森林植物檢疫教案第5章檢驗(yàn)

PAGE19新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)森林植物檢疫學(xué)課程教案第五章森林植物檢疫檢驗(yàn)一、教學(xué)目的及要求掌握森林植物有害生物檢疫檢驗(yàn)的基本方法和程序，熟悉各方法的具體操作過(guò)程和注意事項(xiàng)等，并能靈活運(yùn)用，獨(dú)立設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)以達(dá)到檢驗(yàn)?zāi)康摹６?、講授的內(nèi)容提要森林植物檢疫檢驗(yàn)是由官方對(duì)森林植物及其產(chǎn)品或其它限制性物品進(jìn)行檢查，以確定是否存在有害生物及是否遵守植物檢疫要求。主要目的是發(fā)現(xiàn)、檢出和鑒定植物病原物、害蟲(chóng)、雜草、螨類(lèi)、線蟲(chóng)等有害生物，作為出證或檢疫處理的依據(jù)。檢驗(yàn)檢疫包括現(xiàn)場(chǎng)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?，F(xiàn)場(chǎng)檢查除能檢出和鑒定部分害蟲(chóng)、雜草種子和少數(shù)病害外，還需抽取代表性樣品送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。檢疫性有害生物的種類(lèi)繁多，適用的檢驗(yàn)方法也各不相同。其中，昆蟲(chóng)、螨類(lèi)、線蟲(chóng)和雜草種子主要采用直接檢驗(yàn)和機(jī)械分離等方法，根據(jù)形態(tài)特征鑒定。真菌則通過(guò)培養(yǎng)，根據(jù)形態(tài)特征鑒定。細(xì)菌、病毒等則需應(yīng)用生物學(xué)、生理生化和免疫學(xué)技術(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)技術(shù)應(yīng)符合以下基本要求：①靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，能檢出低量有害生物；②簡(jiǎn)單、快速、方便易行；③要有標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)程，檢驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好；④安全，不會(huì)造成有害生物的擴(kuò)散。雖然在對(duì)象和內(nèi)容上有所區(qū)別，但森林植物和農(nóng)產(chǎn)品檢疫所應(yīng)用的技術(shù)方法有共性特點(diǎn)，可以互相借鑒。一.森林植物檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室按照國(guó)家質(zhì)檢總局關(guān)于檢疫檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃方案的實(shí)施意見(jiàn)（國(guó)質(zhì)檢科[2003]366號(hào)），將檢疫檢驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室劃分為三個(gè)等級(jí)：（一）國(guó)家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；（二）區(qū)域性中心實(shí)驗(yàn)室；（三）常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)等級(jí)實(shí)驗(yàn)室按照不同要求進(jìn)行建設(shè)和管理。在《實(shí)驗(yàn)室和檢查機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定管理辦法》（2005年12月31日由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局局務(wù)會(huì)議審議通過(guò)，自2006年4月1日起施行）中，實(shí)驗(yàn)室基本條件，是指實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足的法律地位、獨(dú)立性和公正性、安全、環(huán)境、人力資源、設(shè)施、設(shè)備、程序和方法、質(zhì)量體系和財(cái)務(wù)等方面的要求。各級(jí)森林植物檢疫檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的基本條件主要應(yīng)滿足完成其職責(zé)和職能所需的安全、環(huán)境、人員、設(shè)備等方面的要求。（一）建筑條件森林植物檢疫站應(yīng)建立一個(gè)健全的檢疫實(shí)驗(yàn)室或檢驗(yàn)室，除病、蟲(chóng)、雜草檢驗(yàn)室及標(biāo)本室外，還應(yīng)具有一個(gè)預(yù)處理室和消毒處理室，以便不讓送檢樣品未經(jīng)預(yù)處理進(jìn)入其它實(shí)驗(yàn)室，同時(shí)要嚴(yán)格進(jìn)行消毒處理，嚴(yán)防疫情擴(kuò)散。（二）人員條件各級(jí)森林植物檢疫檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)擁有林學(xué)、森林保護(hù)或相關(guān)專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域高級(jí)技術(shù)人才或復(fù)合型專(zhuān)業(yè)技術(shù)人才。（三）儀器設(shè)備條件國(guó)家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備顯微成像系統(tǒng)、酶聯(lián)檢測(cè)儀等儀器設(shè)備，特別是對(duì)于新的檢測(cè)項(xiàng)目、檢驗(yàn)檢疫要求等，應(yīng)具備快速反應(yīng)和應(yīng)急能力。地區(qū)性中心實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備顯微鏡、解剖鏡、普通冰箱、水浴箱（或溫箱）、離心機(jī)和必要的攝像器材、消毒和污物處理等設(shè)備。而常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備病、蟲(chóng)、雜草檢驗(yàn)所需的基本設(shè)備，如放大鏡、解剖鏡、無(wú)菌操作臺(tái)等。