基因分析的基本策略課件

從上世紀70年代以來，與DNA、RNA操作相關的各種分子生物學技術不斷發(fā)展，到目前已經形成了一個龐大而復雜的技術體系。基因操作已成為醫(yī)學研究的重要手段。簡單地說，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技術。本章主要討論如何對基因進行定性、定量分析；在隨后的2章里分別介紹基因功能研究的技術和基因工程的有關內容。第六章基因分析的基本策略從上世紀70年代以來，與DNA、RNA操作相關的1、需要進行基因的DNA序列分析:序列測定2、基因的染色體上定位：原位雜交技術3、研究基因在基因組中的拷貝數：SouthernBlot4、研究基因表達水平：NorthernBlot、逆轉錄實時PCR技術5、研究基因表達產物的水平：WesternBlot、流式細胞儀（FACS）對一個已知或未知基因的內容進行研究步驟：1、需要進行基因的DNA序列分析:序列測定對一個已知或未知基第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度對基因和基因組進行研究一、DNA序列測定可以揭示基因和基因組一級結構變化DNA測序技術：

1、雙脫氧鏈終止法(Sanger法)2、化學裂解法

3、PCR測序技術

4、全自動DNA測序儀這些技術的發(fā)明,都依賴于高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度一、DNA序列測

Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑。2ˊ,3ˊ-ddNTP脫氧核糖的3ˊ位缺少羥基，它可以與多核苷酸鏈的3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個核苷酸縮合，導致多核苷酸鏈的延伸終止。

如果在DNA的合成反應中，加入一種少量的ddNTP，則多核苷酸鏈的延伸將在隨機的位點終止，生成一系列長短不一的核苷酸鏈。在4組獨立的DNA合成反應中，分別加入4種不同的ddNTP，結果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個A，G，C，T的位置上。對這4組核苷酸鏈進行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。雙脫氧測序方法原理Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ基因分析的基本策略基因分析的基本策略基本步驟：1、先將DNA的末端之一標記放射性同位素（32P、35S），2、再將DNA樣品分別進行多組具堿基特異性、隨機的、不完全的化學修飾；3、采用修飾堿基敏感的特異化學試劑在修飾堿基位置斷開DNA鏈；4、通過具有可分辨鏈長短僅一個核苷酸之差的聚丙烯胺凝膠電泳，將DNA斷裂片段按分子大小分離開5、根據放射自顯影膠片上顯示的末端標記片段分布情況，直接讀出DNA序列?；瘜W裂解法（Maxam-Gilbert）

1977基本步驟：化學裂解法（Maxam-Gilbert）反應體系堿基修飾堿基修飾主鏈斷裂斷裂點試劑反應試劑

G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G/AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C/TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C在化學修飾反應中，通過控制反應溫度和反應時間，只有一小部分堿基被修飾，隨后進行斷裂反應也是定量。反應體系堿基修飾堿基修飾5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACTG-3`5`*G5`*GATCACTACTG5`*G5`*GA5`*GATCA5`*GATCACTA5`*GATCACTACTG5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACT5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTACGG+AC+TCGA/GC/TC5`*G5`*GA5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTAC5`*GATCA5`*GATCACT5`*GATCACTA5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATCACTACTG硫酸二甲酯甲酸肼肼（加鹽）5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACDNA自動測序儀上述兩種方法都不適應大規(guī)模DNA測定需要。存在操作步驟繁瑣、效率低、速度慢的缺點，特別是讀結果的讀片過程。1987年發(fā)明了一種準確快速的DNA測序方法，即激光測序法和配套的自動測序儀。（用熒光染料結合引物）。隨后又發(fā)明了終止標記系統(tǒng)法。DNA自動測序儀上述兩種方法都不適應大規(guī)模DNA測定需要。存1、揭示基因和基因組一級結構變化在醫(yī)學研究中具有重要意義。2、通過DNA序列分析，可以鑒定基因和基因組變異。3、通過DNA序列分析，可以鑒定分析人工重組的基因。4、通過DNA序列測定對定點突變進行確認。

