分子生物學之DNA復制課件

第3章DNA復制

(DNAReplication)第3章13.1.基本概念3.2.復制起點與方向

3.3.Semi-ConservationReplication

3.4.復制的方式

3.5.線狀DNA的復制3.7.DNA復制的基因與酶類體系

3.8.DNA復制速率及拷貝數(shù)的調(diào)控

3.9.MethylationofDNA3.6.TheterminationofDNA3.1.基本概念3.2.復制起點與方向.基本概念

(BasicConcept)3.1.基本概念3遺傳物質(zhì)的分子機制分子生物學的核心Watson&Crick:

一種遺傳物質(zhì)，必須能行使兩種功能，即自我復制和對細胞的高度特異性的影響遺傳物質(zhì)的基本屬性：基因的自我復制基因的突變控制性狀的表達遺傳物質(zhì)的分子機制分子生物學的核心Watson&Cric4DNA復制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP,合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程?！馬eplicon;基因組中能獨立進行復制的單位。

●Replisome;AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA

DNA復制●Replicon;基因組中能獨立進行復制的5DNAreplicationatphaseSofcellcycleE.coli37℃0.5h105bp/minS6-8hsM1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500-5000bp/minG112hs?DNAreplicationatphaseSof63.2.復制起點與方向（replicationorigin&direction）

3.2.復制起點與方向7richAT&palindromEnzymesbindingsite復制起點的特征richAT&palindrom復制起點的特征8E.coli復制起點ori C 245bp,序列保守成串排列的三個13bp序列四個9bp序列DnaA蛋白結合位點E.coli復制起點ori C 成串排列的三個13bp序列9真核生物復制起點的研究是以酵母為基礎的ARS(automaticReplicationSequence)自主復制序列ARS1(A,B1,B2,B3)A區(qū)具有高度保守性B區(qū)變化較大ATrich真核生物復制起點的研究是以酵母為基礎的ARS(automa10復制的多模式單起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向復制的多模式單起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向111963Cairns37℃,5ci/mMH3-T,6min37℃,52ci/mMH3-T,6min42℃,

T,onecircleDNA雙向復制的證據(jù)模式？E.coli

mut.ts復制發(fā)動溫度敏感突變型42℃不能發(fā)動DNA復制、但可完成DNA延伸1963Cairns37℃,5ci/mM12模式？單起點、雙方向兩個復制叉模式？單起點、雙方向兩個復制叉13子鏈DNA延伸方向DNApolymerasereactsonthe3’endonly5’OHTCATCA

C5’OH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi

子鏈DNA延伸方向DNApolymeraserea14如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’G

pppOHG

ATCG

5’pppOH3’如果DNA的延伸方向是3’→5’AT15ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNaCl的生理環(huán)境中，磷酸基團間的強電負性，使dNTP難以聚合到DNA的5’端，而且雙鏈DNA的5’端堿基配對困難。ATCG+5’ppp16堿基發(fā)生錯配后的校正……費時、費能（增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗）

A

TCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH堿基發(fā)生錯配后的校正……費時、費能（增加脫磷酸、加磷酸的能173.3.DNA的半保留復制（Semi-ConservationReplication）

3.3.DNA的半保留復制18半保留復制的實驗驗證半保留復制的實驗驗證193‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘20onestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）

？a)Okazakifragment1968ReijiOkazakionestrandofDNAreplication21半不連續(xù)復制（semi-discontinuousreplication）

證據(jù)

Okazaki片段的發(fā)現(xiàn)，為不連續(xù)復制提供了有力的證據(jù)。Prok.1-2kb,Euk.0.1-0.2kb

在復制叉上發(fā)生一條新鏈為連續(xù)合成，另一條鏈為不連續(xù)合成的復制機制。半不連續(xù)復制證據(jù)Prok.1-2kb,Euk22leadingstrand

laggingstrand

leadingstrand（前導鏈）：連續(xù)復制laggingstrand（后隨鏈）：按Okazaki片段不連續(xù)復制leadingstrandlaggingstrand233.4.DNA復制的方式