（四）實(shí)驗(yàn)室管理國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)室的資質(zhì)認(rèn)定，由國(guó)家認(rèn)監(jiān)委負(fù)責(zé)實(shí)施；地方級(jí)實(shí)驗(yàn)室的資質(zhì)認(rèn)定，由地方質(zhì)檢部門(mén)負(fù)責(zé)實(shí)施。國(guó)家認(rèn)監(jiān)委依據(jù)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范，制定計(jì)量認(rèn)證和審查認(rèn)可基本規(guī)范、評(píng)審準(zhǔn)則、證書(shū)和標(biāo)志，并公布實(shí)施。資質(zhì)認(rèn)定證書(shū)的有效期為3年。二、樣品和取樣（一）樣品在植物檢疫中將來(lái)自或運(yùn)往同一地點(diǎn)，具有相同品名、商品標(biāo)準(zhǔn)、運(yùn)輸工具，并有同一收、發(fā)貨人的檢疫物稱(chēng)為同一批貨物，按批進(jìn)行檢驗(yàn)、放行或處理。通常一批貨物的數(shù)量很大，不可能全部檢驗(yàn)，必須按規(guī)定的方法由全批貨物中抽取適當(dāng)數(shù)量用于檢驗(yàn)，抽取的過(guò)程稱(chēng)為取樣或抽樣，被抽取的那一部分貨物稱(chēng)為樣品。為保證樣品的代表性和均勻度，一般采用逐級(jí)取樣的方法，逐漸減少數(shù)量。根據(jù)樣品提取和混合縮分制備過(guò)程，分為初級(jí)樣品、原始樣品、平均樣品、保留樣品和工作樣品。平均樣品送到實(shí)驗(yàn)室后，需再次分樣，一分為二，一份作為備用的樣品保存（即保留樣品），一份作為測(cè)試的工作樣品。樣品管理制度的主要內(nèi)容有：（1）抽取檢驗(yàn)樣品要給報(bào)檢人簽發(fā)《采樣憑證》。（2）在檢疫過(guò)程中發(fā)現(xiàn)檢疫性有害生物和其它危險(xiǎn)性病、蟲(chóng)的，必須保存樣品，保存期至少3個(gè)月。對(duì)不易長(zhǎng)期保存的樣品，可根據(jù)具體情況縮短時(shí)間。（3）樣品要制成標(biāo)本保存。標(biāo)本要注明寄主、調(diào)入（出）地和發(fā)現(xiàn)時(shí)間；不易制成標(biāo)本的被害狀及現(xiàn)場(chǎng)，可攝制照片、錄像片等存檔備查。（4）樣品要有專(zhuān)人負(fù)責(zé)管理，保存期間要注意防潮、防蟲(chóng)，以免受損變質(zhì)。（5）根據(jù)樣品種類(lèi)登記造冊(cè)，列明報(bào)檢單位、貨物名稱(chēng)、樣品數(shù)量、取樣時(shí)間、存放起止日期、檢疫結(jié)果和最后處理意見(jiàn)。（二）取樣1.貨物種類(lèi)應(yīng)施檢疫的森林植物及其產(chǎn)品包括：（1）林木種子、苗木和其它繁殖材料；（2）喬木、灌木、竹子等森林植物；（3）從疫情發(fā)生縣運(yùn)出的木材、竹材、根樁、枝條、樹(shù)皮、藤條及其制品；（4）森林植物的種子、苗木、接穗，以及用疫區(qū)木材、種子、苗木等為原材料制成的林產(chǎn)品；（5）花卉植物的種子、苗木、球莖、鱗莖、鮮切花、插花；（6）中藥材；（7）可能被林業(yè)檢疫性有害生物污染的其它林產(chǎn)品、包裝材料和運(yùn)輸工具。2.貨物的性質(zhì)貨物按包裝和運(yùn)輸?shù)囊?guī)格，通常有分立個(gè)體和散料兩類(lèi)。分立個(gè)體如水果、板栗、冬筍、苗木和藥材等，一般以袋、筐、箱、桶、罐等容器包裝，以批或件來(lái)計(jì)量。散料（散裝散料、分裝散料）如林木和花卉種子、球莖和鱗莖等，一般散裝或袋裝。3.取樣方法取樣方法主要根據(jù)不同有害生物的分布規(guī)律及生物學(xué)特性、貨物數(shù)量、裝載方式、堆放形式等因素而定，并兼顧到貨物的上、中、下層或堆垛的四周。常用的取樣方法有對(duì)角線取樣、棋盤(pán)式取樣和隨機(jī)取樣等幾種。樣品抽取后混勻裝于容器內(nèi)帶回。每份樣品都必須附有標(biāo)簽，記明植物或產(chǎn)品的種類(lèi)、品種、來(lái)自何地、批次、件數(shù)、取樣日期及貨物堆放（裝運(yùn)）場(chǎng)所。取樣是檢驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，取樣量愈多，準(zhǔn)確性愈高，代表性愈大。三、昆蟲(chóng)、螨類(lèi)和雜草種子的檢驗(yàn)檢疫（一）昆蟲(chóng)的檢驗(yàn)根據(jù)《森林植物檢疫技術(shù)規(guī)程》，對(duì)混雜在種子間的害蟲(chóng)，用回旋篩檢驗(yàn)；對(duì)隱藏在種子內(nèi)的害蟲(chóng)，可采用剖粒、比重、染色或軟X射線透視、藥物染色等進(jìn)行檢查；對(duì)隱蔽在葉部或干、莖部的害蟲(chóng)，用刀、鋸或其它工具剖開(kāi)被害部位或可疑部位進(jìn)行檢查。剖開(kāi)時(shí)應(yīng)注意保持蟲(chóng)體完整。害蟲(chóng)的識(shí)別鑒定可借助于解剖鏡、顯微鏡等儀器設(shè)備，參照已定名的昆蟲(chóng)標(biāo)本、有關(guān)圖譜、資料等進(jìn)行。一時(shí)難以鑒定的害蟲(chóng)，采取人工飼養(yǎng)方法，養(yǎng)至成蟲(chóng)期鑒定，或結(jié)合觀察各蟲(chóng)態(tài)特征及其生物學(xué)特性做出準(zhǔn)確鑒定。必要時(shí)送請(qǐng)有關(guān)專(zhuān)家鑒定。1.直接檢驗(yàn)利用肉眼或借助擴(kuò)大鏡來(lái)直接識(shí)別害蟲(chóng)。直接檢驗(yàn)是檢驗(yàn)檢疫的基礎(chǔ)，主要用于產(chǎn)地調(diào)查和現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。檢查種實(shí)（包括干果、生藥材等）害蟲(chóng)時(shí)，應(yīng)仔細(xì)觀察種實(shí)的形狀、色澤，檢查其是否帶有卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)，將形狀、色澤異常的種粒揀出，逐粒解剖，找出害蟲(chóng)再行識(shí)別。檢查苗木、花卉、插條、接穗等繁植材料時(shí)，應(yīng)注意觀察根、莖、葉、花各個(gè)部位，特別是皮層的縫隙，包卷的葉片和芽苞，檢查有無(wú)蟲(chóng)體依附。把發(fā)現(xiàn)的蟲(chóng)體采集下來(lái)，置于解剖鏡下識(shí)別。檢查原木、藤材、竹材時(shí)，應(yīng)仔細(xì)檢查其表面有無(wú)蟲(chóng)孔、蟲(chóng)糞、蛀屑和蟲(chóng)體依附，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行解剖檢驗(yàn)。