DNA序列測定的意義1、揭示基因和基因組一級結構變化在醫(yī)學研究中具有重要意義。D分析基因拷貝數變化一、Southernblot檢測基因拷貝數變化Southernblot印跡雜交是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA片段轉印并結合到一定的固定支持物上，然后用標記的DNA探針檢測待測DNA的一種方法。

1975年英國愛丁堡大學的Southern建立了該方法，Southern印跡雜交由此得名。分析基因拷貝數變化一、Southernblot檢測基因拷Southernblot步驟（1）待測核酸樣品的制備：提取基因組DNA，并用適當的限制性內切酶消化水解基因組DNA，成大小不一的DNA片段。（2）待測DNA樣品的電泳分離。（3）凝膠中核酸的變性：DNA在制備與電泳過程中DNA片段始終保持雙鏈結構。電泳結束后DNA變性并轉移到適當的固定支持物上才能進行Southernblot。變性通常用堿變性法。Southernblot步驟（1）待測核酸樣品的制備：提取（4）Southern轉膜：將凝膠中的DNA進行堿變性并將PH恢復中性后，即可將凝膠中DNA轉移到固定支持物上。固定支持物：硝酸纖維素（NC）膜、尼龍膜、化學活化膜和濾紙等。轉移方法：毛吸管虹吸印跡法、電轉印跡法、真空轉移法。（5）已知序列的DNA探針的制備（4）Southern轉膜：將凝膠中的DNA進行堿變性并（6）Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探針進行雜交前，必須先進行一個預雜交的過程。因為能夠結合DNA的膜同樣可以和探針DNA結合，在進行雜交實驗前，必須將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉。（7）雜交結果的檢測：采用核素標記的探針或發(fā)光劑標記的探針進行雜交時，在雜交洗膜后，將濾膜和X線片裝入暗盒，感光后，經沖洗，在X線片上可見黑色條帶。（6）Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探1、對某種生物體基因組拷貝數研究，需要完整提取出基因組，并需要適當的限制性內切酶酶切；2、通常要研究的基因序列是已知的。Southernblot檢測基因拷貝數注意事項1、對某種生物體基因組拷貝數研究，需要完整提取出基因組，并需二、采用PCR技術也可以分析基因拷貝數原理：細胞內DNA復制是一個復雜過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，PCR原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對簡單。PCR反應體系：耐熱的TaqDNA聚合酶、化學合成的寡聚核苷酸引物、4種dNTP、以及合適的緩沖液體系。PCR反應的基本過程：變性、退火、延伸二、采用PCR技術也可以分析基因拷貝數原理：基因分析的基本策略PCR技術對擴增的模板濃度雖然很低，擴增產量以一個恒定的指數率上升，但經過25至30個循環(huán)，產量會達到一個平臺期，同時PCR過程中，還會出現“試管效應”，因些對不同樣本量的比較無法直接用PCR技術來鑒定。近年來，隨著PCR技術的不斷改進，如差異顯示PCR和實時PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數的分析。PCR技術對擴增的模板濃度雖然很低，擴增產量以

是根據絕大多數真核細胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。根據PolyA序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征，設計合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物；同時為擴增出polyA上游500bp以內所有可能性的mRNA序列，在5′端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行PCR擴增能產生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量，進行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達的目的基因。（1）差異顯示PCR用于基因拷貝數分析是根據絕大多數真核細胞mRNA3'端

盡管應用

差異顯示PCR方法已經取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進之中，但它仍然存在幾個難以解決的問題：但它仍然存在幾個難以解決的問題：(1)重復率低，至少有20%的差異條帶不能被準確重復；(2)假陽性率可以高達90%；(3)獲得的差異表達序列極少包含編碼信息。盡管應用

差異顯示PCR方法已經取得了不少成果（2）、代表性差異分析技術該技術是將差減雜交與PCR有機結合形成的一種方法.主要步驟:1、將對照組(driver)和待測組(tester)mRNA逆轉錄成cDNA片段群,接上接頭進行第一次PCR擴增;2、將兩組PCR產物片段群用限制性內切酶酶切,形成平均長度256bp的長度.3、將接頭消化,在tester組末端接上新的接頭,tester組和driver組按1:100比例混合.過量的driver可與tester中互補的部分形成雙鏈.4\復性,按新接頭序列設計引物進行第2輪PCR，只有tester和tester雜合體才能和引物配對,大量拉增.（2）、代表性差異分析技術該技術是將差減雜交與PCR有機結合

