基因工程的發(fā)展歷史分子生物學(xué)基礎(chǔ)建立期課件

基因工程的工具及方法限制酵素(restrictionenzyme)連接酵素(ligase)載體(vector)宿主(host)1基因工程的工具及方法限制酵素(restrictionenz限制酵素(restrictionenzyme)可從不同來源之DNA製造兩端帶有相同黏合端子(cohesiveend)之核酸序列片段。不同之限制酵素因認(rèn)定序列(recognitionsite)之不同，分可切製200至數(shù)千個核甘酸之DNA，因而容許轉(zhuǎn)殖具有生物功能（基因）之核酸片段（通常一個基因約有1000個以上核甘酸）。以切割序列含有為七、六、五、四個核甘酸認(rèn)定序列者，因切割後之DNA片段較大，較為有用。2限制酵素(restrictionenzyme)可從不同來源連接酵素(ligase)假如限制酵素是可切割特定DNA序列之“剪刀”，則連接酵素有如“漿糊”，可用來連接不同來源、不同大小但帶有相同黏合端序列之核酸片段。較常用之連接酵素有E.coliligase及T4ligase。這兩種ligases均可連接有黏合端子之雙股核酸片段，T4ligase更可連接bluntend之核酸片段。通常在基因轉(zhuǎn)殖之操作裡都使用可產(chǎn)生相同黏合端序列之限制酵素來切割質(zhì)體及樣品DNA。因使用相同之限制酵素切割之DNA片段都有互補(bǔ)之黏合端序列，故連接酵素就可把質(zhì)體及樣品DNA片段結(jié)合，製成所謂之重組核酸(recombinantDNA)。3連接酵素(ligase)假如限制酵素是可切割特定DNA序列之載體(vector)一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片段之核酸個體。載體DNA的構(gòu)造應(yīng)含有的核酸序列：1.在宿主裡複製(replication)DNA之複製子(replicon)序列。2.帶有可供篩選重組核酸之標(biāo)幟序列，如抗生素抗藥性或產(chǎn)生顏色反應(yīng)之b-galactosidase等之標(biāo)幟。3.帶有多種限制酵素切割之區(qū)域(multiplerecognitionsites)，以供轉(zhuǎn)殖不同限制酵素切割之核酸片段。4載體(vector)一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片載體之功能分類具篩選標(biāo)幟之載體(markervector):如pBR322,pUC等系列載體，都帶有可供迅速篩選之標(biāo)記；如b-galactosidase,luciferase,抗生素抗藥性等可供迅速篩選重組核酸之標(biāo)幟。轉(zhuǎn)運載體(shuttlevector)：如pMAN等載體，帶有能載細(xì)菌及動物間作核酸複製及基因表現(xiàn)之雙重功能，故可在不同生物間作基因轉(zhuǎn)移之操作。核酸序列分析之載體(sequencingvector)：如pUC/m13及pUC/f1，pGEM-3Ef系列載體，因其可製造單股DNA，以供分析核酸序列，或可用已知之primer來迅速作核酸序列分析。表現(xiàn)載體(expressionvector)：如pET,pGEM,pEX等載體，帶有如SP6,T7,T3,lac等優(yōu)良之啟動子，或帶有兩個不同方向之T7,SP6之啟動子以供基因表現(xiàn)製造蛋白。5載體之功能分類具篩選標(biāo)幟之載體(markervector)載體之功能分類(continued)特殊功能載體(specialpurposevector)：如pCAT-promoter,pCAT-enhancer可用於分析真菌細(xì)胞之加強(qiáng)基因(enhancer)及啟動子之功能。以l為基礎(chǔ)之載體：如lgt系列載體、EMBL系列載體，可供轉(zhuǎn)殖較大之核酸片段?？衫渺吨参锘蜣D(zhuǎn)移使用之Agrobacter的Tiplasmid等。若欲轉(zhuǎn)殖之核酸片段在10kb以下,則使用細(xì)菌載體(plasmid)，載10kb以上通常使用l系列之載體，若轉(zhuǎn)殖更大的片段則可使用黏接質(zhì)體(cosmid)為載體。6載體之功能分類(continued)特殊功能載體(speci宿主(host)包括E.coli,真核細(xì)胞之酵母菌(yeast),昆蟲病毒系統(tǒng)(baculoviralsystem)及動物細(xì)胞系統(tǒng)(mammaliansystem).E.coli作為宿主之優(yōu)點為可在很短時間以最便宜之培養(yǎng)基來大量表現(xiàn)基因、製造蛋白，其製造成本最低，其缺點為E.coli缺乏glycosylation等與蛋白活性相關(guān)之功能，並且在E.coli內(nèi)大量產(chǎn)生之蛋白常形成內(nèi)涵體(inclusionbody)之固體存在，缺乏生理活性，但以E.coli製造出來之製劑亦有：humaninsulin,a-interferon,IL-2.等以yeast製造成功之例子有：HBsAgvaccine,G-CSF等以動物細(xì)胞表現(xiàn)成功例子有：EPO,tPA,FactorVIII,FactorVII等7宿主(host)包括E.coli,真核細(xì)胞之酵母菌(ye各種使用於基因工程之宿主特點比較8各種使用於基因工程之宿主特點比較8ExpressionofhumaninsulininE.coli9ExpressionofhumaninsulininBacterialproductionofhumangrowthhormone10BacterialproductionofhumanBacterialproductionofhumangrowthhormone(b)11BacterialproductionofhumanProductionofasubunitvaccineinyeast12ProductionofasubunitvaccinSalvagePathway13SalvagePathway13Productionoftissueplasminogenactivator(tPA)14ProductionoftissueplasminogProductionofamonoclonalantibody(MAb)15ProductionofamonoclonalantAbispecificantibody16Abispecificantibody16基因工程之新應(yīng)用17基因工程之新應(yīng)用17全球生技藥品市場及成長率18全球生技藥品市場及成長率18生技藥品市場分配份額19生技藥品市場分配份額19不同研發(fā)階段之生技藥品20不同研發(fā)階段之生技藥品20紅血球生成素(Erythropoietin,EPO)EPO於1906年被發(fā)現(xiàn)，是一種醣蛋白荷爾蒙，其功能為調(diào)節(jié)人體紅血球的形成，它能促進(jìn)骨髓內(nèi)的紅血球前驅(qū)細(xì)胞(Erythroidprogenitorcells)，分化成為功能性的成紅血球細(xì)胞(Functionalerythroblasts)。