2.過(guò)篩檢驗(yàn)根據(jù)健康飽滿種子與蟲(chóng)體、蟲(chóng)卵、蟲(chóng)癭等個(gè)體大小的差異，利用不同孔徑的篩層，通過(guò)篩動(dòng)將其分離。過(guò)篩檢驗(yàn)主要用于檢查混夾在種實(shí)之間的害蟲(chóng)，現(xiàn)場(chǎng)和室內(nèi)檢驗(yàn)時(shí)均可使用。具體方法如下：標(biāo)準(zhǔn)篩的孔徑規(guī)格和層數(shù)，可根據(jù)被檢種粒和蟲(chóng)體的大小而定。把事先選定的篩層按照孔徑大?。ù罂讖降脑谏?，小孔徑的在下）的順序套好，再將樣品放入最上面的篩層。樣品以占篩層體積的2/3為宜，加蓋后篩選。篩選時(shí)間：手動(dòng)篩選，左右擺動(dòng)20次；在篩選振蕩器上0.5min即可。然后將各層的篩上物分別倒入白瓷盤(pán)內(nèi)，攤成薄薄一層，用肉眼或借助擴(kuò)大鏡仔細(xì)檢查。將篩底的篩下物放在培養(yǎng)皿內(nèi)，置于解剖鏡下檢查，并根據(jù)篩選結(jié)果計(jì)算該批樣品的帶蟲(chóng)量。計(jì)算公式為：害蟲(chóng)含量（頭/kg）=樣品中害蟲(chóng)頭數(shù)（或卵粒數(shù)）/代表樣品重量（g）×1000有的害蟲(chóng)有假死性，也有的被凍僵或休眠，此時(shí)可把害蟲(chóng)置于20-30℃溫箱內(nèi)處理15-20min，待其復(fù)蘇后再行檢查。3.隱蔽害蟲(chóng)的檢驗(yàn)（1）染色檢驗(yàn)指用不同的化學(xué)藥劑進(jìn)行染色，根據(jù)顏色程度區(qū)分有無(wú)害蟲(chóng)，并鑒別種類(lèi)。此法適于檢出谷象、米象、豆象類(lèi)害蟲(chóng)。例如檢查紫穗槐豆象：取紫穗槐種子10g放入銅紗網(wǎng)中，浸入1%碘酒溶液中染色1-1.5min，取出后移入0.5%氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液中處理30s，然后用清水沖洗20-30s，倒入白瓷盤(pán)用擴(kuò)大鏡仔細(xì)檢查，凡在靠近種托處有一個(gè)直徑1-2mm黑色圓點(diǎn)的種粒，即為蟲(chóng)蛀的種粒。（2）比重檢驗(yàn)根據(jù)健康種實(shí)與被害種實(shí)之間比重的差異，使用不同濃度的溶液或清水，把它們分離開(kāi)來(lái)的一種方法。此法通常在種實(shí)含蟲(chóng)率較低的情況下使用。檢查種粒較重的種子時(shí)，可選用食鹽水、硝酸銨溶液，檢查種粒較輕的種子時(shí)，可選用清水和硝酸鐵溶液。同一種溶液，濃度越大浮力越大，檢查種粒較重的種子時(shí)，選用高濃度的溶液，檢查種粒輕的種子時(shí)，選用濃度低的。一般來(lái)說(shuō)，種子與溶液的容積比以1:5為宜。種子倒入溶液后，要充分?jǐn)嚢?。種子在溶液中滯留時(shí)間，各類(lèi)種實(shí)差異很大，必須因種而定。一般的林木種子在清水中靜置1min即可，但要利用清水分離漂選落葉松種子小蜂為害的種子時(shí)，種子在水中必須滯留10h以上。比重檢查亦適用于檢出線蟲(chóng)蟲(chóng)癭、菌核和雜草籽等。（3）解剖檢驗(yàn)在直觀檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，把被害狀明顯或癥狀可疑的種子、苗木、花卉、插條、接穗、原木等挑出來(lái)，用不同的工具把它剖開(kāi)，找出害蟲(chóng)進(jìn)行鑒別。（4）軟X光機(jī)檢驗(yàn)是利用軟X光的物理性能，把蛀入種苗組織內(nèi)害蟲(chóng)的影像顯現(xiàn)在放大紙或膠片上，再根據(jù)放大紙或膠片上的影像來(lái)判斷害蟲(chóng)的種類(lèi)。此法適用于稀有、珍貴種苗的檢驗(yàn)檢疫，害蟲(chóng)檢出率和檢查效率均較高。目前有兩種方法：2、3號(hào)放大紙直接攝影和膠片攝影。前者每次只可得到一幅照片，但成本較低，約為醫(yī)用X射線軟片成本的50%，一般大小的種粒均可拍攝；后者一次可得到多張照片，且可放大，銀粒細(xì)膩，密度較高，可用來(lái)拍攝種粒細(xì)小的種粒。使用膠片攝影以8DN（digitalnumber，灰度值）黑白文件反拍片和8DN電影拷貝片效果最好。操作方法：在暗室首先把放大紙或黑白文件反拍膠片按照需要的尺寸切好，裝入黑紙袋中并做好標(biāo)記，再把被檢的種苗樣品放在黑紙袋（放大紙或膠片的正面）上，置于國(guó)產(chǎn)HY-35型或其它型號(hào)農(nóng)用軟X光機(jī)載物臺(tái)上，調(diào)好焦距，打開(kāi)電源，調(diào)好電壓、電流和曝光時(shí)間，開(kāi)機(jī)拍攝。然后，在暗室把放大紙或膠片取出，用顯影液顯影，用酸性定影液定影，最后根據(jù)照片上的害蟲(chóng)影像進(jìn)行識(shí)別。種殼種仁連成一體呈白色者為健康飽滿的種子；種殼輪廓清晰，種殼內(nèi)呈暗灰色者為空粒種子；種殼輪廓清晰，種殼內(nèi)暗灰色，在暗灰色的中央有一個(gè)白色幼蟲(chóng)影像者為被害種子；在種殼內(nèi)暗灰色的中央有幾個(gè)白色幼蟲(chóng)影像重疊在一起者為寄生性天敵的幼蟲(chóng)。（5）誘器檢驗(yàn)是把異性信息素或誘餌置于誘器中，掛放在適當(dāng)場(chǎng)所誘集害蟲(chóng)的方法。此法常用在產(chǎn)地、港口、貨場(chǎng)等地。誘捕器由誘集劑、誘芯和收捕器三部分組成。目前應(yīng)用的誘集劑主要有信息素和誘餌兩類(lèi)。誘芯是誘集劑的負(fù)載材料，由塑料、橡膠、脫脂棉、海綿等材料制成。誘捕器的種類(lèi)很多，常用的有船形、三角形、圓筒形等。在苗圃、花圃、果園、種子園等地，通常將誘捕器掛在樹(shù)枝上，在港口、貨場(chǎng)等種苗、原木的集散地，一般則將其掛在離地面1-2m高的物體上。在成蟲(chóng)羽化期設(shè)置，每天檢查一次，并根據(jù)誘集有效期及時(shí)更換。（二）螨類(lèi)檢驗(yàn)螨類(lèi)檢驗(yàn)除可過(guò)篩檢查外，還可利用螨類(lèi)怕干、畏熱、負(fù)趨光性的習(xí)性，采用分樣器電熱加溫檢驗(yàn)和漂浮法快速分離檢驗(yàn)等方法。（1）分樣器電熱加溫檢驗(yàn)將樣品平鋪在分離器的細(xì)銅絲沙盤(pán)上，厚度5mm左右，加熱使盤(pán)面溫度保持在43-45℃，經(jīng)30min，仔細(xì)檢查盤(pán)下玻璃板上的螨類(lèi)。（2）漂浮法快速分離檢驗(yàn)螨類(lèi)附肢上具有較多的纖毛，高密度的液體能使細(xì)小的螨體及其卵粒較長(zhǎng)時(shí)間浮在液體表面。