血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案血清醋酸纖維素薄膜電泳一、目的要求.掌握醋酸纖維素薄膜電泳的基本原理及操作過程。.了解豬血清蛋白質(zhì)的各種成分。.熟悉豬血清中各種蛋白質(zhì)相對含量的測定原理和方法。.熟悉分光光度計的工作原理及使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理.電泳的基本原理電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核甘酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。電泳過程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì)，所以擴(kuò)散和對流都比較強(qiáng)，影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳，樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過程，減少了擴(kuò)散和對流等干擾作用。最初的支持介質(zhì)是濾紙和醋酸纖維素膜。由于pH值的改變會引起帶電分子電荷的改變，進(jìn)而影響其電泳遷移的速度，所以電泳過程應(yīng)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行，緩沖液可以保持待分離物的帶電性質(zhì)的穩(wěn)定。.醋酸纖維素薄膜醋酸纖維素是纖維素的羥基乙酰化所形成的纖維素醋酸酯，將它溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜，待溶劑蒸發(fā)后則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120um,有很強(qiáng)的通透性，對分子移動阻力很小。本實(shí)驗(yàn)采用醋酸纖維素薄膜作為介質(zhì)。3.蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，其分子中除兩端的游離氨基和竣基外，側(cè)鏈中尚有一些解離基，作為帶電顆粒它可以在電場中移動，移動方向取決于蛋白質(zhì)分子所帶的電荷。蛋白質(zhì)顆粒在溶液中所帶的電荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案基酸的含量，又受所處溶液的pH影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)游離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，此時溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)顆粒，在電場中并不移動。蛋白質(zhì)溶液的pH大于等電點(diǎn)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。各種蛋白質(zhì)分子由于所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數(shù)目不同，因而有各自的等電點(diǎn)。凡堿性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)就偏堿性。反之，凡酸性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)就偏酸性。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在pH值小于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為正離子，在電場中向陰極移動；在pH值大于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為負(fù)離子，在電場中向陽極移動。血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì)，它們所具有的可解離基團(tuán)不同，在同一pH的溶液中，所帶凈電荷不同，故可利用電泳法將它們分離。血清中含有白蛋白、a-球蛋白、B-球蛋白、Y-球蛋白等，各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、立體構(gòu)象、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場中遷移速度不同。由表可知，血清中5種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大部分低于pH值7.0,所以在pH=8.6的緩沖液中，它們都電離成負(fù)離子，在電場中向陽極移動。蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)（PI）相對分子質(zhì)量白蛋白4.8869000al-球蛋白5.06200000a2-球蛋白5.06300000B-球蛋白5.1290000?150000Y-球蛋白6.85?7.50156000?300000因此，本實(shí)驗(yàn)采用pH=8.6的巴比妥-巴比妥鈉溶液作為電泳的緩沖溶液。4.分光光度計的工作原理溶液中的物質(zhì)在光的照射激發(fā)下，產(chǎn)生了對光吸收的效應(yīng)，物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的，各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色光通過溶液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即符合于比色原理---比耳定律。