人體內(nèi)紅血球生成素的製造，有90%以上是由腎臟分泌，其他10%左右，可能由肝臟或血管母細(xì)胞瘤(Hemangioblastomas)等地方分泌產(chǎn)生。21紅血球生成素(Erythropoietin,EPO)EPO紅血球生成素之臨床應(yīng)用RecombinantEPO於1985年即應(yīng)用於臨床，1989年美國首先應(yīng)用於治療慢性腎衰竭患者在透析後所引起的貧血。1990年美國首度通過治療AIDS患者使用AZT後所引起的貧血。1995年FDA核準(zhǔn)recombinantEPO可用來治療癌癥患者的貧血。臨床應(yīng)用作為人血替代產(chǎn)品。22紅血球生成素之臨床應(yīng)用RecombinantEPO於198EPO市場概況2005年全球銷售額達(dá)100億美元，約佔全球生技藥品市場的1/4強(qiáng),主要由Amgen,Johnson&Johnson和Roche三家廠商瓜分市場。目前全美約有25萬名洗腎患者，並以每年6~8%的速率成長，在歐洲也有17萬名的洗腎患者，這二個市場為EPO藥品創(chuàng)造了巨大的商機(jī)。23EPO市場概況2005年全球銷售額達(dá)100億美元，約佔全球生干擾素(Interferons,IFN)1957年兩位美國科學(xué)家在研究病毒干擾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)了一種抗病毒的特效藥-IFN，它是少數(shù)幾種能抵禦病毒的天然防禦物質(zhì)之一。IFN是一種重要的細(xì)胞因子，它是在人體受到病毒感染時，免疫細(xì)胞透過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)，而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能相近的醣蛋白。IFN具有廣效的抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性，現(xiàn)唯一種重要的抗病毒、抗腫瘤治療藥物。24干擾素(Interferons,IFN)1957年兩位美國干擾素之生產(chǎn)早期IFN是用病毒或誘導(dǎo)人體細(xì)胞產(chǎn)生，先由血液中提取白細(xì)胞(leukocyte)，然後用病毒去感染它，使白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，其產(chǎn)量每個細(xì)胞最多產(chǎn)生100~1,000個干擾素分子，純化後，便可供使用。1980年美國Genentech公司利用基因工程技術(shù)改造的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)，1～2天便可產(chǎn)生20萬個干擾素分子，因此現(xiàn)在大多數(shù)採用基因工程大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。25干擾素之生產(chǎn)早期IFN是用病毒或誘導(dǎo)人體細(xì)胞產(chǎn)生，先由血液中干擾素之臨床應(yīng)用干擾素有多種亞型，包括18種,一種,一種和一種。IFN1b 病毒性疾病IFN2a 病毒性疾病，腫瘤IFN2b 病毒性疾病，腫瘤IFN 多發(fā)性硬化癥IFN 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎26干擾素之臨床應(yīng)用干擾素有多種亞型，包括18種,一種,干擾素之市場分析干擾素約佔全球生技藥品市場的17%,銷售額達(dá)60億美元以上。PEG－干擾素上市，不僅延長產(chǎn)品的半衰期，且?guī)Ыo病人更多的便利性。目前主要由Biogen,Schering及Serono三家廠商瓜分市場。27干擾素之市場分析干擾素約佔全球生技藥品市場的17%,銷售額達(dá)胰島素(Insulin)Insulin是由胰臟B細(xì)胞分泌，可控制血糖的貯存及移動。糖尿病患者正是缺乏適量的胰島素來移出血液中的葡萄糖，而使血糖增高，因此必需注射胰島素來控制血糖的濃度，以解除糖尿現(xiàn)象。28胰島素(Insulin)Insulin是由胰臟B細(xì)胞分泌，可胰島素製造方法化學(xué)合成法：成本高、過程繁複，只能在實驗室中小量地製造，而沒有真正商業(yè)化的推廣價值。動物胰臟萃取法：豬與人類的胰島素只差B30一個氨基酸，牛與人類差三個氨基酸，所以一些動物的胰島素也可以在人身上使用。但是萃取所得不純的胰島素會使病人有過敏反應(yīng)，因此動物胰島素純化技術(shù)是影響市場的重要因素。半合成製造法：將豬B30的Alanine改成Threonine，可將豬胰島素轉(zhuǎn)換成人類胰島素。遺傳工程製造法。29胰島素製造方法化學(xué)合成法：成本高、過程繁複，只能在實驗室中小胰島素市場分析約佔全球生技藥品市場的13.2%。主要廠商為NovoNordisk及Lilly.30胰島素市場分析約佔全球生技藥品市場的13.2%。30單株抗體(monoclonalantibody)1975年Dr.GeorgeKohler及Dr.CesarMilstein發(fā)明融合瘤技術(shù)，生產(chǎn)單株抗體由單一細(xì)胞株(cellline)所製造出來之單一抗體稱之為單株抗體屬於第二代抗體。由於其具有特異性高、親和力強(qiáng)、效價高、血清交叉反應(yīng)少等優(yōu)點，已經(jīng)在基礎(chǔ)研究、臨床診斷及治療、免疫預(yù)防等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，在治療上單株抗體主要用於抗腫瘤、抗器官移植排斥反應(yīng)、抗感染、解毒等。近年來單株抗體與毒素或化學(xué)藥物結(jié)合設(shè)計成目標(biāo)導(dǎo)向藥物，用於癌癥的治療成為近來研究的重點。31單株抗體(monoclonalantibody)1975年單株抗體技術(shù)演進(jìn)老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonoclonalantibodies:100%老鼠）。 成功例子：OrthoClone(Johnson&Johnson)在1986年上市用於治療急性腎移植的排斥。為老鼠單株抗體作用於CD3受體。32單株抗體技術(shù)演進(jìn)老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonocl單株抗體技術(shù)演進(jìn)老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonoclonalantibodies:100%老鼠）。嵌合單株抗體技術(shù)(Chimericmonoclonalantibodies:30%老鼠及70%人類）。