漂浮分離法主要將被檢樣品中各種蟲(chóng)態(tài)的螨，漂浮聚集在液體表面，快速分離出來(lái)。（見(jiàn)圖）玻璃棒玻璃棒三角燒瓶膠塞（2cm）上層液體樣品溶液黑色濾紙培養(yǎng)皿多層濾紙脫脂棉1類(lèi)漂浮分離2類(lèi)漂浮分離3圖螨類(lèi)漂浮分離法1.分離器的裝置2.將上層液體分開(kāi)3.上層液體的快速濾裝置（三）雜草種子檢驗(yàn)雜草種子的營(yíng)養(yǎng)器官與被危害寄主植物容易混淆，進(jìn)一步對(duì)繁殖器官性狀觀察時(shí)也難以區(qū)分，因此對(duì)其檢驗(yàn)必須具備植物分類(lèi)學(xué)基礎(chǔ)，熟悉植物系統(tǒng)演化知識(shí)。雜草種子的鑒定，可通過(guò)植物的外部形態(tài)性狀（如根、莖、葉、花、果實(shí)），按照植物分科的基本知識(shí)，將其分門(mén)別類(lèi)，然后再確定種類(lèi)。但是很多危害性雜草和檢疫雜草多為單子葉植物，有時(shí)在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期很難鑒別。因而主要通過(guò)果實(shí)和種子的形態(tài)來(lái)鑒定樣品。1.果實(shí)與種子外部形態(tài)鑒定過(guò)篩后檢取篩上物和篩下物中的雜草種子（果實(shí)），目測(cè)或借助解剖鏡觀察，根據(jù)其外觀形態(tài)特征，如形狀、大小、顏色、斑紋、種臍以及附屬物特征等利用檢索表進(jìn)行鑒定。應(yīng)充分注意地理環(huán)境、植物本身的遺傳變異和種子成熟度等因素對(duì)種子外部形態(tài)的影響。2.果實(shí)和種子的解剖鑒定通過(guò)外部形態(tài)難以鑒定的果實(shí)和種子，可采用解剖法，從其內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)區(qū)別鑒定。常采取下列兩種方法進(jìn)行鑒定。（1）一般解剖法解剖前先將種子浸泡在溫水中，待其吸水充分膨脹變軟后，可直接用解剖刀或刀片按種子的縱向或橫向切開(kāi)，置于雙目解剖鏡下（或放大鏡）觀察其內(nèi)部形態(tài)、結(jié)構(gòu)、顏色、胚乳的質(zhì)地和色澤以及胚的形狀、尺度、位置、顏色、子葉數(shù)目等特征，并參照工具書(shū)進(jìn)行比較鑒別。（2）顯微切片鑒定顯微切片比較復(fù)雜且費(fèi)時(shí)，僅在上述方法不能鑒別時(shí)采用。具體就是將種子全部或部分組織制成切片，然后在顯微鏡下進(jìn)行觀察鑒定。如豆科植物的種子，可根據(jù)其種皮結(jié)構(gòu)的不同（即構(gòu)成種皮的柵狀組織細(xì)胞大小、形狀等）來(lái)區(qū)別種與種之間的差異，作為鑒定依據(jù)。十字花科植物的種子，制成切片后，在顯微鏡下可以從表皮厚壁組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及其它各層細(xì)胞的性狀特征，鑒別出不同的種類(lèi)。①種皮的制備將種子先在溫水中浸30min，取出后，將全部或部分種皮取下，放入10％的硝酸溶液中浸1h，使其褪色，再將其移置于載玻片上，加一滴甘油，封上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察鑒定。②石蠟制片法將種子放入潮濕器皿內(nèi)一晝夜，使其軟化，取出后，用福爾馬林、醋酸、酒精固定液（即FAA固定液：70％乙醇100ml，濃福爾馬林5ml，冰醋酸5ml）固定過(guò)夜，用酒精進(jìn)行脫水，再進(jìn)行浸蠟、包埋。包埋后用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切片。完畢后，用毛筆將切片移置載玻片上，脫蠟，滴加甘油，蓋蓋玻片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察鑒定；也可以脫蠟染色觀察。如果沒(méi)有切片機(jī)時(shí)，可采用徒手切片法，即將已封好的石蠟塊，使用刀片切片。采用上述方法尚不能鑒定的，可進(jìn)行幼苗鑒定，檢查其萌發(fā)方式以及胚芽鞘、上胚軸、下胚軸、子葉和初生葉的形態(tài)。幼苗的氣味和分泌物有時(shí)也有重要鑒定價(jià)值。必要時(shí)，還可進(jìn)行種植觀察，觀察花果特征。四、植物病原真菌的檢疫檢驗(yàn)植物病原真菌的檢驗(yàn)，首先要采集一定數(shù)量癥狀典型的病害和寄主標(biāo)本，觀察病害癥狀特點(diǎn)及對(duì)寄主影響，用徒手切片或石蠟切片等方法，借助顯微鏡觀察病原真菌形態(tài)特征。并用組織分離法或孢子稀釋法分離致病真菌。必要時(shí)進(jìn)行生理生化測(cè)定及病原接種，進(jìn)行識(shí)別鑒定，并記載病原真菌特點(diǎn)、培養(yǎng)性狀。檢驗(yàn)方法有直接檢驗(yàn)、洗滌檢驗(yàn)、保濕萌芽檢驗(yàn)、分離培養(yǎng)檢驗(yàn)、種子分部透明檢驗(yàn)和生長(zhǎng)檢驗(yàn)等多種。（一）直接檢驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中常用作培養(yǎng)檢驗(yàn)之前的預(yù)備檢查。1.直觀檢驗(yàn)主要用于現(xiàn)場(chǎng)快速初檢。以肉眼或借助擴(kuò)大鏡、實(shí)體顯微鏡仔細(xì)觀察種子、苗木、果實(shí)等被檢物的癥狀。2.過(guò)篩檢驗(yàn)主要用于檢驗(yàn)糧谷、種子、油料、干果和中藥材，檢查其中混入的病粒、菌癭、菌核、病殘?bào)w、土壤等。具體方法：將制備的樣品，倒人規(guī)定孔徑和層數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)篩中過(guò)篩，檢查各層篩上物和篩下物是否含有病粒、菌癭、菌核、病殘?bào)w等。在檢驗(yàn)時(shí)，先將二層或三層標(biāo)準(zhǔn)篩按大孔徑在上的次序疊好，再將樣品倒入上層篩內(nèi)，用回旋法篩理。篩后，分別將第一層、第二層或第三層的篩上物，倒人白瓷盤(pán)內(nèi)，攤成薄層，用肉眼或10-15倍手持?jǐn)U大鏡檢查其中較大的病粒、病癥、雜草種子等；將篩底下物收集到黑底玻璃板或培養(yǎng)皿中，用雙筒解剖鏡檢查其中病原物，進(jìn)而進(jìn)行種類(lèi)鑒定。必要時(shí)，計(jì)算帶菌率。種子過(guò)篩檢出的菌癭、菌核、病株殘屑和土壤，均需仔細(xì)鑒別。如：小麥被印度腥黑穗菌侵染后，籽粒局部受害，生有黑色冬孢子堆，而普通腥黑穗病菌和矮腥黑穗病菌為害則使整個(gè)麥粒變成菌癭。