大腸菌群測定

大腸菌群測定小組成員：蔡川川

金思利杜夢嬌葉岳成鄭文龍1整理版ppt依據(jù)GB4789．3-2010，討論若進行食品中大腸菌群的測定，需準備好哪些材料，且如何進行測定？討論的問題2整理版ppt

大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，這些細菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，一般認為該菌群細菌可包括大腸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。大腸菌群的概述3整理版ppt食品中查出大腸菌群超標4整理版ppt由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細菌，即需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。中國采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制定的行業(yè)標準。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。國家標準國家標準采用三步法，即乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗。乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN最大可能數(shù)表，報告每100mL（g）大腸菌群的MPN值。具體操作參見GB4789.3—94《中華人民共和國國家標準食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗大腸菌群測定》

檢驗方法5整理版ppt原國家商檢局制定的行業(yè)標準

原國家商檢局制定的行業(yè)標準采用美國FDA的標準方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進行檢測。推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。證實試驗：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報告1mL(g)樣品中大腸菌群的MPN值。具體操作參見SN0169—92《中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》檢驗流程6整理版ppt

大腸菌群的測定的原理

大腸菌群之一群能在37℃經(jīng)24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)生氣體，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間結(jié)指出食品是否有腸道致病菌污染的可能。

三步法：（1）發(fā)酵乳糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸發(fā)酵試驗；（2）初發(fā)酵陽性管通過伊紅美蘭平板進行分離；（3）復(fù)發(fā)酵對分離菌做證實實驗。

食品中大腸菌群數(shù)系以每100g（或100ml）檢樣內(nèi)大腸菌群最近數(shù)(the

most

probable

number

簡稱MPN)表示。最近數(shù)MPN法是一種將樣品“多次（管）稀釋至無菌”的計數(shù)方法。將3個稀釋梯度的待檢驗樣品稀釋液接種于9支或15支試管培養(yǎng)基中，每個稀釋梯度試液接種3或5支。經(jīng)過培養(yǎng)后，根據(jù)結(jié)果查閱MPN檢索表，就可以得到原樣品中微生物的估計數(shù)量。MPN檢測方法尤其適用于帶菌量、其他方法不能檢測的食品，如水、乳制品及其其他食品中大腸菌群的計數(shù)。7整理版ppt材料3.1食品樣品：乳、肉、果汁、糕點、發(fā)酵調(diào)味品及其他食品。3.2

菌種

陽性對照菌大腸桿菌

3.3除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、菌落計數(shù)器等。3.4培養(yǎng)基和試劑：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA)、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH)、1mol/L鹽酸（HCI)。8整理版ppt第一法大腸菌群MPN計數(shù)

操作步驟

6.1、樣品的稀釋

6.1.1、固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放人盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，800or/min-10000r/min均質(zhì)1min-2min，或放人盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min-2min，制成1:10的樣品勻液。

6.1.2、液體樣品：以無菌吸管吸取25ml樣品，置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10的樣品勻液。

6.1.3、樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5-7.5

之間，必要時分別用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L鹽酸（HCI）調(diào)節(jié)。

6.1.4、用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1ml，沿管壁緩緩注人9ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1ml無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

9整理版ppt6.1.5、根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1ml無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。

6.2、初發(fā)酵試驗

每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1ml（如接種量超過1ml，則用雙料LST肉湯）,36℃±1℃培養(yǎng)24h±Zh，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進行復(fù)發(fā)酵試驗。

6.3、復(fù)發(fā)酵試驗

用接種環(huán)從所有48h±2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽(BGLB）肉湯管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。

6.4、大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告

根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B)，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。10整理版ppt11整理版ppt12整理版ppt第二法大腸菌群平板計數(shù)

8、操作步驟

8.1、樣品的稀釋

按6.1進行。

8.2、平板計數(shù)

8.2.1、選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1ml。同時分別取1ml生理鹽水加人兩個無菌平皿作空白對照。

8.2.2、及時將15mL-20ml冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL-4mlVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±l℃培養(yǎng)18h-24h。

8.3、平板菌落數(shù)的選擇

選取菌落數(shù)在30-150之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。

8.4、證實試驗

從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移