實時PCR根據PCR反應動力學特點設計的分析方法。在PCR反應的初始階段，反應體系中的模板的產物深度較低，而引物是過量的，產物和模板復性不會形成與引物競爭，此時產物含量呈指數增加。當PCR產物積累后，產物的復性可以競爭引物與模板的結合，產物增加減慢，最后進入平臺期。所以對樣品中的cDNA進行定量分析的最佳時期是反應早期。有人試圖依靠循環(huán)次數減少來分析樣品中的cDNA含量，但因樣品的差異使之很不可靠。在一定的循環(huán)中，mRNA豐度低的樣品產量少，可能尚不能檢測，豐度高的樣品可能已進入平臺期，故難以較。（3）實時PCR用于基因拷貝數分析實時PCR根據PCR反應動力學特點設計的

實時PCR原理是：在PCR反應體系中加入一種雙色熒光標記的寡核苷酸探針，并根據探針上熒光信號的變化計算模板DNA含量。如：TaqMan系統(tǒng)在寡核苷酸探針的5`端標記一個報告熒光染料，3`端標記一個猝滅染料。當光源照射到探針時，被激活的報告熒光染料將能量轉移給附近的猝滅染料而不發(fā)光。當PCR產物擴增時，聚合酶遇到結合在模板上的熒光探針時，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用，將兩種染料分離，因此根據報告熒光所發(fā)射的熒光強度與被切探針成正比，由此可以計算出PCR產物的含量。實時PCR原理是：在PCR反應體系中加入基因分析的基本策略實時PCR技術特別適合于低拷貝基因的定量。實時PCR需要包括熱循環(huán)儀、計算機、光學儀器用于熒光激發(fā)和收集器、數據處理和分析軟件。實時PCR技術特別適合于低拷貝基因的定量。

核酸保持在細胞或組織切片中，經適當方法處理細胞或組織后，將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。原位雜交不需要從組織提取核酸，對組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，并可完整保持組織與細胞形態(tài)，更能準確反映出組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)。三、原位雜交技術可以分析基因在染色體上位置核酸保持在細胞或組織切片中，經適當方法處理

根據檢測對象不同可將原位雜交分為細胞內原位雜交和組織切片原位雜交。同時原位雜交既可檢測DNA，也可檢測RNA，所用探針不同而以。核酸探針根據標記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。放射性同位素標記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，非放射性探針可以用生物素、地高辛、熒光素標記探針。根據檢測對象不同可將原位雜交分為細胞內原（一）、固定：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；使探針易于進入細胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它的固定劑（如戊二醛）。（二）、玻片和組織切片的處理：包括玻片處理、細胞組織切片的處理、降低背景、預雜交。（三）雜交：調整探針的濃度（0.5～5.0ng/μl）、探針長度（50～100個堿基）、雜交的溫度和時間（四）雜交后處理：包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。（五）顯示：根據核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。（六）結果分析基本方法（一）、固定：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RN

真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研究中，以mRNA研究最為熱點。它的研究可以提示基因的結構、基因的活性、或基因的變異等。

mRNA研究常用的方法有Northernblot、原位雜交、實時PCR、RNA酶保護試驗、cDNA芯片技術和RT-PCR。第二節(jié)

利用RNA定性定量分析可從不同角度揭示基因表達活性真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、Northernblot印跡雜交是指待測RNA樣品經電泳分離后轉移到固定支持物上，然后與標記的核酸探針進行固-液相雜交。原理同Southernblot。但因Northernblot印跡雜交法檢測的是RNA，在外界環(huán)境中極易被環(huán)境中的RNA酶所降解，因此制備RNA樣品時，所需器皿均需要特殊處理。同時作為監(jiān)測細胞內RNA含量不夠準確，只能作為定性分析RNA方法。（一）Northernblot定性分析RNA的常用方法Northernblot印跡雜交是指待RT-PCR是一種以mRNA為模板的體外擴增cDNA的技術。其基本程序是：提取細胞總RNA，然后將其中的mRNA在體外逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，進行特定基因的PCR擴增。因為PCR擴增產物有平臺效應，故RT-PCR也一般用于RNA的定性分析。但如果將陽性參照基因作為內參照與待測RNA在一個反應體系中進行擴增，可以對RNA進行相對定量分析。參照基因：β-肌動蛋白（β-actin）、3-磷酸甘油醛脫氫酶、rRNA基因等。（二）RT-PCR用于定性、定量分析RNA方法RT-PCR是一種以mRNA為模板的體外三、RNA酶保護試驗—了解基因轉錄后的選擇性剪接