形成菌核的真菌很多，常見(jiàn)的有麥角屬（Claviceps）、核盤(pán)菌屬（Sclerotinia）、小菌核屬（Sclerotium）、葡萄孢屬（Botrytis）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、輪枝孢屬（Verticillium）、核瑚菌屬（Typhula）及其它屬真菌。菌核可據(jù)形狀大小、色澤、內(nèi)部結(jié)構(gòu)等特征鑒別。3.比重檢驗(yàn)比重檢驗(yàn)一般用于檢驗(yàn)糧谷、種子、豆類(lèi)中的菌癭、菌核和病秕籽粒等。其原理在于菌癭、菌核、病秕粒，都比健康籽粒輕。若將其浸入一定濃度的食鹽水（糖、泥土等）或其它溶液中，就會(huì)浮于液面。撈取浮物，置于解剖鏡下進(jìn)行檢驗(yàn)，即可鑒定其種類(lèi)。（二）洗滌檢驗(yàn)主要用于檢測(cè)種子表面附著的真菌孢子，包括黑粉菌的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、銹菌的夏孢子以及多種半知菌的分生孢子等。具體操作程序如下：EQ\o\ac(○,1)洗脫孢子取一定數(shù)量的種子樣品，放入三角瓶或其它容器內(nèi)，注入1-2倍的蒸餾水或其它洗滌液（如加幾滴表面活性劑，可減少表面張力，使種子表面的病原物分離得更徹底），然后振蕩5-10min，洗脫種子表面的病菌孢子。一般光滑的種子可振蕩5min，粗糙的種子振蕩10min。EQ\o\ac(○,2)離心富集將孢子洗滌液移入離心管，以2500-3000r/min低速離心10-15min，使孢子沉集在離心管底部。EQ\o\ac(○,3)鏡檢計(jì)數(shù)棄去上清液，加入適量蒸餾水或其它浮載液，制成孢子懸浮液。取懸浮液，滴加在載玻片或血球計(jì)數(shù)板上，用高倍顯微鏡檢查孢子種類(lèi)并計(jì)數(shù)，估測(cè)種子帶菌量。具體方法如下：A視野推算法取一份樣品（約100?；?g），按上述步驟所得的沉淀物，用0.5ml蒸餾水懸浮后，用吸管吸取1滴懸浮液放在載玻片上。鏡檢至少觀察5個(gè)玻片，每個(gè)玻片上檢查10個(gè)視野的孢子數(shù)量，求出每個(gè)視野的平均孢子數(shù)。同時(shí)，算出每一視野的面積及整個(gè)蓋玻片的面積，以及全玻片的視野數(shù)。再以視野數(shù)乘以每一視野上平均孢子數(shù)，再乘以0.5ml水的滴數(shù)，即得100粒種子或5g樣品中的孢子總數(shù)，算出每粒種子或每克種子的帶菌量。B血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定法血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是在一塊玻片上，刻有許多小方格，每一小方格的面積為（0.05×0.05）mm2，其深度為0.1mm，故每一小方格的體積為0.05×0.05×0.1＝0.00025mm3，即（1/4000）×（1/1000）ml＝0.25×10-6ml。檢驗(yàn)時(shí)，用干凈的干吸管移取待測(cè)懸浮液，小心地注入計(jì)數(shù)板內(nèi)（注意液體不可溢出，蓋玻片下無(wú)氣泡）。然后將玻片置于顯微鏡下檢查。通常查80或100個(gè)小格（4或5大格）中的孢子數(shù)，求出每小格內(nèi)孢子數(shù)量平均值，再乘以4×106，即為1ml懸浮液中的孢子數(shù)，進(jìn)而換算得出原有懸浮液的孢子總含量，再除以洗液內(nèi)種子總粒數(shù)，即可獲得每粒種子上的孢子量。除視野推算法和血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定法外，還有培養(yǎng)皿計(jì)算法和渾濁度計(jì)數(shù)法等，可根據(jù)檢測(cè)對(duì)象和檢驗(yàn)要求選用。如鏡檢洗滌液時(shí)，沒(méi)有檢查到病菌孢子，則對(duì)同一樣品要重復(fù)幾次取樣洗滌，對(duì)每一洗滌液至少要鏡檢5張玻片。當(dāng)一個(gè)樣品兩次取樣，洗滌檢驗(yàn)的結(jié)果相差很大時(shí)，則需要重復(fù)一次。EQ\o\ac(○,4)孢子生活力測(cè)定用常規(guī)孢子萌發(fā)測(cè)定法、分離培養(yǎng)法或紅四氯唑（TTC）染色法判定孢子死活。洗滌檢驗(yàn)法能快速、簡(jiǎn)便地定量測(cè)定種子外部帶菌數(shù)量，現(xiàn)已用作檢驗(yàn)麥類(lèi)腥黑粉菌種子帶菌情況的標(biāo)準(zhǔn)方法，但不能用于檢測(cè)種子內(nèi)部的病原真菌。（三）保濕萌芽檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理在于多數(shù)種子攜帶的病菌，無(wú)論是黏附在種子表面，還是位于種子表層或深層組織中，在種子萌發(fā)階段，即開(kāi)始侵染為害。其中，很多在萌芽期或幼苗的早期，就表現(xiàn)癥狀，甚至在種子還未萌發(fā)時(shí)，表面就長(zhǎng)出病菌。對(duì)這類(lèi)病害，可采用保濕萌芽試驗(yàn)檢查種子帶菌情況，除了解種子的帶菌率外，還可測(cè)定種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意以下情況的干擾：（1）在對(duì)寄主生長(zhǎng)發(fā)育不良，而適宜于病菌生長(zhǎng)發(fā)育的條件下，某些腐生菌可能變成萌芽階段的寄生菌，造成幼芽發(fā)生部分病斑。（2）多種病害可以產(chǎn)生類(lèi)似的病癥，就是同一種病害也可發(fā)生不同的癥狀，這些情況都可以影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。（3）有些種子實(shí)際上帶菌，而萌發(fā)期或苗期不表現(xiàn)癥狀，或不長(zhǎng)出病菌孢子及其它可供鑒定特征的病害，則不能應(yīng)用此法。保濕萌芽檢驗(yàn)法因目的要求不同，一般可分為：保濕培養(yǎng)檢驗(yàn)、沙內(nèi)萌芽檢驗(yàn)、土內(nèi)萌芽檢驗(yàn)和試管幼苗癥狀測(cè)定檢驗(yàn)等。1.保濕培養(yǎng)檢驗(yàn)保濕培養(yǎng)檢驗(yàn)是一種國(guó)內(nèi)外最常用的方法，此法一般又分為：吸水紙法、冰凍吸水法和瓊脂平皿法等。（1）吸水紙法主要用于檢測(cè)在培養(yǎng)中能產(chǎn)生繁殖結(jié)構(gòu)的多種種傳半知菌，包括交鏈孢屬（Alternaria）、離蠕孢屬（Bipolaris）、葡萄孢屬（Botrytis）、尾孢屬（Cercospora）、芽枝孢屬（Cladosporium）、彎孢霉屬（Curvularia）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、德氏霉屬（Drechslera）、鐮刀菌屬（Fusarium）、捷氏霉屬（Gerlachia）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、喙孢霉屬（Rhynohosporium）、殼針孢屬（Septoria）、匍柄霉屬（Stemphylium）和輪枝孢屬（Verticillium）等。