仿人類單株抗體技術(shù)(Humanizedmonoclonalantibodies:5%-10%老鼠和90%-95%人類）人類單株抗體技術(shù)(Humanmonoclonalantibodies:100%人類）33單株抗體技術(shù)演進(jìn)老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonocl老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonoclonalantibodies)成功例子：OrthoClone(Johnson&Johnson)在1986年上市用於治療急性腎移植的排斥。為老鼠單株抗體作用於CD3受體。34老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonoclonalant老鼠單株抗體商品化的限制因素在50~80%的人體會產(chǎn)生人類抗老鼠抗體(ahumananti-mouseantibody,HAMA)，往往在尚未發(fā)生臨床效能前中和老鼠單株抗體。HAMA反應(yīng)也會妨礙再用藥，因為第一次使用引發(fā)免疫系統(tǒng)確認(rèn)老鼠單株抗體為外來物質(zhì)，產(chǎn)生更快更有效率的第二次免疫反應(yīng)，使第二次使用時效用更短甚至導(dǎo)致過敏性休克(anaphylacticshock)或更嚴(yán)重導(dǎo)致死亡。老鼠單株抗體在血中的半衰期過短，不超過20小時，往往未達(dá)到治療所需的劑量，就被代謝掉了。老鼠單株抗體的Fc區(qū)域並不能完全與人類Fc受體完全結(jié)合，無法有效的產(chǎn)生免疫反應(yīng)。35老鼠單株抗體商品化的限制因素在50~80%的人體會產(chǎn)生人類抗嵌合單株抗體為增加效能並減少HAMA免疫反應(yīng)，研究人員將老鼠抗體的Fc區(qū)域利用基因重組技術(shù)導(dǎo)入人類基因，產(chǎn)生嵌合單株抗體，嵌合單株抗體30%是老鼠抗體70%是人類抗體。嵌合單株抗體通常在10例患者中僅有1例產(chǎn)生了嵌合單株抗體的抗體，而且此例患者體內(nèi)的嵌合單株抗體的功能並沒有降低。1994年Centocor的ReoPro是第一個上市的嵌合單株抗體，商業(yè)應(yīng)用很成功，1997年IDEC/Genentech的Rituxan是另一個非常成功的嵌合抗體，銷售額超過10億美元。36嵌合單株抗體為增加效能並減少HAMA免疫反應(yīng)，研究人員將老鼠仿人類單株抗體在嵌合單株抗體中，可變區(qū)100%都是鼠源的，對人體來說仍有一定的免疫抗原性。如果治療需要多次投藥進(jìn)行的話，那麼抗體部份就必須採用人類抗體，以避免交叉免疫引起人的抗鼠反應(yīng)?？茖W(xué)家繼續(xù)努力降低單株抗體中老鼠氨基酸的量，將老鼠抗體中CDR的部份移植到人類抗體中，此技術(shù)使老鼠氨基酸降到5~10%，稱為仿人類單株抗體。在人體中仍會產(chǎn)生抗體稱為抗仿人類單株抗體抗體(ahumananti-humanizedantibody,HAHA)，但發(fā)生機(jī)率很低約1~2%。1997年FDA核準(zhǔn)第一個仿人類單株抗體產(chǎn)品，Roche/PDL的Zenapax，用於治療腎臟移植引起的排斥。37仿人類單株抗體在嵌合單株抗體中，可變區(qū)100%都是鼠源的，對人類單株抗體完全人類單株抗體之優(yōu)點： 1.不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可反覆使用效能不會下降。 2.完全結(jié)合很高的親和性，少量的藥產(chǎn)生高的效能。 3.有效程序生產(chǎn)單株抗體，能快速導(dǎo)入臨床試驗。38人類單株抗體完全人類單株抗體之優(yōu)點：38單株抗體之產(chǎn)品現(xiàn)況全球超過225家公司研發(fā)臨床治療單株抗體，預(yù)估有1000個產(chǎn)品正在研發(fā)中，其中72%進(jìn)入臨床前試驗，臨床應(yīng)用以癌癥最多佔50%,自體免疫疾病佔18%,感染佔13%,心血管疾病佔6%,器官移植引起的排斥佔5%,其他疾病佔8%,預(yù)估到2008年將有70個產(chǎn)品上市，市場銷售將達(dá)140億美元。39單株抗體之產(chǎn)品現(xiàn)況全球超過225家公司研發(fā)臨床治療單株抗體，血液因子市面上使用的抗凝血蛋白質(zhì)(anticlottingproteins)可區(qū)分為下列三大類：血液稀化劑纖維消化酵素(fibrinolyticenzyme)血栓溶解劑40血液因子市面上使用的抗凝血蛋白質(zhì)(anticlotting血液稀化劑這類產(chǎn)品適用於避免新鮮血液的凝固，且佔了抗凝血劑大部分的市場。（例如：polysaccharideheparin）41血液稀化劑這類產(chǎn)品適用於避免新鮮血液的凝固，且佔了抗凝血劑大纖維消化酵素局部用於傷口及燙傷部份的擴(kuò)創(chuàng)作用(debridement)，去除化膿及敗壞的組織。因纖維消化酵素具有纖維消化及蛋白質(zhì)分解的活性，可分解內(nèi)部血塊及幫助移除壞死皮膚。42纖維消化酵素局部用於傷口及燙傷部份的擴(kuò)創(chuàng)作用(debride血栓溶解劑凡是能夠直接分解血塊或加速內(nèi)生性溶解過程的藥物都可稱為血栓溶解劑，可破壞體內(nèi)已形成的血塊，產(chǎn)品包括urokinase,streptokinase,tissueplasminogenactivator等。鏈激酶(streptokinase)為衍生自b-溶血性鏈球菌。尿激酶(urokinase)為一種源自人類腎細(xì)胞之酵素。組織型胞漿素原活化劑(tissueplasminogenactivator,tPA)是由內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的一種serineprotease,能將血液中胞漿素原(plasminogen),轉(zhuǎn)換成具血栓溶解活性的胞漿素(plasmin),再進(jìn)一步將纖維蛋白溶解掉。43血栓溶解劑凡是能夠直接分解血塊或加速內(nèi)生性溶解過程的藥物都可凝血蛋白質(zhì)(clottingproteins)為能促進(jìn)血液凝固的蛋白質(zhì)，除了鈣及維他命K外，凝血蛋白質(zhì)多為酵素類。第八因子(factorVIII)是目前上市的主要凝血蛋白質(zhì)藥物，主要來源由人類血液中抽取，用途為控制A型血友病。很多公司試圖開發(fā)遺傳工程FactorVIII,大部分公司致力於基因重組，事實上這是一項很艱難的技術(shù)，因FactorVIII的分子量很大，而且其組成是完全的醣蛋白，因此其製程很複雜而不易開發(fā)。目前主要已上市的公司有Baxter,Bayer,Aventis,NovoNordisk,和AlphaTherapeutics。全球血液因子藥物市場約佔生技藥品市場10.7%。