RNA酶保護試驗是利用RnaseA和RnaseT1能專一的降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到保護的特性，用體外轉錄合成的放射性核素標記的RNA探針與待檢測mRNA進行液相雜交，使RNA探針和待測RNA間在互補序列處形成雜交體，然后用RnaseA和RnaseT1切割此RNA雜交體，受到保護的RNA通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，從而估計待檢測mRNA情況。RNA酶保護試驗：可用于①mRNA定量、②mRNA末端定位、③mRNA剪切部位④確定內含子在相應基因中的位置。三、RNA酶保護試驗—了解基因轉錄后的選擇性剪接RRNA酶保護試驗：全新的mRNA定量分析方法

其基本原理是將標記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結合，形成雙鏈RNA；未結合的單鏈RNA經RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護實驗。RNA酶保護試驗：全新的mRNA定量分析方法

監(jiān)測大量基因表達的最好方法之一是cDNA微陣列技術，利用這種技術可以同時測定成千上萬個基因的轉錄活性。

cDNA微陣列技術的基本原理與核酸分子雜交方法是一樣的。都是應用已知核酸序列作為探針與互補的靶核酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性或定量分析基因的表達情況。利用cDNA微陣列能在同一時間內平行分析大量的基因轉錄產物，進行大量的信息篩選和檢測分析。三、cDNA微陣列（cDNA芯片）可同時分析大量基因的轉錄活性監(jiān)測大量基因表達的最好方法之一是cD

目前研究蛋白質的技術一般多采用免疫印記技術（Westernblot）或免疫組化染色對蛋白質進行分析。目前在1、研究轉基因的活性。2、研究克隆基因的表達。上必須選用蛋白質技術對基因的表達活性進行分析。第三節(jié)利用蛋白質的定性定量定位分析揭示基因的表達活性目前研究蛋白質的技術一般多采用免疫印記Westernblot是一種免疫印記技術，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標記物的抗體分子作為探針，檢測轉移到固相支持物上的蛋白質分子。

基本過程：蛋白質樣品制備和SDS分離；蛋白質的轉膜；標記的抗體與膜上蛋白質的抗原抗體雜交；檢測并分析標記物信號。（一）Westernblot可對細胞總蛋白中的特定基因產物進行鑒定Westernblot是一種免疫印記技

流式細胞術也稱為熒光激活細胞分揀技術。是一種快速定量分析細胞的新技術。其基本原理也是抗原抗體的特異結合，但抗原一般位于活細胞表面或內部的蛋白質分子，用熒光標記的抗體與抗原結合，經過流式細胞儀分析熒光信號，從而根據其信號的強弱，來判斷細胞內某基因的表達活性。對轉染細胞的外源基因表達情況也可以采用此法。二、流式細胞術可在細胞水平上分析特定蛋白質流式細胞術也稱為熒光激活細胞分揀技術。是

免疫組化其基本原理是利用顯色劑標記的特異抗體在組織或細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學顯色反應檢測特定抗原。免疫組化將免疫反應的特異性、組織化學的可見性和顯微鏡的顯像和放大作用巧妙地結合起來，成為蛋白質水平分析基因的直觀特異的方法之一。（三）免疫組化方法可對細胞內或組織中的特定基因表達產物進行定性和半定量分析免疫組化其基本原理是利用顯色劑標記的特異抗體