吸水紙法的標(biāo)準(zhǔn)操作：用三層無(wú)菌吸水紙吸足無(wú)菌水后，滴掉多余的水，放入經(jīng)消毒的培養(yǎng)皿或其它適用容器所作培養(yǎng)床內(nèi)，將種子排列在吸水紙上。各粒種子間要保持一定距離，一般不得少于1-1.5cm。再將培養(yǎng)皿置于適當(dāng)溫濕度的恒溫箱培養(yǎng)。對(duì)多數(shù)病原真菌，適宜的培養(yǎng)溫度為20-25℃。在培養(yǎng)期間，每天用近紫外光（NUV）燈或日光燈照明12h。培養(yǎng)時(shí)間因作物種子和病菌的不同而異，一般經(jīng)2-l0d培養(yǎng)，種子表面就會(huì)長(zhǎng)出病菌，最后用實(shí)體顯微鏡逐粒進(jìn)行鏡檢。本法依據(jù)種子上真菌菌落的整個(gè)形象，即“吸水紙鑒別特征”來(lái)區(qū)分真菌種類(lèi)。檢查時(shí)應(yīng)特別注意觀察種子上菌絲體的顏色、疏密程度、生長(zhǎng)特點(diǎn)、真菌繁殖結(jié)構(gòu)的類(lèi)型和特征，例如，分生孢子梗的形態(tài)、長(zhǎng)度、顏色和著生狀態(tài)，分生孢子的形狀、顏色、大小、分隔數(shù)，在梗上的著生特點(diǎn)等。在疑難情況下，需挑取孢子制片，用高倍鏡作精細(xì)的顯微檢查和計(jì)測(cè)。吸水紙培養(yǎng)檢驗(yàn)法簡(jiǎn)便、快速，可在較短時(shí)間內(nèi)檢查大量種子，是許多種傳半知菌檢驗(yàn)的適宜方法，但不能用于檢測(cè)在培養(yǎng)中不產(chǎn)生特征性繁殖體的種類(lèi)。另外，植物營(yíng)養(yǎng)器官的發(fā)病部位未產(chǎn)生真菌繁殖體時(shí)，常用吸水紙保濕培養(yǎng)誘導(dǎo)孢子產(chǎn)生，以確切地診斷鑒定。（2）冰凍吸水法屬于改進(jìn)的保濕培養(yǎng)法，即將種子排列在吸水紙上，在一定條件下使其萌芽。如一般谷物種子在10℃下保持3d即萌芽。然后，在20℃保持2-4d，再將幼苗在﹣20℃下，冰凍過(guò)夜，以死亡的幼苗作為培養(yǎng)基。在20℃的溫度下，用紫外光／黑暗交換處理12h，保持5-7d。為了防止細(xì)菌的污染，可在吸水紙上加些抗生素，如金霉素或土霉素等。該法優(yōu)點(diǎn)是有利于病原物形成孢子，同時(shí)又避免因種子萌芽伸長(zhǎng)后造成相互覆蓋，便于檢查。（3）瓊脂平皿法用1.5-1.7％瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，制成一定厚度的平面，代替吸水紙。其優(yōu)點(diǎn)為含水量均勻一致，有利于病原菌生長(zhǎng)，皿內(nèi)潔凈，雜菌少，便于檢查，因此常用于植物檢驗(yàn)檢疫。例如，對(duì)小麥矮腥黑穗病菌冬孢子萌發(fā)檢驗(yàn)：將待檢驗(yàn)的病粒孢子粉或孢子懸浮液，散落或涂抹在3％瓊脂培養(yǎng)基皿上，分別置于5℃有光照（自然光或日光燈）和17℃無(wú)光照兩種條件下培養(yǎng)。一星期左右，萌發(fā)的多是普通腥黑穗病菌。而在5℃、有散射光照的條件下，3星期至3個(gè)月才能萌發(fā)，則是矮腥黑穗病菌。此外，矮腥黑穗病菌孢子萌發(fā)后的形態(tài)與普通腥黑穗病菌也有明顯差異。2.沙土萌芽檢驗(yàn)可用普通的河沙進(jìn)行檢驗(yàn)，以通過(guò)1mm篩孔的沙粒最為適合。先將沙用清水洗去泥垢，再用沸水煮過(guò)，鋪在經(jīng)酒精或福爾馬林液消毒過(guò)的萌芽器內(nèi)，加冷開(kāi)水至含沙量的60％左右。沙面應(yīng)低于容器邊緣4cm，在鋪平的沙上排列種子，間隔一定距離。排好種子后，再加細(xì)沙覆蓋2-3cm，并加容器蓋，置于25℃的溫箱中。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)幼芽長(zhǎng)高碰到頂蓋時(shí)，即應(yīng)去蓋。經(jīng)過(guò)一定時(shí)期，將幼芽連根取出，并取出未發(fā)芽的種子，根據(jù)幼苗和未發(fā)芽種子所表現(xiàn)的癥狀及種苗上有無(wú)孢子，計(jì)算發(fā)芽率及發(fā)病率。3.土內(nèi)萌芽檢驗(yàn)將種子播在含有滅菌土壤的盆缽或播種箱內(nèi)，保持適宜的溫、濕度。待種子發(fā)芽出土后，進(jìn)行檢驗(yàn)，分析其發(fā)病情形。4.試管幼苗癥狀測(cè)定檢驗(yàn)取長(zhǎng)16cm，直徑為1.6cm的大型試管若干支，每管內(nèi)盛有1％熱的、透明的瓊脂培養(yǎng)基液體10ml。消毒過(guò)的管子保持大約60°的角度，待培養(yǎng)基完全凝固后，每管放入1粒種子，塞緊管口，再置于20℃下（或培養(yǎng)于對(duì)病原和寄主適合的其它溫度下），用人工光照和黑暗各半（12h）處理。當(dāng)幼苗達(dá)到管頂時(shí)，即可將管蓋取掉。培養(yǎng)期滿后，檢查幼苗癥狀。（四）分離培養(yǎng)檢驗(yàn)主要用于染病植株中病原真菌的常規(guī)分離培養(yǎng)，以獲得病原菌純化培養(yǎng)，進(jìn)行種類(lèi)鑒定，也適用于快速檢驗(yàn)生長(zhǎng)迅速且生成特定培養(yǎng)特征的種傳真菌。但對(duì)一些專(zhuān)性寄生菌，如白粉菌類(lèi)、銹菌類(lèi)等，目前還無(wú)法在人工培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)。因檢驗(yàn)?zāi)康牟煌?，常用的分離培養(yǎng)方法有四種。①分離潛伏于種子表層或深層的病菌時(shí)，可先將種子表面消毒，用滅菌水洗滌后，移植于培養(yǎng)基上，以檢查病菌種類(lèi)、菌落的類(lèi)型，同時(shí)觀察種子的萌芽率及其感病情況。②要確定病菌的潛伏部位時(shí)，可將種子表面消毒，經(jīng)滅菌水洗滌后，將種粒放在消毒過(guò)的培養(yǎng)皿內(nèi)，再用消毒過(guò)的解剖刀分割成不同部分，移植于培養(yǎng)基上，或是先將種子按不同部分分成小塊，表面消毒后，再進(jìn)行培養(yǎng)。③了解種子外部附著的菌群時(shí)，應(yīng)先用滅菌水洗滌。然后將洗液稀釋到一定程度，采取稀釋法培養(yǎng)。④在分離塊莖、塊根及苗木、接穗等繁殖材料所帶的病菌時(shí)，可先將病部用70％酒精或0.1％升汞（HgCl2）溶液表面消毒。