(DNAreplicationmodel)

3.4.DNA復制的方式24startingpoint→RNAprimer→transcriptionactivation→leadingstrand→fork→laggingstrand●復制叉式（replicationfork）

startingpoint→RNAprimer→tr25環(huán)狀DNA復制（θform，50，000bp/min)多復制子真核生物（1000-3000bp/min)大多數(shù)生物染色體采取雙向對稱復制?？莶輻U菌采取不對稱復制。環(huán)狀DNA復制（θform，50，000bp/min)26

DNA聚合酶不能發(fā)動子鏈DNA的復制起始.

DNA聚合酶行使聚合作用需要：引物提供3’-OH以四種dNTP作為底物模板指導延伸方向5’→3’DNA聚合酶不能發(fā)動子鏈DNA的復制起始.27

RNA引物的合成（ATP，GTP，CTP，UTP）RNA聚合酶和引物合成酶(primase)引物的長度：幾個—10個核苷酸DNA聚合酶I：RNA引物的消除和缺口的填補primer

primer28DNA復制的轉錄激活(transcriptionalactivation）RNApolymerase[RifS]10NtRNAprimerforleadingStrand

origindnaGprimase

[RifR]forlaggingStrand

DNA復制的轉錄激活(transcriptional29primosome

SynthesisofprogenystrandinlaggingDNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligaseprimosomeSynthes30

RNApol(RNApolymerase)[RifS]

dnaG(primase)[RifR]

完成對后隨鏈引物的合成完成10±NtRNA引物合成后.DNApolIII進行DNA鏈的延伸DNApolI對RNA引物切除并聚合填補連接酶(ligase）將連接Okazaki片段.完成對先導鏈引物的合成實現(xiàn)DNA復制的轉錄激活起始較先導鏈的啟動落后一個Okazaki片斷ConclusionRNApol(RNApolymerase)[R31●共價延伸方式（covalenceelongation）或滾環(huán)方式（rollingcircle）D.S.DNA→Nick→leadingStrand→Elongation→rolling→LaggingStrand●共價延伸方式或滾環(huán)方式（rollingcir32ΦX174單鏈DNA分子（+），以此為模板，起始合成（-）DNA鏈，成為（+/-）雙鏈DNA分子，即復制型RFI.（+）鏈DNA復制起點被特異性A蛋白切斷，3‘和5’端游離出來。（-）DNA為模板，以（+）鏈DNA

3‘-OH為引物，DNA聚合酶III合成新鏈（+）。原來的（+）鏈DNA

被取代。（+）鏈DNA被滾出一定長度后，產(chǎn)生環(huán)狀（+）鏈DNA。（+/-）DNA鏈，繼續(xù)參與復制。ΦX174單鏈DNA分子（+），以此為模板，起始合成（-）D33●置換式或D-Loop（Displacementform）

D.S.DNAInmitochondrialDNAalsoinchloroplastDNA

→S.S.DNAastemplate→NewS.S.DNA→Displacement→D-Loop●置換式或D-LoopD.S.DNA34TopI,TopIIHelicase(repprotein)SingleStrandBindingprotein(SSB)DnaBproteinDnaCproteinPrimaseDNAPolymeraseIII

DNAPolymeraseI

Ligaseforprimosome復制體進化中形成了靈活的多酶復合體replisomeTopI,TopIIHelicase(re35primosome（引發(fā)體）

PriA(dualrole)displaceSSBfromS.SDNAandhelicase

DnaT

requiredatpreprimingstage

DnaBiscentralcomponent,actionwithDnaC

DnaC

iscentralcomponent,actionwithDnaBPriB

functionisunknown

PriC

functionisunknownDnaGprimase(引物酶)primosome（引發(fā)體）36進化中形成了靈活的多酶復合體replisome進化中形成了37位于復制叉處的多酶復合體完成

laggingStrandDNA延伸時必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎片段InlaggingStrand多酶系統(tǒng)必須完成多次反復的啟動與擴展

E.coli啟動2000—4000次的岡崎片段復制位于復制叉處的多酶復合體必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎383.5.線狀DNA的復制及避免5’末端短縮的模式

（5’-endshortend）

3.5.線狀DNA的復制393’-OH?