從上世紀70年代以來，與DNA、RNA操作相關的各種分子生物學技術不斷發(fā)展，到目前已經形成了一個龐大而復雜的技術體系。基因操作已成為醫(yī)學研究的重要手段。簡單地說，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技術。本章主要討論如何對基因進行定性、定量分析；在隨后的2章里分別介紹基因功能研究的技術和基因工程的有關內容。第六章基因分析的基本策略從上世紀70年代以來，與DNA、RNA操作相關的1、需要進行基因的DNA序列分析:序列測定2、基因的染色體上定位：原位雜交技術3、研究基因在基因組中的拷貝數：SouthernBlot4、研究基因表達水平：NorthernBlot、逆轉錄實時PCR技術5、研究基因表達產物的水平：WesternBlot、流式細胞儀（FACS）對一個已知或未知基因的內容進行研究步驟：1、需要進行基因的DNA序列分析:序列測定對一個已知或未知基第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度對基因和基因組進行研究一、DNA序列測定可以揭示基因和基因組一級結構變化DNA測序技術：

1、雙脫氧鏈終止法(Sanger法)2、化學裂解法

3、PCR測序技術

4、全自動DNA測序儀這些技術的發(fā)明,都依賴于高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度一、DNA序列測

Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑。2ˊ,3ˊ-ddNTP脫氧核糖的3ˊ位缺少羥基，它可以與多核苷酸鏈的3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個核苷酸縮合，導致多核苷酸鏈的延伸終止。

如果在DNA的合成反應中，加入一種少量的ddNTP，則多核苷酸鏈的延伸將在隨機的位點終止，生成一系列長短不一的核苷酸鏈。在4組獨立的DNA合成反應中，分別加入4種不同的ddNTP，結果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個A，G，C，T的位置上。對這4組核苷酸鏈進行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。雙脫氧測序方法原理Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ基因分析的基本策略基因分析的基本策略基本步驟：1、先將DNA的末端之一標記放射性同位素（32P、35S），2、再將DNA樣品分別進行多組具堿基特異性、隨機的、不完全的化學修飾；3、采用修飾堿基敏感的特異化學試劑在修飾堿基位置斷開DNA鏈；4、通過具有可分辨鏈長短僅一個核苷酸之差的聚丙烯胺凝膠電泳，將DNA斷裂片段按分子大小分離開5、根據放射自顯影膠片上顯示的末端標記片段分布情況，直接讀出DNA序列?；瘜W裂解法（Maxam-Gilbert）

1977基本步驟：化學裂解法（Maxam-Gilbert）反應體系堿基修飾堿基修飾主鏈斷裂斷裂點試劑反應試劑

G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G/AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C/TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C在化學修飾反應中，通過控制反應溫度和反應時間，只有一小部分堿基被修飾，隨后進行斷裂反應也是定量。反應體系堿基修飾堿基修飾5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACTG-3`5`*G5`*GATCACTACTG5`*G5`*GA5`*GATCA5`*GATCACTA5`*GATCACTACTG5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACT5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTACGG+AC+TCGA/GC/TC5`*G5`*GA5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTAC5`*GATCA5`*GATCACT5`*GATCACTA5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATCACTACTG硫酸二甲酯甲酸肼肼（加鹽）5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACDNA自動測序儀上述兩種方法都不適應大規(guī)模DNA測定需要。存在操作步驟繁瑣、效率低、速度慢的缺點，特別是讀結果的讀片過程。1987年發(fā)明了一種準確快速的DNA測序方法，即激光測序法和配套的自動測序儀。（用熒光染料結合引物）。隨后又發(fā)明了終止標記系統(tǒng)法。DNA自動測序儀上述兩種方法都不適應大規(guī)模DNA測定需要。存1、揭示基因和基因組一級結構變化在醫(yī)學研究中具有重要意義。2、通過DNA序列分析，可以鑒定基因和基因組變異。3、通過DNA序列分析，可以鑒定分析人工重組的基因。4、通過DNA序列測定對定點突變進行確認。

DNA序列測定的意義1、揭示基因和基因組一級結構變化在醫(yī)學研究中具有重要意義。D分析基因拷貝數變化一、Southernblot檢測基因拷貝數變化Southernblot印跡雜交是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA片段轉印并結合到一定的固定支持物上，然后用標記的DNA探針檢測待測DNA的一種方法。