用無(wú)菌水洗滌3-4次后，再挑取內(nèi)部組織塊進(jìn)行培養(yǎng)，或者切取病健相鄰部分的組織，進(jìn)行表面消毒和洗滌處理，然后再培養(yǎng)。不同的病原菌，其所用的培養(yǎng)基、分離方法、培養(yǎng)條件等不盡相同，必須因病制宜地加以使用。常用的瓊脂培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基（MEA）、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（OMA）等。在檢測(cè)特定種類(lèi)的病原真菌時(shí)，還可選用適宜的選擇性培養(yǎng)基。為便于檢測(cè)大量種子，多用手持放大鏡從培養(yǎng)皿兩面觀察，依據(jù)菌落形態(tài)、色澤來(lái)鑒別真菌種類(lèi)，必要時(shí)挑取培養(yǎng)物制片，用高倍顯微鏡檢查。從種子、苗木及其它繁殖材料上獲得的病菌，有時(shí)還需接種到植株上，使其表現(xiàn)典型癥狀后，再檢查鑒別。由于病原種類(lèi)與傳播方式不同，其接種的方法也各不相同，常用接種方法有下列幾種：①拌種接種用病菌孢子拌種，是接種黑粉?。ㄈ绨群谒氩。┳畛Ｓ玫姆椒?。接種時(shí)，將病菌孢子與種子混勻，再行播種，在作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，需隨時(shí)觀察發(fā)病情況。②浸種接種種子用真菌孢子懸浮液浸過(guò)后，倒入含有真菌孢子吸濕紙的培養(yǎng)器中，在20℃下培養(yǎng)24h，取出放在紙袋里，任其干燥后再播種。用這種方法播種，比拌種法發(fā)病率要高。③花期接種主要用于花期侵入的病菌。例如，大麥、小麥散黑穗病菌接種。在抽穗后1-2d，用冬孢子懸浮液注射或用干的冬孢子粉噴到花上。④整株噴霧接種將分離培養(yǎng)或洗滌離心過(guò)的真菌孢子懸浮液，用噴霧器噴灑至植株上，保濕24h。也可以重復(fù)處理3次后，再檢查發(fā)病情況。（五）種子分部透明檢驗(yàn)主要用于檢測(cè)大、小麥散黑穗病菌，谷類(lèi)與豆類(lèi)霜霉病菌等潛藏在種子內(nèi)部的真菌。先用化學(xué)方法或機(jī)械剝離方法分解種子，分別收集需要檢查的胚或種皮等部位，經(jīng)脫水和組織透明處理后，鏡檢菌絲體和卵孢子。以檢測(cè)大麥種子傳帶的散黑穗病菌為例，其操作過(guò)程如下：先將種子在加有錐蟲(chóng)藍(lán)的5％氫氧化鈉溶液中浸泡22h，然后用60-65℃的熱水沖擊或小心攪動(dòng)，使種胚分離，并用孔徑分別為3.5mm、2.0mm和1.0mm三層套篩收集種胚。種胚用95％乙醇脫水2min，再轉(zhuǎn)移到裝有乳酸酚和水（3:1）混合液的漏斗中，胚漂浮在上部，夾雜的種子殘屑沉在底部并通過(guò)連在漏斗下端的膠管排出。純凈的種胚用乳酸酚煮沸透明2min，冷卻后用實(shí)體顯微鏡檢查并計(jì)數(shù)含有散黑穗菌菌絲體的種胚，計(jì)算帶菌率。（六）生長(zhǎng)檢驗(yàn)主要用于植物繁殖材料的入境后隔離檢疫。供試材料種植在經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌處理或干熱滅菌的土壤、沙礫、石英砂或各種人工基質(zhì)中，在隔離場(chǎng)所和適宜條件下栽培，根據(jù)幼苗和成株的癥狀鑒定。檢測(cè)種子傳帶的真菌還可用試管幼苗癥狀檢驗(yàn)法，即在試管中水瓊脂培養(yǎng)基斜面上播種種子，在適宜條件下培養(yǎng)，根據(jù)幼苗癥狀，結(jié)合病原菌檢查，確定種傳真菌種類(lèi)。生長(zhǎng)檢驗(yàn)花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，使其應(yīng)用受到限制。五、植物病原細(xì)菌的檢驗(yàn)檢疫植物病原細(xì)菌檢驗(yàn)主要通過(guò)觀察寄主是否具典型細(xì)菌性病害的溢菌現(xiàn)象、是否有菌膿，并用顯微鏡檢查病組織，觀察病健交界處是否有大量細(xì)菌溢出，進(jìn)行初步確定。進(jìn)一步可采用稀釋分離法從病組織中分離培養(yǎng)病原細(xì)菌，并通過(guò)稀釋或劃線法獲得純培養(yǎng)菌株，用柯赫氏法則鑒定病原細(xì)菌的致病性，利用植物過(guò)敏反應(yīng)快速篩選致病性細(xì)菌，從接種植物病組織中再分離獲得細(xì)菌，并與原來(lái)病株上分離獲得的細(xì)菌比較。最后根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、大小特征、菌株生理生化特點(diǎn)、致病性等確定其種類(lèi)。在產(chǎn)地檢疫和現(xiàn)場(chǎng)檢疫中，根據(jù)植株、苗木、果實(shí)、塊莖、塊根等植物材料的特有癥狀和細(xì)菌溢檢查等可作出初步診斷，但在多數(shù)情況下仍需分離病原細(xì)菌作進(jìn)一步鑒定。種子帶菌檢驗(yàn)的方法也比較復(fù)雜，因帶菌率低，不可能逐粒分離培養(yǎng)，而以種子樣品為單位，檢查該樣品是否帶菌，并按特定的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，估計(jì)帶菌水平。常規(guī)種子帶菌檢驗(yàn)過(guò)程包括細(xì)菌的提取富集，分離純化以及種類(lèi)鑒定等三個(gè)步驟。病原細(xì)菌的分類(lèi)和鑒定包括檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征、染色反應(yīng)、生理生化反應(yīng)等一系列項(xiàng)目，所需時(shí)間長(zhǎng)。在檢疫中多應(yīng)用快速鑒定方法，包括致病性測(cè)定、過(guò)敏反應(yīng)測(cè)定、噬菌體測(cè)定和血清學(xué)鑒定等。噬菌體法和血清學(xué)法不需要復(fù)雜的設(shè)備，有時(shí)可直接使用種子粗提液測(cè)定，適用于檢驗(yàn)特定的目標(biāo)細(xì)菌。植物病原細(xì)菌的檢驗(yàn)方法，大致可分為直接檢驗(yàn)和間接檢驗(yàn)兩大類(lèi)。直接檢驗(yàn)是指在檢驗(yàn)病原細(xì)菌時(shí)，病原物不被提取或分離出來(lái)；間接檢驗(yàn)則指先把病原細(xì)菌提取、分離或殺滅后進(jìn)行檢驗(yàn)。因此，又可細(xì)分為活菌檢驗(yàn)和非活菌檢驗(yàn)。（一）直接檢驗(yàn)1.癥狀觀察植物細(xì)菌病害有軟腐、環(huán)腐、萎蔫、潰瘍、瘡痂、枝枯、葉斑、組織增生（癭瘤、髡根）等多種癥狀。葉片上病斑常呈水漬狀，上有細(xì)菌溢膿。病部切片鏡檢可見(jiàn)細(xì)菌溢。2.