3‘-OHLaggingstrandof環(huán)狀DNAreplicationLaggingstrandof線狀DNAreplicationBut５‘３‘３‘５‘3’-OH?

3’-OH?3‘-OHLaggingstrando40WatsonJ.DT7phage

DirectrepeatintheendoflinearDNA

ConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication

WatsonJ.DDirectrepe41??concatermer3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OH??concatermer3‘-OHATCGTAGCATC42b)真核生物染色體DNA末端補齊模式

●端粒的發(fā)現(xiàn)

1938MullerX-rayDrosophila

末端極少發(fā)生缺失和倒位推測染色體兩端存在特殊結構，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為Telomer

1938B.McClintock頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。推測染色體末端具有特殊端粒結構。1970s分子生物學發(fā)展端粒研究獲得突破b)真核生物染色體DNA末端補齊模式●端粒的43●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(richCchain)

●1985.四膜蟲端粒酶（telomerase）將T2G4末端重復延伸

=RNA(CAACCCCAA)鏈+端粒結合蛋白

●端粒DNA(Telomer)TTGGGG(T2G44●model

Telomerase是反轉錄酶

RNA與3’endofDNA互補,作為合成cDNA的模板T2G4的延伸以端粒3’-end作引物G鏈

–T2G4-----TTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4----

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’TTG●modelTelomerase是反轉錄酶G鏈45G鏈

–T2G4----TTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4---TTG

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’GGGTTGG鏈

–T2G4----TTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4----TTGGGGTTGGGGTTG

------

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’WhenG-richstrandislongerenough

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’G鏈–T2G4----TTGGGGTTGGGGC鏈--46GGhoogsteenbond

四股螺旋

G鏈–T2G4-----TTGGGG

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4-----G鏈–T2G4-----TTGGGG

ttggggttgC鏈--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolorGGhoogsteenbondG47多細胞組織的體細胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一代細胞分裂后染色體末端縮短。這種縮短如果到達信息DNA（informationalDNA）,細胞將逐漸衰老和死亡。

細胞分裂端粒閾值細胞停止分裂或死亡Whentelomeraseactivity

isrepressed多細胞組織的體細胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一代細胞分48人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制，細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈反比細胞分裂端粒閾值端粒長短端粒酶活性

Harley(1989)端粒的重復片段為探針檢測胎兒細胞株嬰兒細胞株青年細胞株老年細胞株年齡小大端粒長度長短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短PCD機制、癌細胞的無限繁殖(癌細胞中的端粒酶被激活)人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制，細胞分裂端粒閾值端粒長短H49

3.6TheterminationofDNAreplication

3.6TheterminationofDNA50E.coli(單起點雙方向)兩復制叉的相遇處具有多個終止位點(不是復制叉簡單相遇）terE,D,AterF,B,C(22bp保守區(qū))FBTerminusUtilizationSubstance（TUS36kd）CADETer-TUS復合體E.coli(單起點雙方向)兩復制叉的相遇處具有多個終止位51terE,D,A僅對逆時針方向的復制叉具有終止效應

terF,B,C僅對順時針方向的復制叉具有終止效應FBCADETer-TUS復合體(Rep.forktrap)終止DnaB(螺旋酶)防止DNA過度復制避免出現(xiàn)DNA多聚體，高拷貝terE,D,A僅對逆時針方向的復制叉具有終止效應52環(huán)狀DNA分子復制完成后，兩個環(huán)狀染色體互相纏繞，成為連鎖體。需要拓撲異構酶使DNA兩條鏈斷開和再連接。環(huán)狀DNA分子復制完成后，兩個環(huán)狀染色體互相纏533.7.