1975年英國愛丁堡大學的Southern建立了該方法，Southern印跡雜交由此得名。分析基因拷貝數變化一、Southernblot檢測基因拷Southernblot步驟（1）待測核酸樣品的制備：提取基因組DNA，并用適當的限制性內切酶消化水解基因組DNA，成大小不一的DNA片段。（2）待測DNA樣品的電泳分離。（3）凝膠中核酸的變性：DNA在制備與電泳過程中DNA片段始終保持雙鏈結構。電泳結束后DNA變性并轉移到適當的固定支持物上才能進行Southernblot。變性通常用堿變性法。Southernblot步驟（1）待測核酸樣品的制備：提?。?）Southern轉膜：將凝膠中的DNA進行堿變性并將PH恢復中性后，即可將凝膠中DNA轉移到固定支持物上。固定支持物：硝酸纖維素（NC）膜、尼龍膜、化學活化膜和濾紙等。轉移方法：毛吸管虹吸印跡法、電轉印跡法、真空轉移法。（5）已知序列的DNA探針的制備（4）Southern轉膜：將凝膠中的DNA進行堿變性并（6）Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探針進行雜交前，必須先進行一個預雜交的過程。因為能夠結合DNA的膜同樣可以和探針DNA結合，在進行雜交實驗前，必須將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉。（7）雜交結果的檢測：采用核素標記的探針或發(fā)光劑標記的探針進行雜交時，在雜交洗膜后，將濾膜和X線片裝入暗盒，感光后，經沖洗，在X線片上可見黑色條帶。（6）Southern雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探1、對某種生物體基因組拷貝數研究，需要完整提取出基因組，并需要適當的限制性內切酶酶切；2、通常要研究的基因序列是已知的。Southernblot檢測基因拷貝數注意事項1、對某種生物體基因組拷貝數研究，需要完整提取出基因組，并需二、采用PCR技術也可以分析基因拷貝數原理：細胞內DNA復制是一個復雜過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，PCR原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對簡單。PCR反應體系：耐熱的TaqDNA聚合酶、化學合成的寡聚核苷酸引物、4種dNTP、以及合適的緩沖液體系。PCR反應的基本過程：變性、退火、延伸二、采用PCR技術也可以分析基因拷貝數原理：基因分析的基本策略PCR技術對擴增的模板濃度雖然很低，擴增產量以一個恒定的指數率上升，但經過25至30個循環(huán)，產量會達到一個平臺期，同時PCR過程中，還會出現“試管效應”，因些對不同樣本量的比較無法直接用PCR技術來鑒定。近年來，隨著PCR技術的不斷改進，如差異顯示PCR和實時PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數的分析。PCR技術對擴增的模板濃度雖然很低，擴增產量以

是根據絕大多數真核細胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。根據PolyA序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征，設計合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物；同時為擴增出polyA上游500bp以內所有可能性的mRNA序列，在5′端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行PCR擴增能產生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量，進行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達的目的基因。（1）差異顯示PCR用于基因拷貝數分析是根據絕大多數真核細胞mRNA3'端

盡管應用

差異顯示PCR方法已經取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進之中，但它仍然存在幾個難以解決的問題：但它仍然存在幾個難以解決的問題：(1)重復率低，至少有20%的差異條帶不能被準確重復；(2)假陽性率可以高達90%；(3)獲得的差異表達序列極少包含編碼信息。盡管應用

差異顯示PCR方法已經取得了不少成果（2）、代表性差異分析技術該技術是將差減雜交與PCR有機結合形成的一種方法.主要步驟:1、將對照組(driver)和待測組(tester)mRNA逆轉錄成cDNA片段群,接上接頭進行第一次PCR擴增;2、將兩組PCR產物片段群用限制性內切酶酶切,形成平均長度256bp的長度.3、將接頭消化,在tester組末端接上新的接頭,tester組和driver組按1:100比例混合.過量的driver可與tester中互補的部分形成雙鏈.4\復性,按新接頭序列設計引物進行第2輪PCR，只有tester和tester雜合體才能和引物配對,大量拉增.（2）、代表性差異分析技術該技術是將差減雜交與PCR有機結合

