冷凍材料保存到有71第三節(jié)超低溫保存的方法一、傳統(tǒng)的降溫冰凍方法1．快速冰凍法

2．慢速冰凍法

3．兩步法

4．逐級冰凍法植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法一、傳統(tǒng)的降溫冰凍方法植物種質資源離72第三節(jié)超低溫保存的方法二、玻璃化保存方法玻璃化（vitrification）是指液體轉變?yōu)榉蔷w（玻璃態(tài)）的固化過程。

使溶液玻璃化有兩條途徑：

一是大幅度提高冷卻速率；二是增加溶液濃度。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法二、玻璃化保存方法植物種質資源離體超73第三節(jié)超低溫保存的方法1．玻璃化法

是將生物材料經極高濃度的玻璃化溶液快速脫水后，直接投入液氮，使生物材料連同玻璃化溶液發(fā)生玻璃化轉變，進入玻璃態(tài)。此間水分子沒有發(fā)生重排，不形成冰晶，也不產生結構和體積的改變，因而不會對材料造成傷害。保存終止后，復溫時要快速化凍，防止去玻璃化的發(fā)生。材料能安全度過冷卻和化凍兩個關口，就可保證凍存的成功。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法1．玻璃化法

是將生物材料經極高74第三節(jié)超低溫保存的方法2．包埋玻璃化法

是包埋－脫水法和玻璃化法的結合。

保存材料先用藻酸鈣包埋，然后經蔗糖濃度梯度脫水和玻璃化溶液處理后直接浸入液氮保存，其材料存活率比用包埋—脫水法要高，可能是藻酸鈣包埋后減輕了玻璃化溶液的毒性。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法2．包埋玻璃化法

是包埋－脫水法75第三節(jié)超低溫保存的方法三、其它超低溫凍存方法1．干凍法（desiccation）利用無菌空氣流、干燥硅膠或飽和溶液表面的氣相等對種質材料進行脫水處理，然后快速將其投人液氮貯存。2．預培養(yǎng)法（pregrowth）也叫預凍法:將種質材料在添加保護劑(如蔗糖、二甲亞礬、甘油等)后置于低溫冰箱或液氮蒸汽箱(-10~-700C)中冰凍若干小時后投人液氮貯存。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法三、其它超低溫凍存方法植物種質資源離76第三節(jié)超低溫保存的方法3．預培養(yǎng)-干燥法(pregrowth-desiccation)

也叫兩步法，種質材料在添加保護劑后，用程序降溫儀以某個速率(每分鐘0.1~0.50C)降溫至轉移溫度(－40~－700C)，然后投人液氮中貯存，兩步法較預凍法更為嚴格。4．包埋脫水法（encapsulation-dehydration）莖尖、分生組織和體細胞胚等種質材料用褐藻酸鈣包埋后，第一階段先在含高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中脫水，第二階段用無菌空氣流或干燥硅膠脫水，然后投人液氮貯存。植物種質資源離體超低溫保存第三節(jié)超低溫保存的方法3．預培養(yǎng)-干燥法(pregrowt77第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素

一、材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗凍性及器官、組織和細胞的年齡以及生理狀態(tài)。不同基因型的植物離體材料對超低溫凍存的反應各不相同。植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素一、材料的基本特性植物78第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素二、預培養(yǎng)和低溫鍛煉預處理對于調整植物離體材料的生理狀態(tài)非常有效。通過預處理的植物材料，減少了細胞內自由水的含量，使細胞能經受低溫脅迫，減少或避免了冷凍傷害，可大大提高材料的抗凍力。植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素二、預培養(yǎng)和低溫鍛煉植物79第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素三、冰凍保護劑的應用

一般的生物體在沒有添加冰凍保護劑的情況下經歷低溫后是很難存活下來的。所以，生物體的低溫保存離不開冰凍保護劑（cryoprotectiveagent，CPA）。冰凍保護劑也稱作抗凍劑，合理地選擇冰凍保護劑，對低溫保存至關重要。植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素三、冰凍保護劑的應用

80第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素冰凍保護劑應具有以下特點：易溶于水，對細胞無毒，容易從組織細胞中清除。冰凍保護劑的作用主要表現(xiàn)在增加膜透性，加速細胞內的水流到細胞外結冰，穩(wěn)定細胞膜結構，阻止低溫傷害，降低冰點，提高溶液的粘滯性，阻止冰晶生長。

植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素冰凍保護劑應具有以下特點81第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素滲透型冰凍保護劑：多屬低分子中性物質，在溶液中易結合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的粘性增加，從而弱化了水的結晶過程，達到保護的目的。常用的滲透型冰凍保護劑有：甘油、二甲亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。但滲透型冰凍保護劑使用濃度、滲入細胞的能力、對水分子活性的影響等各不相同，如甘油適宜于慢速冷卻，而DMSO卻易于滲入細胞，并在常溫下稍有毒性。

植物種質資源離體超低溫保存第四節(jié)影響超低溫保存效果的主要因素滲透型冰凍