44凝血蛋白質(zhì)(clottingproteins)為能促進(jìn)血液細(xì)胞集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)在進(jìn)行造血細(xì)胞的體外研究中，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子可刺激不同的造血幹細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中形成細(xì)胞群落，這些因子被命名為集落刺激因子。根據(jù)他們的作用範(fàn)圍，分別命名為G-CSF,M-CSF,GM-CSF。不同的CSF對不同發(fā)育階段的造血幹細(xì)胞和主細(xì)胞起促進(jìn)增值作用，是血細(xì)胞發(fā)生不可或缺的刺激因子。45細(xì)胞集落刺激因子(colonystimulatingfaGranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor(GM-CSF)1977年Burgress等從小鼠肺條件培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)一種能刺激粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等均可產(chǎn)生GM-CSF。其中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞一般在免疫應(yīng)答或炎癥介質(zhì)刺激過程中直接產(chǎn)生；而內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞可能通過IL-1和TNF的誘導(dǎo)而產(chǎn)生。GM-CSF主要作用為刺激Stemcell製造Granulocyte及Macrophage，可用於癌癥化學(xué)治療、放射性治療期間輔助造血劑，治療再生不良性貧血、白血球低下癥、骨髓纖維化、免疫缺乏癥等。46Granulocyte-macrophagecolonyGranulocytecolonystimulatingfactor(G-CSF)內(nèi)毒素、TNF-a和IFN-g可活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，此外，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞等在LPS,IL-1或TNF-a刺激活化後也可分泌G-CSF。GM-CSF作用較廣泛，而G-CSF及M-CSF則作用於血球分裂後期，較具特異性，分別刺激Monocyte及Granulocyte之生成。G-CSF刺激Neutrophils可用於抗細(xì)菌、黴菌、寄生蟲之感染。其他用途包括骨髓移植、嚴(yán)重燙傷及系統(tǒng)性感染之治療。G-CSF可促進(jìn)白血球之成熟，預(yù)期可用於治療白血病(Leukemia)，亦可用於治療先天性顆粒白血球缺乏癥(Congenitalagranulocytosis)。47GranulocytecolonystimulatingMacrophagecolonystimulatingfactor(M-CSF)多種細(xì)胞均可產(chǎn)生M-CSF，包括：成纖維細(xì)胞、子宮內(nèi)膜中分泌型上皮細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、腦星狀細(xì)胞、成骨細(xì)胞；LPS等啟動的巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等。M-CSF可刺激Macrophage的生成，使用於再生不良性貧血(Aplasticanemia)，可刺激Monocyte的轉(zhuǎn)移。預(yù)期用途在於抗癌作用、治療白血病及預(yù)防細(xì)菌、病毒及寄生蟲的感染，並可用於骨髓移植之復(fù)健、抗癌藥物及化學(xué)療法之佐劑等。48MacrophagecolonystimulatingCSF市場研發(fā)狀況上市公司有： Roche/Amgen(Amgen研發(fā)):FilgrastimDaiichi(Amgen研發(fā)):FilgrastimAventis(Chugai研發(fā)):LenograstimChugai(Chugai研發(fā)):LenograstimNovartis(GI,Wyeth研發(fā)):MolgramostimGreenCross(GreenCross研發(fā)):mirimostim………等CSF約佔全球生技藥品市場的8.2%。49CSF市場研發(fā)狀況上市公司有：49生長賀爾蒙(Growthhormone)由腦下垂體分泌刺激身體成長，特別是骨骼的成長，在正常狀況下人體會分泌少量生長賀爾蒙，但在青春期時會大量分泌刺激生長。1985年以前生長賀爾蒙主要由NPA(NationalPituitaryAgency)供應(yīng)，NPA生產(chǎn)生長賀爾蒙的方法，是由屍體中抽取純化，1985年4月美國FDA禁止由屍體純化的生長賀爾蒙的銷售，因為有四名患者使用該生長賀爾蒙後，受到腦部病毒(Creuz-feld-jacobdiseaseofthebrain)疾病的感染。此時，Genentech之遺傳工程生長賀爾蒙適時開發(fā)成功，並獲得核準(zhǔn)上市。生長賀爾蒙約佔全球生技藥品市場的5.1%。50生長賀爾蒙(Growthhormone)由腦下垂體分泌刺激5151介白素(Interleukin)淋巴細(xì)胞素(Lymphokines)是體內(nèi)正常免疫系統(tǒng)的一部份，其功能為調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫反應(yīng)。淋巴球(Lymphocytes)則是一種白血球細(xì)胞，當(dāng)病毒、寄生蟲、惡性癌細(xì)胞侵入體內(nèi)時，淋巴球具有調(diào)解體內(nèi)免疫系統(tǒng)以對抗入侵者的功能。淋巴球分為B細(xì)胞及T細(xì)胞兩類。B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體(免疫球蛋白)，T細(xì)胞能產(chǎn)生淋巴腺素(Lymphokines)並控制B細(xì)胞的反應(yīng)。52介白素(Interleukin)淋巴細(xì)胞素(Lymphoki介白素-2(Interleukin-2,IL-2)1976年Morgan等發(fā)現(xiàn)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有一種刺激胸腺細(xì)胞生長的因子，由於這種因子能促進(jìn)和維持T細(xì)胞長期培養(yǎng)，稱為T細(xì)胞生長因子(Tcellgrowthfactor,TCGF),1979年統(tǒng)一命名為介白素-2?？纱龠M(jìn)T細(xì)胞的增殖，破壞惡性細(xì)胞(Malignantcell)，對抗病毒感染，並刺激其他淋巴細(xì)胞素。在臨床上具有治療癌癥的潛力。為目前已上市唯一之介白素，約佔全球生技藥品市場的0.6%。53介白素-2(Interleukin-2,IL-2)197BiotechnologyDrugs