當(dāng)入射光，吸光系數(shù)和溶液液層厚度不變時，透光率或吸光度只隨溶液濃度變化而變化。因此把透過濾液的光經(jīng)過測光系統(tǒng)中的光電轉(zhuǎn)化器，將光能轉(zhuǎn)化為電能，就可以在測光系統(tǒng)的指示器上顯示出相應(yīng)的吸光度和透光率。精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量與結(jié)合的染料量成正比，故可將蛋白質(zhì)區(qū)帶剪下，分別用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下來，進(jìn)行比色，測定其相對含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計掃描，測定其相對含量。本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計測定各種蛋白質(zhì)含量。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑.實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀、點(diǎn)樣器、分光光度計、剪刀、濾紙、鑷子、培養(yǎng)皿、試管架、試管、洗耳球、吸量管、玻璃板.實(shí)驗(yàn)試劑巴比妥緩沖液（pH8.6,離子強(qiáng)度0.06）：稱取巴比妥1.66克和巴比妥鈉12.76克，溶于少量蒸餾水中，定容至1000毫升。染色液：稱取氨基黑10B0.5克，加入蒸餾水40毫升、甲醇50毫升和冰醋酸10毫升，混勻，保存?zhèn)溆?。漂洗液：量?5%乙醇45毫升，冰醋酸5毫升和蒸餾水50毫升，混勻，保存?zhèn)溆谩aOH溶液（0.4N）：稱取NaOH16克，用少量蒸餾水溶解后定容至1000毫升。四、實(shí)驗(yàn)步驟.浸泡醋酸纖維素薄膜選擇質(zhì)勻、孔細(xì)的醋酸纖維薄膜，在無光澤面的一端1.5cm處，用鉛筆輕畫一橫線作為加樣線并編號，然后置于裝有pH8.6的巴比妥緩沖液中，并使之完全浸沒，選取在15?30秒內(nèi)迅速潤濕且表面無斑點(diǎn)的醋酸纖維素薄膜，浸泡約30分鐘。.點(diǎn)樣用鑷子從緩沖液中取出醋酸纖維薄膜置潔凈的濾紙上吸去多余的水分，使醋酸纖維薄膜既保持濕潤狀態(tài)又無明顯的水分，注意不能吸得太干，以免影響導(dǎo)電，導(dǎo)致電泳圖譜有條痕，亦不能留存過多的緩沖液，以避免點(diǎn)樣時血清隨著緩沖液而擴(kuò)散開來，導(dǎo)致電泳圖譜分離不齊。精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案將醋酸纖維薄膜置于潔凈的濾紙上，無光澤面向上。用毛細(xì)吸管吸取約5uL豬血清，均勻涂抹于點(diǎn)樣器上，然后垂直印在點(diǎn)樣線上，停留2-3秒待血清完全滲入后移開，形成一條粗細(xì)寬窄一致的血清線。注意點(diǎn)樣時不能太過用力。.電泳將點(diǎn)樣好的薄膜用鑷子迅速平貼在電泳槽的濾紙橋上，并使點(diǎn)樣端貼在陰極上，無光澤面向下。為了使膜條與電場平行,還應(yīng)把膜條與電極之間壓嚴(yán)（不允許有氣泡），使膜條繃直，中間不下垂。放好后蓋好電泳槽蓋，平衡10分鐘后通電，電壓可選擇90V左右，電泳1小時左右。然后關(guān)閉電源。在電泳過程中注意觀察電壓的變化。.染色與漂洗將電泳好的薄膜取出，直接放入染色液中浸泡約5分鐘。染色過程中可以輕輕抖動培養(yǎng)皿以使染色更加充分、均勻。注意不要讓薄膜重疊。染色完畢后，用鑷子取出薄膜并立即浸泡于漂洗液中，每十分鐘更換一次漂洗液，漂洗2-3次，背景漂洗凈后用濾紙吸干薄膜。漂洗過程中可用鑷子夾住薄膜輕輕抖動。漂洗完畢后可看到五條清晰的蛋白質(zhì)帶。.洗脫法測定各種蛋白質(zhì)的相對含量（選做）挑選所得薄膜中蛋白質(zhì)區(qū)帶分離最清晰的薄膜，用剪刀小心剪開五條蛋白質(zhì)帶，另于點(diǎn)樣線以下剪一大小與色帶相仿的薄膜作為空白對照組。取六支試管，編號。將所得的蛋白質(zhì)帶和無色薄膜分別放入六支試管中，用吸量管吸取4mL0.4mol/L精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案的NaOH溶液分別加入到每支試管中。在37恒溫水浴鍋中保溫約30分鐘，并不時振蕩，直至薄膜帶上的藍(lán)色全部脫下。選擇波長750nm進(jìn)行比色。以空白對照組調(diào)零，分別讀出各個蛋白組分的吸光度。吸光度總和 T=O.D清蛋白（A）+O.Da1+O.Da2+O.DB+O.DY各組分蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)為：清蛋白A=O.D清蛋白（A）/TX100%a1球蛋白二O.Da1/TX100%a2球蛋白二O.Da2/TX100%B球蛋白二O.DB/TX100%Y球蛋白二O.DY/TX100%五、注意事項.實(shí)驗(yàn)中所用的巴比妥緩沖液為神經(jīng)毒劑，染色液與漂洗液也都有毒性，所以在做實(shí)驗(yàn)時一定要戴手套。.點(diǎn)樣是否成功關(guān)系到電泳結(jié)果，所以點(diǎn)樣時應(yīng)嚴(yán)格遵循操作步驟，并事先在濾紙上反復(fù)練習(xí)之后再點(diǎn)樣。.電泳時還應(yīng)注意電流不能過大，每條帶以0.4?0.6mA/cm為宜。