DNA的復制基因與酶類體系

3.7.DNA的復制基因54原核生物的酶類

與起始有關的蛋白因子

DnaB解開ＤＮＡ雙鏈300kdhexamerRNApolRNAprimerforleadingstrandDnaC與DnaB相互作用25kdDnaGRNAprimerforlaggingStrand60kd

SSB

結合單鏈DNA74kd原核生物的酶類與起始有關的蛋白因子DnaB55Elongationgenes與酶dnaE

DNApolymeraseIII(α)140kddnaZ

DNApolymeraseIII(β)52kdpolA

DNApolymeraseI109kdpolB

DNApolymeraseII90-120kdElongationgenes與酶dnaE56解螺旋酶和連接酶rep

Relaxedprotein(Helicase)D.S.DNA→S.S.DNAligLigase缺口酶活化(T4)(E.coli)缺口腺苷化封口連接dAMP解螺旋酶和連接酶repRelaxedpro57復制叉兩側DNA雙螺旋的解旋E.coliC/genome=4.2×106bp,40分鐘/每次復制歷時,10bp/每圈螺旋84000bp解旋/分(8400rpm!高速離心機)DNAtopoisomeraseIDNA的單鏈瞬間斷裂緩解高速旋轉DNAtopoisomeraseIIDNA的雙鏈瞬間斷裂緩解高速解旋時，DNA雙鏈的相互纏繞能量？拓撲異構酶（Topoisomerase）

復制叉兩側DNA雙螺旋的解旋E.coliDNAtopo58(1)DNA拓撲異構酶I100kd

topA編碼不需能量在DNA的一條鏈上產(chǎn)生一個切口。superhelix→D.S.helix(1)DNA拓撲異構酶I100kdtopA編碼在DNA的59(2)DNA拓撲異構酶IICutD.S.DNAATPLigategyrαTopII(gyrase)400kdgyrβ四聚體(ααββ)(2)DNA拓撲異構酶IICutLigategyrα60需要能量使DNA的兩條鏈同時發(fā)生斷裂和連接D.S.helix→superhelix需要能量61b)DNA聚合酶（DNApolymerase）

polA

polB

dnaEdnaZ

104kd120kd>250kd

monomer

klenowfragmentProkaryote

IIIIII

5’→3’elongation(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+ppi

10dNt/sec1/10ofpolI500dNt/sec

(68,36)KornbergE多亞基酶多亞基酶b)DNA聚合酶（DNApolymerase）623’→5’editing

mismatch10-810-3yes

5’→3’exonuclease

smallfragmentrepairNoNo

IIIIII

mutation

lethallethal

功能切除引物，修復修復復制3’→5’editingmismatch10-863b;primersite

c;primerterminator

a;templatesited;dNTPsite

e;5’→3’repairsite

36kde胰酶68kdabcOHOHpppdppppppppppppOHOHOHDNApolymeraseIb;primersitec;primerte64大片段具有聚合酶和3’→5’的外切核酸酶活性小片段具有5’→3’的外切核酸酶活性大片段具有聚合酶和3’→5’的外切核酸酶活性65多亞基酶功能：不是復制酶，是修復酶DNApolymeraseII多亞基酶DNApolymeraseII66DNApolymeraseIIIDNApolIII(holoEnzyme)

α+ε+θ→核心酶α具有5’→3’聚合酶的活性ε具有3’→5’的外切核酸酶活性β功能如同夾子,夾住模板DNA分子γ是一種依賴DNA的ATP酶DNApolymeraseIIIDNApolII67c)真核生物DNA復制的特點及聚合酶●multiplereplicon

Prok.105bp/minEuk.1000-3000bp/min5-300kb/復制子

●DNApolα+primase(50-60kd)

6-9NtRNAasprimer

例；果蠅5000replicons受精后genomereplication/3min

Replicons擴增到50,000c)真核生物DNA復制的特點及聚合酶●mul68Euk.染色體在全部復制完成之前起點不再從新開始復制。而Prok.