PartI BasicconceptsPartII Process:Quality&SafetyissuesPartIII Achecklistforinspection54BiotechnologyDrugs

PartI BasWhyAreBiotechnologyProductsDifferentFromSimpleOrganicChemicals?SyntheticDrugsSmallmoleculesEasysynthesisAspirinOligopeptidesHemi-synthesisNeedofactivestereo-isomersSteroidsAnticancerAntimetabolitescyclosporinExtractionBiologicalsComplex&raremoleculesAnimalsourcepossibleInsulin HeparinsHumansourcenecessaryHGHCoag.FactorsAlbumin55WhyAreBiotechnologyProductsBiotechDrugsBetteryield&bettersafetyInsulinHGHModifiedmoleculesExtractionimpossibleErythropoietinInterferonInterleukinGrowthfactors56BiotechDrugsBetteryield&beManufacturingProcessesAreDifferentBiotechProductsProducedbypurificationStartingmaterialvariableManyin-processtestsEnd-producttestscomplexProcessisproduct-specificBatchsizessmall(gorkgoffinishedproduct)ConventionaldrugsProducedbyformulationStartingmaterialdefinedFewin-processtestsEnd-producttestssimpleProcessisproducttypespecific(generalizationspossible)57ManufacturingProcessesAreDiBiotechnologyDrugsUseofmicro-organisms(procaryoticoreucaryotic)geneticallymodifiedforproductionofcomplexmoleculesAfterpurification,theproductsareusedinhumanoranimaltherapeutics58BiotechnologyDrugsUseofmicrMedicinalProductsDerivedFromRecombinantDNAInsertionofnaturallyoccurringorsyntheticnucleotidesequenceintoavectorIntroducedintoasuitablehostorganismtoensuretheefficientexpressionofthedesiredgeneproduct59MedicinalProductsDerivedFroFiveFeaturesForaBiotechnologyDrugExpressionsystemofthegeneProductionsystemcompatiblewiththemicroorganismPurificationsystemNatureoftheactiveproductPharmaceuticalformulationandpresentation60FiveFeaturesForaBiotechnolFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

1.ExpressionSystem:Vector+HostIdentify,isolateandclonethegenecodingforthedesiredproteinConstructavectorcontaining:ThegeneTheexpressioncontrols(promoter,secretionsignal…)Insertthevectorintotheselectedmicro-organismEscherichiacoliSaccharomycescerevisiaeMammaliancellsGeneticallymodifiedplants61FiveFeaturesForaBiotechnolExpressionSystem:VectorConstruction+Host62ExpressionSystem:VectorConsFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

2.TheProductionSystemPurposeOptimizesurvivalconditionsforthegeneticallymodifiedmicroorganismSothatitproducesthedesiredproteinWithacceptableyieldMaterials&MethodsSelectionofcellculturemediumSelectionofcultureconditionsSelectionofcultureequipments:fermentor,cytocultor63FiveFeaturesForaBiotechnolFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

3.ThePurificationSystemPurposeextractproteinfromacomplexgrowthmediumAchievecloseto100%purityWithoutalteringtheprotein

Materials&MethodsSequenceofpurificationstepsFiltration/ultrafiltrationPrecipitation/resolubilizationChromatography(ion-exchange,affinity,etc.)64FiveFeaturesForaBiotechnolFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

4.NatureofActiveProductProteinsChainsofamino-acidsSequenceofamino-acidsencodedbygenesFoldedinto3-DconformationToobtainbiologicalactivityHost-dependentpost-translationalmodifications(sugars…)65FiveFeaturesForaBiotechnolFiveFeaturesForaBiotechnologyDrug

5.PharmaceuticalFormulationandPresentationPurposeMaintainbiologicalactivityBymaintainingactiveproteinconformationinsolutionMaterials&MethodsStabilization(albumin,glycerol)Storageatlowtemperature66FiveFeaturesForaBiotechnolBiotechnologyDrugs

PartI BasicconceptsPartII Process:Quality&SafetyissuesPartIII Achecklistforinspection67BiotechnologyDrugs

PartI BasProcessFlow-ChartHarvestPurificationPharmaceuticalfinishingStartingmaterialFermentation-culture68ProcessFlow-ChartHarvestPurifACellBankAcollectionofampoulesofuniformcompositionstoredunderdefinedconditions,eachcontaininganaliquotofasinglepoolofcells69ACellBankAcollectionofampTheMasterCellBank(MCB)Generallyderivedfromtheselectedcellclonecontainingtheexpressionconstruct.TheMCBisusedtoderiveallworkingcellbanks.70TheMasterCellBank(MCB)GeneTheManufacturerWorkingCellBank(MWCB)DerivedbyexpansionofoneormoreampoulesoftheMCBunderdefinedcultureconditionsTheworkingcellbankisusedfortheproductionofthebatches.71TheManufacturerWorkingCellTheLateExpandedCellBank(LECB)Obtainedinmultiplyingthecellsusedfortheproductionoftherecombinantprotein,severalpassageafterthepassageofproduction.Itisusedtorevealapotentiallowviralcontaminationandtostudygeneticstabilityofthetransgene.72TheLateExpandedCellBank(LCellBankSystemStartingmaterialParentalcelllineMastercellbank(MCB)Manufacturerworkingcellbank(MWCB)ProductionsubstrateLateexpandedcellbank(LECB)Genetictransformationexpandexpandexpand73CellBankSystemStartingParentCellBankSystem74CellBankSystem74ProcessFlow-ChartStartingmaterialFermentation-cultureVariousexpansionsystems(fermentor,rollerbottle,fermentingflasks,Cellculturesystems,airlift,hollowfiberVariousculturemedia(totallysyntheticorcontainingcomponentsofanimalorigin)75ProcessFlow-ChartStartingFermProcessFlow-ChartHarvestStartingmaterialFermentation-cultureDiscontinuousproductionsystem(fromfermentor)Continuousproductionsystem(severalharvestsofculturesupernatant)76ProcessFlow-ChartHarvestStartProcessFlow-ChartHarvestPurificationStartingmaterialFermentation-cultureVariousextractionstrategies(fromsupernatantorcelldisruption)Variouspurificationmethods(accordingtopotentialcontaminants)77ProcessFlow-ChartHarvestPurifPurification:PotentialContaminantsWhatcontaminantsmaybeencountered?Whatisthesourceofthecontamination?Howhazardousarethey?Howcantheyberemoved?Howcanweensuretheirremoval?78Purification:PotentialContamPurification:PotentialContaminantsProcess-relatedimpuritiesCellsubstratederivedCellculturederivedDownstreamderivedProduct-relatedimpuritiesTruncatedformsOthermodifiedformsaggregates79Purification:PotentialContamPurification:PotentialContaminantsMicrobiologicalcontaminants:adventitiousagentsPreventintheoriginalcellsorinthemastercellbankAdventitiousvirusesintroducedduringproduction80Purification:PotentialContamPurification:PotentialContaminantsHazards:ToxicityHeavymetals,cyanogenbromide,antibiotics,organicsolvents…AlteredpharmacologicalactivityAggregates,breakdownproductsImmunogenicityOncogenicityInfectiousdiseasesMycoplasmas,yeasts,viruses81Purification:PotentialContamPurification:ContaminantRemovalAsequenceofseveralmethods:PrecipitationFiltrationLiquidchromatographybasedondifferentphysicalorchemicalprinciplesAffinity,hydrophobicity,molecularweight,electricalcharge…82Purification:ContaminantRemoBiotechnologyDrugs