實時PCR根據PCR反應動力學特點設計的分析方法。在PCR反應的初始階段，反應體系中的模板的產物深度較低，而引物是過量的，產物和模板復性不會形成與引物競爭，此時產物含量呈指數增加。當PCR產物積累后，產物的復性可以競爭引物與模板的結合，產物增加減慢，最后進入平臺期。所以對樣品中的cDNA進行定量分析的最佳時期是反應早期。有人試圖依靠循環(huán)次數減少來分析樣品中的cDNA含量，但因樣品的差異使之很不可靠。在一定的循環(huán)中，mRNA豐度低的樣品產量少，可能尚不能檢測，豐度高的樣品可能已進入平臺期，故難以較。（3）實時PCR用于基因拷貝數分析實時PCR根據PCR反應動力學特點設計的

實時PCR原理是：在PCR反應體系中加入一種雙色熒光標記的寡核苷酸探針，并根據探針上熒光信號的變化計算模板DNA含量。如：TaqMan系統(tǒng)在寡核苷酸探針的5`端標記一個報告熒光染料，3`端標記一個猝滅染料。當光源照射到探針時，被激活的報告熒光染料將能量轉移給附近的猝滅染料而不發(fā)光。當PCR產物擴增時，聚合酶遇到結合在模板上的熒光探針時，利用聚合酶所具有的5`-3`外切酶作用，將兩種染料分離，因此根據報告熒光所發(fā)射的熒光強度與被切探針成正比，由此可以計算出PCR產物的含量。實時PCR原理是：在PCR反應體系中加入基因分析的基本策略實時PCR技術特別適合于低拷貝基因的定量。實時PCR需要包括熱循環(huán)儀、計算機、光學儀器用于熒光激發(fā)和收集器、數據處理和分析軟件。實時PCR技術特別適合于低拷貝基因的定量。

核酸保持在細胞或組織切片中，經適當方法處理細胞或組織后，將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。原位雜交不需要從組織提取核酸，對組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，并可完整保持組織與細胞形態(tài)，更能準確反映出組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)。三、原位雜交技術可以分析基因在染色體上位置核酸保持在細胞或組織切片中，經適當方法處理

根據檢測對象不同可將原位雜交分為細胞內原位雜交和組織切片原位雜交。同時原位雜交既可檢測DNA，也可檢測RNA，所用探針不同而以。核酸探針根據標記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。放射性同位素標記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，非放射性探針可以用生物素、地高辛、熒光素標記探針。根據檢測對象不同可將原位雜交分為細胞內原（一）、固定：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；使探針易于進入細胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它的固定劑（如戊二醛）。（二）、玻片和組織切片的處理：包括玻片處理、細胞組織切片的處理、降低背景、預雜交。（三）雜交：調整探針的濃度（0.5～5.0ng/μl）、探針長度（50～100個堿基）、雜交的溫度和時間（四）雜交后處理：包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。（五）顯示：根據核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。（六）結果分析基本方法（一）、固定：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RN

真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研究中，以mRNA研究最為熱點。它的研究可以提示基因的結構、基因的活性、或基因的變異等。

mRNA研究常用的方法有Northernblot、原位雜交、實時PCR、RNA酶保護試驗、cDNA芯片技術和RT-PCR。第二節(jié)

利用RNA定性定量分析可從不同角度揭示基因表達活性真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、Northernblot印跡雜交是指待測RNA樣品經電泳分離后轉移到固定支持物上，然后與標記的核酸探針進行固-液相雜交。原理同Southernblot。但因Northernblot印跡雜交法檢測的是RNA，在外界環(huán)境中極易被環(huán)境中的RNA酶所降解，因此制備RNA樣品時，所需器皿均需要特殊處理。同時作為監(jiān)測細胞內RNA含量不夠準確，只能作為定性分析RNA方法。（一）Northernblot定性分析RNA的常用方法Northernblot印跡雜交是指待RT-PCR是一種以mRNA為模板的體外擴增cDNA的技術。其基本程序是：提取細胞總RNA，然后將其中的mRNA在體外逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，進行特定基因的PCR擴增。因為PCR擴增產物有平臺效應，故RT-PCR也一般用于RNA的定性分析。但如果將陽性參照基因作為內參照與待測RNA在一個反應體系中進行擴增，可以對RNA進行相對定量分析。參照基因：β-肌動蛋白（β-actin）、3-磷酸甘油醛脫氫酶、rRNA基因等。（二）RT-P