起點可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物在快速生長時，往往采用更多的復制起點。分子生物學之DNA復制課件69●DNApolymerase

αδεβγ

polymerize5’→3’均有NucleiNucleiNucleiNucleimtediting3’→5’

—++—+功能RNA引物DNA合成修復修復修復●DNApolymeraseα703.8.DNA復制速率及拷貝數(shù)的調(diào)控(?!)

3.8.DNA復制速率71a)影響因素

多種專一性的蛋白質(zhì)因子濃度除引物以外的其他RNA分子（anti-RNA）營養(yǎng)條件（aastarved的抑制)（原核生物）細胞復制周期速率的影響（真核生物）…b)嚴格的自我調(diào)控機制

e.g.plasmid（parasite）

independentreplication嚴謹型stringenttype(1-2copies)松弛型relaxedtype(10-100copies)a)影響因素多種專一性的蛋白質(zhì)因子濃度b)嚴格的自我調(diào)72分子生物學之DNA復制課件73

Rop蛋白

反義RNA1RNA-2positivecontrol

正調(diào)控0-5550

RNA-2

RNaseHOH

RNA-2復制的調(diào)控e.g.ColEIplasmid負調(diào)控DNA復制方向Rop蛋白反義RNA1RNA-2po74RNA-1110bp

RNaseH不能識別D.S.RNA-1/RNA-2,不能形成primer的3’-OH-555

-4450RNA-2RNA-1RNA-2

110bpD.S.RNARNA-1110bpRNaseH不能識別D.S.R75RNA-10

WhenRNA-2200-360Nt

Rop

geneexpression

RNA-1/RNA-2D.S.repression

RNA-1

/RNA-2

不能形成primer的

3’-OH促進

限制

63aaROP(Ropprotein)

RNA-2

只能轉錄到100-220base,不能到達“0”原點

不能形成primer

的3’-OH0RNA-1763.9.DNA的甲基化（Methylation）(m5CinEukaryote)

3.9.DNA的甲基化（Methylation）77m5C

a)DNA中m5C的特點

HNH

H4153

62OHNNCH3m5Ca)DNA中m5C的特點HNHH41578●m5C的復制

●m5C的分布

含CG序列HpaIICCmGG;MspICmCGG

HhaIGCmGC;ThaICmGCmG

HeaIIIGGCmC;PstICmTGCAG

（啟動甲基化酶）（去甲基化）(保持甲基化酶)

（識別半甲基化）CmGCmGGCGCmCmGGC

CGGC

CGGC

CmG

GC

●m5C的復制●m5C的分布含CG序列79●Animal

70%ofCGseq.PlantCNGseq.ofNucleiDNA(mtDNA,cpDNAnom5C)●EukaryoteHighrepetitiveseq.frequentm5CStructuregenerarem5CClustergenefrequentm5CExpressinggenerarem5CClosedgenefrequentm5C

(inGCislandofpromoter)●Animal70%o80b)Functionofm5C

細胞分化，組織特化，階段發(fā)育，組織培養(yǎng)過程的脫分化

與m5C的相關性（5-氨胞苷去甲基化的作用）

m5C---甲基化是生物自我保護的機制

m5C

的不足基因表達相關

m5C的豐富基因關閉相關m5C

的程度具有明顯的組織，細胞的特異性(時空性)

b)Functionofm5C細胞分化81●

m5C

與基因突變的關系

C→

m5C→T→

genemutation(癌變)

HNH5OC

GCH35HNHOOCH35O氧化脫氨m5CGT

A

●m5C與基因突變的關系C→m5C→T82本章結束，謝謝！本章結束，謝謝！83第3章DNA復制

(DNAReplication)第3章843.1.基本概念3.2.復制起點與方向

3.3.Semi-ConservationReplication

3.4.復制的方式

3.5.線狀DNA的復制3.7.DNA復制的基因與酶類體系

3.8.DNA復制速率及拷貝數(shù)的調(diào)控

3.9.MethylationofDNA3.6.TheterminationofDNA3.1.基本概念3.2.復制起點與方向3.3.853.1.基本概念

(BasicConcept)3.1.基本概念86遺傳物質(zhì)的分子機制分子生物學的核心Watson&Crick:

一種遺傳物質(zhì)，必須能行使兩種功能，即自我復制和對細胞的高度特異性的影響遺傳物質(zhì)的基本屬性：基因的自我復制基因的突變控制性狀的表達遺傳物質(zhì)的分子機制分子生物學的核心Watson&Cric87DNA復制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP,合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程?！馬eplicon;基因組中能獨立進行復制的單位。

●Replisome;AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA

DNA復制●Replicon;基因組中能獨立進行復制的88DNAreplicationatphaseSofcellcycleE.coli37℃0.5h105bp/minS6-8hsM1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500-5000bp/minG112hs?DNAreplicationatphaseSof893.2.復制起點與方向（replicationorigin&direction）

3.2.復制起點與方向90richAT&palindromEnzymesbindingsite復制起點的特征richAT&palindrom復制起點的特征91E.coli復制起點ori C 245bp,序列保守成串排列的三個13bp序列四個9bp序列DnaA蛋白結合位點E.coli復制起點ori C 成串排列的三個13bp序列92真核生物復制起點的研究是以酵母為基礎的ARS(automaticReplicationSequence)自主復制序列ARS1(A,B1,B2,B3)A區(qū)具有高度保守性B區(qū)變化較大ATrich真核生物復制起點的研究是以酵母為基礎的ARS(automa93復制的多模式單起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向復制的多模式單起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向941963Cairns37℃,5ci/mMH3-T,6min37℃,52ci/mMH3-T,6min42℃,

T,onecircleDNA雙向復制的證據(jù)模式？E.coli

mut.ts復制發(fā)動溫度敏感突變型42℃不能發(fā)動DNA復制、但可完成DNA延伸1963Cairns37℃,5ci/mM95模式？單起點、雙方向兩個復制叉模式？單起點、雙方向兩個復制叉96子鏈DNA延伸方向DNApolymerasereactsonthe3’endonly5’OHTCATCA

C5’OH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi

子鏈DNA延伸方向DNApolymeraserea97如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’G

pppOHG

ATCG

5’pppOH3’如果DNA的延伸方向是3’→5’AT98ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNaCl的生理環(huán)境中，磷酸基團間的強電負性，使dNTP難以聚合到DNA的5’端，而且雙鏈DNA的5’端堿基配對困難。ATCG+5’ppp99堿基發(fā)生錯配后的校正……費時、費能（增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗）

A

TCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH堿基發(fā)生錯配后的校正……費時、費能（增加脫磷酸、加磷酸的能1003.3.DNA的半保留復制（Semi-ConservationReplication）

3.3.DNA的半保留復制101半保留復制的實驗驗證半保留復制的實驗驗證1023‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘103onestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）

？a)Okazakifragment1968ReijiOkazakionestrandofDNAreplication104半不連續(xù)復制（semi-discontinuousreplication）

證據(jù)

Okazaki片段的發(fā)現(xiàn)，為不連續(xù)復制提供了有力的證據(jù)。Prok.1-2kb,Euk.0.1-0.2kb

在復制叉上發(fā)生一條新鏈為連續(xù)合成，另一條鏈為不連續(xù)合成的復制機制。半不連續(xù)復制證據(jù)Prok.1-2kb,Euk105leadingstrand

laggingstrand

leadingstrand（前導鏈）：連續(xù)復制laggingstrand（后隨鏈）：按Okazaki片段不連續(xù)復制leadingstrandlaggingstrand1063.4.DNA復制的方式

(DNAreplicationmodel)

3.4.DNA復制的方式107startingpoint→RNAprimer→transcriptionactivation→leadingstrand→fork→laggingstrand●復制叉式（replicationfork）

startingpoint→RNAprimer→tr108環(huán)狀DNA復制（θform，50，000bp/min)多復制子真核生物（1000-3000bp/min)大多數(shù)生物染色體采取雙向對稱復制?？莶輻U菌采取不對稱復制。環(huán)狀DNA復制（θform，50，000bp/min)109

DNA聚合酶不能發(fā)動子鏈DNA的復制起始.