PartI BasicconceptsPartII Process:Quality&SafetyissuesPartIII Achecklistforinspection83BiotechnologyDrugs

PartI BasPurificationSystemShouldBe:AppropriateJustifiedValidated84PurificationSystemShouldBe:ProcessFlow-ChartHarvestPurificationPharmaceuticalfinishingStartingmaterialFermentation-cultureStabilization(accordingtoproteinanddeliverymode)Storge85ProcessFlow-ChartHarvestPurifAChecklistForInspectionFocusonchangesinthemanufacturingprocessDonotclassifyaprioriachangeintheprocessasminorormajorConsiderthepotentialconsequencesonthedrugproductintermsof:QualitySafetyEfficacy86AChecklistForInspectionFocuChangesIntheManufacturingProcessMainreasonsforintroducingchangesImprovementofproductqualityIncreaseofproductionyieldGlobalproductivityCostsavingsProductionscale-upNewproductionsites87ChangesIntheManufacturingPAChecklistForInspection1.Cellbanksystem2.Fermentation/cultureprocess3.Purificationprocess4.Drugsubstance5.Formulatingandfilling6.Drugproduct88AChecklistForInspection1.CeIssuesForInspection:

1.CellBankSystemGMPcompliantplantdesignDocumentationofcelloriginSetupconditionsforthe(Master),(working)and(lateexpanded)cellbanks:DocumentationofviralsafetyDocumentationofexpansionconditionsStorageconditionsMeasurestakenagainstcontamination89IssuesForInspection:

1.CellIssuesForInspection:

2.Fermentation/CultureProcessStartingmaterial(cells)NewsupplierSpecificationsAdditions/substitutionofnewmaterialCellcultureconditionspH,oxygen,temperature,time,%ofreagents,formulationofculturemedia…Scaleoffermentation/cellculturemodeEquipmentChangeofadditionalfermentationsiteorfacility90IssuesForInspection:

2.FermeIssuesForInspection:

3.PurificationProcessColumn/resinchangeSizeofcolumn,supplier,cleaningconditions,storageconditionsReagentsNewsupplier,specifications,replacementofrawmaterialPurificationprotocolsAddition/substitution/eliminationofspecificstepsScaleofthedownstreamprocessingequipment91IssuesForInspection:

3.PurifIssuesForInspection:

4.DrugSubstance(activeprinciple)BatchdefinitionStorageconditionsPoolingstrategy92IssuesForInspection:

4.DrugIssuesForInspection:

5.FormulatingandFillingExcipientEquipmentManufacturingprocessScaleChangeofsite/facilityStorage&shippingconditions93IssuesForInspection:

5.FormuIssuesForInspection:

6.DrugProduct(finalproduct)Controlof:IdentityPurityActivityStabilityGeneralsafetySterilitypyrogenicity94IssuesForInspection:

6.DrugIssuesForInspection:

SummaryCleanstartingmaterialWell-characterizedcell-line(cellbank)systemValidatedproduction&purificationprocessed(In-process)controlsSpecificfinalproductstestingCompliancetoGMPs95IssuesForInspection:

SummaryConclusionThegrowingnumberofbiotechnologyproductsrequireshighlyskilledprofessionalstoinspectcomplexandchangingproductionprocesses96ConclusionThegrowingnumbero基因工程的工具及方法限制酵素(restrictionenzyme)連接酵素(ligase)載體(vector)宿主(host)97基因工程的工具及方法限制酵素(restrictionenz限制酵素(restrictionenzyme)可從不同來源之DNA製造兩端帶有相同黏合端子(cohesiveend)之核酸序列片段。不同之限制酵素因認(rèn)定序列(recognitionsite)之不同，分可切製200至數(shù)千個核甘酸之DNA，因而容許轉(zhuǎn)殖具有生物功能（基因）之核酸片段（通常一個基因約有1000個以上核甘酸）。以切割序列含有為七、六、五、四個核甘酸認(rèn)定序列者，因切割後之DNA片段較大，較為有用。98限制酵素(restrictionenzyme)可從不同來源連接酵素(ligase)假如限制酵素是可切割特定DNA序列之“剪刀”，則連接酵素有如“漿糊”，可用來連接不同來源、不同大小但帶有相同黏合端序列之核酸片段。較常用之連接酵素有E.coliligase及T4ligase。這兩種ligases均可連接有黏合端子之雙股核酸片段，T4ligase更可連接bluntend之核酸片段。通常在基因轉(zhuǎn)殖之操作裡都使用可產(chǎn)生相同黏合端序列之限制酵素來切割質(zhì)體及樣品DNA。因使用相同之限制酵素切割之DNA片段都有互補(bǔ)之黏合端序列，故連接酵素就可把質(zhì)體及樣品DNA片段結(jié)合，製成所謂之重組核酸(recombinantDNA)。99連接酵素(ligase)假如限制酵素是可切割特定DNA序列之載體(vector)一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片段之核酸個體。載體DNA的構(gòu)造應(yīng)含有的核酸序列：1.在宿主裡複製(replication)DNA之複製子(replicon)序列。2.帶有可供篩選重組核酸之標(biāo)幟序列，如抗生素抗藥性或產(chǎn)生顏色反應(yīng)之b-galactosidase等之標(biāo)幟。3.帶有多種限制酵素切割之區(qū)域(multiplerecognitionsites)，以供轉(zhuǎn)殖不同限制酵素切割之核酸片段。100載體(vector)一個可在生物體中世代相傳，攜帶外來核酸片載體之功能分類具篩選標(biāo)幟之載體(markervector):如pBR322,pUC等系列載體，都帶有可供迅速篩選之標(biāo)記；如b-galactosidase,luciferase,抗生素抗藥性等可供迅速篩選重組核酸之標(biāo)幟。轉(zhuǎn)運載體(shuttlevector)：如pMAN等載體，帶有能載細(xì)菌及動物間作核酸複製及基因表現(xiàn)之雙重功能，故可在不同生物間作基因轉(zhuǎn)移之操作。核酸序列分析之載體(sequencingvector)：如pUC/m13及pUC/f1，pGEM-3Ef系列載體，因其可製造單股DNA，以供分析核酸序列，或可用已知之primer來迅速作核酸序列分析。表現(xiàn)載體(expressionvector)：如pET,pGEM,pEX等載體，帶有如SP6,T7,T3,lac等優(yōu)良之啟動子，或帶有兩個不同方向之T7,SP6之啟動子以供基因表現(xiàn)製造蛋白。101載體之功能分類具篩選標(biāo)幟之載體(markervector)載體之功能分類(continued)特殊功能載體(specialpurposevector)：如pCAT-promoter,pCAT-enhancer可用於分析真菌細(xì)胞之加強(qiáng)基因(enhancer)及啟動子之功能。以l為基礎(chǔ)之載體：如lgt系列載體、EMBL系列載體，可供轉(zhuǎn)殖較大之核酸片段。可利用於植物基因轉(zhuǎn)移使用之Agrobacter的Tiplasmid等。若欲轉(zhuǎn)殖之核酸片段在10kb以下,則使用細(xì)菌載體(plasmid)，載10kb以上通常使用l系列之載體，若轉(zhuǎn)殖更大的片段則可使用黏接質(zhì)體(cosmid)為載體。102載體之功能分類(continued)特殊功能載體(speci宿主(host)包括E.coli,真核細(xì)胞之酵母菌(yeast),昆蟲病毒系統(tǒng)(baculoviralsystem)及動物細(xì)胞系統(tǒng)(mammaliansystem).E.coli作為宿主之優(yōu)點為可在很短時間以最便宜之培養(yǎng)基來大量表現(xiàn)基因、製造蛋白，其製造成本最低，其缺點為E.coli缺乏glycosylation等與蛋白活性相關(guān)之功能，並且在E.coli內(nèi)大量產(chǎn)生之蛋白常形成內(nèi)涵體(inclusionbody)之固體存在，缺乏生理活性，但以E.coli製造出來之製劑亦有：humaninsulin,a-interferon,IL-2.等以yeast製造成功之例子有：HBsAgvaccine,G-CSF等以動物細(xì)胞表現(xiàn)成功例子有：EPO,tPA,FactorVIII,FactorVII等103宿主(host)包括E.coli,真核細(xì)胞之酵母菌(ye各種使用於基因工程之宿主特點比較104各種使用於基因工程之宿主特點比較8ExpressionofhumaninsulininE.coli105ExpressionofhumaninsulininBacterialproductionofhumangrowthhormone106BacterialproductionofhumanBacterialproductionofhumangrowthhormone(b)107BacterialproductionofhumanProductionofasubunitvaccineinyeast108ProductionofasubunitvaccinSalvagePathway109SalvagePathway13Productionoftissueplasminogenactivator(tPA)110ProductionoftissueplasminogProductionofamonoclonalantibody(MAb)111ProductionofamonoclonalantAbispecificantibody112Abispecificantibody16基因工程之新應(yīng)用113基因工程之新應(yīng)用17全球生技藥品市場及成長率114全球生技藥品市場及成長率18生技藥品市場分配份額115生技藥品市場分配份額19不同研發(fā)階段之生技藥品116不同研發(fā)階段之生技藥品20紅血球生成素(Erythropoietin,EPO)EPO於1906年被發(fā)現(xiàn)，是一種醣蛋白荷爾蒙，其功能為調(diào)節(jié)人體紅血球的形成，它能促進(jìn)骨髓內(nèi)的紅血球前驅(qū)細(xì)胞(Erythroidprogenitorcells)，分化成為功能性的成紅血球細(xì)胞(Functionalerythroblasts)。人體內(nèi)紅血球生成素的製造，有90%以上是由腎臟分泌，其他10%左右，可能由肝臟或血管母細(xì)胞瘤(Hemangioblastomas)等地方分泌產(chǎn)生。117紅血球生成素(Erythropoietin,EPO)EPO紅血球生成素之臨床應(yīng)用RecombinantEPO於1985年即應(yīng)用於臨床，1989年美國首先應(yīng)用於治療慢性腎衰竭患者在透析後所引起的貧血。1990年美國首度通過治療AIDS患者使用AZT後所引起的貧血。1995年FDA核準(zhǔn)recombinantEPO可用來治療癌癥患者的貧血。臨床應(yīng)用作為人血替代產(chǎn)品。118紅血球生成素之臨床應(yīng)用RecombinantEPO於198EPO市場概況2005年全球銷售額達(dá)100億美元，約佔全球生技藥品市場的1/4強(qiáng),主要由Amgen,Johnson&Johnson和Roche三家廠商瓜分市場。目前全美約有25萬名洗腎患者，並以每年6~8%的速率成長，在歐洲也有17萬名的洗腎患者，這二個市場為EPO藥品創(chuàng)造了巨大的商機(jī)。