DNA聚合酶行使聚合作用需要：引物提供3’-OH以四種dNTP作為底物模板指導延伸方向5’→3’DNA聚合酶不能發(fā)動子鏈DNA的復制起始.110

RNA引物的合成（ATP，GTP，CTP，UTP）RNA聚合酶和引物合成酶(primase)引物的長度：幾個—10個核苷酸DNA聚合酶I：RNA引物的消除和缺口的填補primer

primer111DNA復制的轉錄激活(transcriptionalactivation）RNApolymerase[RifS]10NtRNAprimerforleadingStrand

origindnaGprimase

[RifR]forlaggingStrand

DNA復制的轉錄激活(transcriptional112primosome

SynthesisofprogenystrandinlaggingDNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligaseprimosomeSynthes113

RNApol(RNApolymerase)[RifS]

dnaG(primase)[RifR]

完成對后隨鏈引物的合成完成10±NtRNA引物合成后.DNApolIII進行DNA鏈的延伸DNApolI對RNA引物切除并聚合填補連接酶(ligase）將連接Okazaki片段.完成對先導鏈引物的合成實現(xiàn)DNA復制的轉錄激活起始較先導鏈的啟動落后一個Okazaki片斷ConclusionRNApol(RNApolymerase)[R114●共價延伸方式（covalenceelongation）或滾環(huán)方式（rollingcircle）D.S.DNA→Nick→leadingStrand→Elongation→rolling→LaggingStrand●共價延伸方式或滾環(huán)方式（rollingcir115ΦX174單鏈DNA分子（+），以此為模板，起始合成（-）DNA鏈，成為（+/-）雙鏈DNA分子，即復制型RFI.（+）鏈DNA復制起點被特異性A蛋白切斷，3‘和5’端游離出來。（-）DNA為模板，以（+）鏈DNA

3‘-OH為引物，DNA聚合酶III合成新鏈（+）。原來的（+）鏈DNA

被取代。（+）鏈DNA被滾出一定長度后，產(chǎn)生環(huán)狀（+）鏈DNA。（+/-）DNA鏈，繼續(xù)參與復制。ΦX174單鏈DNA分子（+），以此為模板，起始合成（-）D116●置換式或D-Loop（Displacementform）

D.S.DNAInmitochondrialDNAalsoinchloroplastDNA

→S.S.DNAastemplate→NewS.S.DNA→Displacement→D-Loop●置換式或D-LoopD.S.DNA117TopI,TopIIHelicase(repprotein)SingleStrandBindingprotein(SSB)DnaBproteinDnaCproteinPrimaseDNAPolymeraseIII

DNAPolymeraseI

Ligaseforprimosome復制體進化中形成了靈活的多酶復合體replisomeTopI,TopIIHelicase(re118primosome（引發(fā)體）

PriA(dualrole)displaceSSBfromS.SDNAandhelicase

DnaT

requiredatpreprimingstage

DnaBiscentralcomponent,actionwithDnaC

DnaC

iscentralcomponent,actionwithDnaBPriB

functionisunknown

PriC

functionisunknownDnaGprimase(引物酶)primosome（引發(fā)體）119進化中形成了靈活的多酶復合體replisome進化中形成了120位于復制叉處的多酶復合體完成

laggingStrandDNA延伸時必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎片段InlaggingStrand多酶系統(tǒng)必須完成多次反復的啟動與擴展

E.coli啟動2000—4000次的岡崎片段復制位于復制叉處的多酶復合體必須快速從一個岡崎片段移到另一岡崎1213.5.線狀DNA的復制及避免5’末端短縮的模式

（5’-endshortend）

3.5.線狀DNA的復制1223’-OH?

3‘-OHLaggingstrandof環(huán)狀DNAreplicationLaggingstrandof線狀DNAreplicationBut５‘３‘３‘５‘3’-OH?