119EPO市場概況2005年全球銷售額達(dá)100億美元，約佔全球生干擾素(Interferons,IFN)1957年兩位美國科學(xué)家在研究病毒干擾現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)了一種抗病毒的特效藥-IFN，它是少數(shù)幾種能抵禦病毒的天然防禦物質(zhì)之一。IFN是一種重要的細(xì)胞因子，它是在人體受到病毒感染時，免疫細(xì)胞透過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)，而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能相近的醣蛋白。IFN具有廣效的抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性，現(xiàn)唯一種重要的抗病毒、抗腫瘤治療藥物。120干擾素(Interferons,IFN)1957年兩位美國干擾素之生產(chǎn)早期IFN是用病毒或誘導(dǎo)人體細(xì)胞產(chǎn)生，先由血液中提取白細(xì)胞(leukocyte)，然後用病毒去感染它，使白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，其產(chǎn)量每個細(xì)胞最多產(chǎn)生100~1,000個干擾素分子，純化後，便可供使用。1980年美國Genentech公司利用基因工程技術(shù)改造的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)，1～2天便可產(chǎn)生20萬個干擾素分子，因此現(xiàn)在大多數(shù)採用基因工程大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。121干擾素之生產(chǎn)早期IFN是用病毒或誘導(dǎo)人體細(xì)胞產(chǎn)生，先由血液中干擾素之臨床應(yīng)用干擾素有多種亞型，包括18種,一種,一種和一種。IFN1b 病毒性疾病IFN2a 病毒性疾病，腫瘤IFN2b 病毒性疾病，腫瘤IFN 多發(fā)性硬化癥IFN 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎122干擾素之臨床應(yīng)用干擾素有多種亞型，包括18種,一種,干擾素之市場分析干擾素約佔全球生技藥品市場的17%,銷售額達(dá)60億美元以上。PEG－干擾素上市，不僅延長產(chǎn)品的半衰期，且?guī)Ыo病人更多的便利性。目前主要由Biogen,Schering及Serono三家廠商瓜分市場。123干擾素之市場分析干擾素約佔全球生技藥品市場的17%,銷售額達(dá)胰島素(Insulin)Insulin是由胰臟B細(xì)胞分泌，可控制血糖的貯存及移動。糖尿病患者正是缺乏適量的胰島素來移出血液中的葡萄糖，而使血糖增高，因此必需注射胰島素來控制血糖的濃度，以解除糖尿現(xiàn)象。124胰島素(Insulin)Insulin是由胰臟B細(xì)胞分泌，可胰島素製造方法化學(xué)合成法：成本高、過程繁複，只能在實驗室中小量地製造，而沒有真正商業(yè)化的推廣價值。動物胰臟萃取法：豬與人類的胰島素只差B30一個氨基酸，牛與人類差三個氨基酸，所以一些動物的胰島素也可以在人身上使用。但是萃取所得不純的胰島素會使病人有過敏反應(yīng)，因此動物胰島素純化技術(shù)是影響市場的重要因素。半合成製造法：將豬B30的Alanine改成Threonine，可將豬胰島素轉(zhuǎn)換成人類胰島素。遺傳工程製造法。125胰島素製造方法化學(xué)合成法：成本高、過程繁複，只能在實驗室中小胰島素市場分析約佔全球生技藥品市場的13.2%。主要廠商為NovoNordisk及Lilly.126胰島素市場分析約佔全球生技藥品市場的13.2%。30單株抗體(monoclonalantibody)1975年Dr.GeorgeKohler及Dr.CesarMilstein發(fā)明融合瘤技術(shù)，生產(chǎn)單株抗體由單一細(xì)胞株(cellline)所製造出來之單一抗體稱之為單株抗體屬於第二代抗體。由於其具有特異性高、親和力強(qiáng)、效價高、血清交叉反應(yīng)少等優(yōu)點，已經(jīng)在基礎(chǔ)研究、臨床診斷及治療、免疫預(yù)防等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，在治療上單株抗體主要用於抗腫瘤、抗器官移植排斥反應(yīng)、抗感染、解毒等。近年來單株抗體與毒素或化學(xué)藥物結(jié)合設(shè)計成目標(biāo)導(dǎo)向藥物，用於癌癥的治療成為近來研究的重點。127單株抗體(monoclonalantibody)1975年單株抗體技術(shù)演進(jìn)老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonoclonalantibodies:100%老鼠）。 成功例子：OrthoClone(Johnson&Johnson)在1986年上市用於治療急性腎移植的排斥。為老鼠單株抗體作用於CD3受體。128單株抗體技術(shù)演進(jìn)老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonocl單株抗體技術(shù)演進(jìn)老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonoclonalantibodies:100%老鼠）。嵌合單株抗體技術(shù)(Chimericmonoclonalantibodies:30%老鼠及70%人類）。仿人類單株抗體技術(shù)(Humanizedmonoclonalantibodies:5%-10%老鼠和90%-95%人類）人類單株抗體技術(shù)(Humanmonoclonalantibodies:100%人類）129單株抗體技術(shù)演進(jìn)老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonocl老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonoclonalantibodies)成功例子：OrthoClone(Johnson&Johnson)在1986年上市用於治療急性腎移植的排斥。為老鼠單株抗體作用於CD3受體。130老鼠單株抗體技術(shù)(Murinemonoclonalant老鼠單株抗體商品化的限制因素在50~80%的人體會產(chǎn)生人類抗老鼠抗體(ahumananti-mouseantibody,HAMA)，往往在尚未發(fā)生臨床效能前中和老鼠單株抗體。HAMA反應(yīng)也會妨礙再用藥，因為第一次使用引發(fā)免疫系統(tǒng)確認(rèn)老鼠單株抗體為外來物質(zhì)，產(chǎn)生更快更有效率的第二次免疫反應(yīng)，使第二次使用時效用更短甚至導(dǎo)致過敏性休克(anaphylacticshock)或更嚴(yán)重導(dǎo)致死亡。老鼠單株抗體在血中的半衰期過短，不超過20小時，往往未達(dá)到治療所需的劑量，就被代謝掉了。老鼠單株抗體的Fc區(qū)域並不能完全與人類Fc受體完全結(jié)合，無法有效的產(chǎn)生免疫反應(yīng)。131老鼠單株抗體商品化的限制因素在50~80%的人體會產(chǎn)生人類抗嵌合單株抗體為增加效能並減少HAMA免疫反應(yīng)，研究人員將老鼠抗體的Fc區(qū)域利用基因重組技術(shù)導(dǎo)入人類基因，產(chǎn)生嵌合單株抗體，嵌合單株抗體30%是老鼠抗體70%是人類抗體。嵌合單株抗體通常在10例患者中僅有1例產(chǎn)生了嵌合單株抗體的抗體，而且此例患者體內(nèi)的嵌合單株抗體的功能並沒有降低。1994年Centocor的ReoPro是第一個上市的嵌合單株抗體，商業(yè)應(yīng)用很成功，1997年IDEC/Genentech的Rituxan是另一個非常成功的嵌合抗體，銷售額超過10億美元。132嵌合單株抗體為增加效能並減少HAMA免疫反應(yīng)，研究人員將老鼠仿人類單株抗體在嵌合單株抗體中，可變區(qū)100%都是鼠源的，對人體來說仍有一定的免疫抗原性。如果治療需要多次投藥進(jìn)行的話，那麼抗體部份就必須採用人類抗體，以避免交叉免疫引起人的抗鼠反應(yīng)。科學(xué)家繼續(xù)努力降低單株抗體中老鼠氨基酸的量，將老鼠抗體中CDR的部份移植到人類抗體中，此技術(shù)使老鼠氨基酸降到5~10%，稱為仿人類單株抗體。在人體中仍會產(chǎn)生抗體稱為抗仿人類單株抗體抗體(ahumananti-humanizedantibody,HAHA)，但發(fā)生機(jī)率很低約1~2%。19