3’-OH?3‘-OHLaggingstrando123WatsonJ.DT7phage

DirectrepeatintheendoflinearDNA

ConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication

WatsonJ.DDirectrepe124??concatermer3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OH??concatermer3‘-OHATCGTAGCATC125b)真核生物染色體DNA末端補齊模式

●端粒的發(fā)現(xiàn)

1938MullerX-rayDrosophila

末端極少發(fā)生缺失和倒位推測染色體兩端存在特殊結構，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為Telomer

1938B.McClintock頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。推測染色體末端具有特殊端粒結構。1970s分子生物學發(fā)展端粒研究獲得突破b)真核生物染色體DNA末端補齊模式●端粒的126●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(richCchain)

●1985.四膜蟲端粒酶（telomerase）將T2G4末端重復延伸

=RNA(CAACCCCAA)鏈+端粒結合蛋白

●端粒DNA(Telomer)TTGGGG(T2G127●model

Telomerase是反轉錄酶

RNA與3’endofDNA互補,作為合成cDNA的模板T2G4的延伸以端粒3’-end作引物G鏈

–T2G4-----TTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4----

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’TTG●modelTelomerase是反轉錄酶G鏈128G鏈

–T2G4----TTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4---TTG

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’GGGTTGG鏈

–T2G4----TTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4----TTGGGGTTGGGGTTG

------

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’WhenG-richstrandislongerenough

telomerase

3’

AACCCCAAC---5’G鏈–T2G4----TTGGGGTTGGGGC鏈--129GGhoogsteenbond

四股螺旋

G鏈–T2G4-----TTGGGG

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4-----G鏈–T2G4-----TTGGGG

ttggggttgC鏈--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolorGGhoogsteenbondG130多細胞組織的體細胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一代細胞分裂后染色體末端縮短。這種縮短如果到達信息DNA（informationalDNA）,細胞將逐漸衰老和死亡。

細胞分裂端粒閾值細胞停止分裂或死亡Whentelomeraseactivity

isrepressed多細胞組織的體細胞中，端粒酶的活性受到抑制，造成每一代細胞分131人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制，細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈反比細胞分裂端粒閾值端粒長短端粒酶活性

Harley(1989)端粒的重復片段為探針檢測胎兒細胞株嬰兒細胞株青年細胞株老年細胞株年齡小大端粒長度長短早衰性侏儒癥的端粒明顯較正常人短PCD機制、癌細胞的無限繁殖(癌細胞中的端粒酶被激活)人體發(fā)育完成，端粒酶被抑制，細胞分裂端粒閾值端粒長短H132

3.6TheterminationofDNAreplication

3.6TheterminationofDNA133E.coli(單起點雙方向)兩復制叉的相遇處具有多個終止位點(不是復制叉簡單相遇）terE,D,AterF,B,C(22bp保守區(qū))FBTerminusUtilizationSubstance（TUS36kd）CADETer-TUS復合體E.coli(單起點雙方向)兩復制叉的相遇處具有多個終止位134terE,D,A僅對逆時針方向的復制叉具有終止效應

terF,B,C僅對順時針方向的復制叉具有終止效應FBCADETer-TUS復合體(Rep.forktrap)終止DnaB(螺旋酶)防止DNA過度復制避免出現(xiàn)DNA多聚體，高拷貝terE,D,A僅對逆時針方向的復制叉具有終止效應135環(huán)狀DNA分子復制完成后，兩個環(huán)狀染色體互相纏繞，成為連鎖體。需要拓撲異構酶使DNA兩條鏈斷開和再連接。環(huán)狀DNA分子復制完成后，兩個環(huán)狀染色體互相纏1363.7.

DNA的復制基因與酶類體系

3.7.DNA的復制基因137原核生物的酶類

與起始有關的蛋白因子

DnaB解開ＤＮＡ雙鏈300kdhexamerRNApolRNAprimerforleadingstrandDnaC與DnaB相互作用25kdDnaGRNAprimerforlaggingStrand60kd