生長(zhǎng)檢驗(yàn)（1）實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)濕潤(rùn)吸水紙上或水瓊脂培養(yǎng)基平板檢驗(yàn)甘藍(lán)種子傳帶黑腐病菌（Xanthomonascampestrispv.campestris）的Srinivasan方法：用200mg/kg的金霉素浸種3-4h后，播種于培養(yǎng)皿內(nèi)的1.5％水瓊脂平板上，在20℃和黑暗條件下培養(yǎng)8d，用實(shí)體顯微鏡觀察幼芽和幼苗的癥狀。帶菌種子萌發(fā)后芽苗變褐色，畸形矮化，迅速腐爛，表面有細(xì)菌溢膿，子葉邊緣開(kāi)始形成“V”型褐色水漬狀病斑。（2）田間幼苗癥狀檢驗(yàn)隔離苗圃用于植物病原細(xì)菌鑒定和檢測(cè)的主要方法（DuncanJ.1992年基礎(chǔ)上改編）（仿朱西儒《植物檢疫學(xué)》,稍修改）鑒定和檢測(cè)方法測(cè)定所需時(shí)間①應(yīng)用于②大范圍應(yīng)用鑒定檢測(cè)病株或病種子檢測(cè)無(wú)癥感染組織免疫擴(kuò)散（Immunodiffusion）1-2d＋＋＋－－玻片凝集（Slideagglutination）5-10min＋＋－＋乳膠凝集（Latexagglutination）5-60min＋＋＋＋＋＋A蛋白共凝集（ProteinAagglutination）10-60min＋＋＋＋＋＋免疫熒光（Immunofluorescent,IF）2-3h＋＋＋＋＋＋＋免疫熒光吸附（Immunosorbent-IF）3-4h＋＋＋＋＋＋＋酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）4-12h＋＋＋＋＋＋＋＋免疫熒光菌落染色（IFcolonystaining）1-3h＋＋＋＋＋＋＋免疫放射試驗(yàn)（Immuno-radiometricassay,IRMA）4-8h＋＋＋＋＋＋免疫分離（Immunoisolation）2-3d－＋＋＋＋＋聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Ploymerasechainreaction,PCR）2-3h＋＋＋＋＋＋Biolog測(cè)定（Biologtest）4-24h＋＋－－＋＋脂肪酸分析（Fattyacidprofiles）3-4h＋＋－－＋＋蛋白質(zhì)分析（Proteinprofiles）6-48h＋＋－－＋營(yíng)養(yǎng)試劑盒（Nutritionalprofilekits）4-48h＋＋－－＋eq\o\ac(○,1)測(cè)定所需時(shí)間不包括分離和純化；eq\o\ac(○,2)＋＋為好用但有一定局限性；＋為應(yīng)用中有很大局限性；－為不能直接應(yīng)用。（二）分離培養(yǎng)法普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基或鑒別性培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化。在鑒別性培養(yǎng)基上，目標(biāo)細(xì)菌菌落必須有明確的鑒別特征。如，金氏B（KB）培養(yǎng)基檢測(cè)假單胞桿菌，菌落在紫外光照射下會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。選擇性培養(yǎng)基則促進(jìn)目標(biāo)菌生長(zhǎng)，而抑制其它微生物生長(zhǎng)。1.種傳細(xì)菌的提取浸種法；干磨法；濕磨法提取前注意選擇已病變的種子，以0.1％升汞水進(jìn)行表面消毒1-2min，用滅菌水洗滌，再將此種子放于70％酒精中浸幾分鐘，然后放入盛有滅菌水的三角瓶中搖蕩洗滌2-3次。2.塊莖、塊根細(xì)菌的分離在病健組織交界處割取較大的一塊組織，用0.1％升汞水消毒1min，然后用滅菌水沖洗3次，用滅過(guò)菌的刀挑取一小塊組織（約(0.5×0.5×l)mm3），放在預(yù)先準(zhǔn)備的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)的無(wú)菌水（約5ml）中充分磨碎、攪勻，然后用鉑圈取一環(huán)菌液，移入第二個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，攪勻。按此法順序移至第五個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中，從該皿中挑取菌液進(jìn)行劃線分離。用分離出的純化菌株進(jìn)行鏡檢或結(jié)合其它方法鑒定細(xì)菌種類(lèi)。（三）噬菌體檢驗(yàn)噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，能在活細(xì)菌細(xì)胞中寄生繁殖，破壞和裂解寄主細(xì)胞。1.增殖法加入已知的專(zhuān)化噬菌體，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)增殖，判斷是否存在相對(duì)應(yīng)的病原細(xì)菌。2.間接法測(cè)定種子是否存在目標(biāo)噬菌體，從而間接證明是否帶菌，此法較常用。（四）生理生化測(cè)定將培養(yǎng)的細(xì)菌接種于特定的培養(yǎng)基或檢測(cè)管，通過(guò)產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、顏色變化等反應(yīng)，或通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌的耐鹽性、好氧或厭氧性、對(duì)碳、氮等化合物的利用和分解能力等進(jìn)行鑒別。如梨火疫病菌Erwiniaamylovora(Bunill.)Winslowetal.屬兼性厭氧菌，在葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖和β-甲基葡萄糖苷、海藻糖中產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能利用木糖和鼠李糖，水解明膠，不水解酪蛋白，不還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚和二氧化碳。這些生理生化特性均可用于鑒定。Biolog細(xì)菌自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)是美國(guó)研制的一種專(zhuān)門(mén)用于細(xì)菌鑒定的專(zhuān)家系統(tǒng)，該系統(tǒng)將細(xì)菌生理、生化過(guò)程的檢測(cè)與先進(jìn)的計(jì)算機(jī)管理手段結(jié)合起來(lái)。應(yīng)用時(shí)只需將經(jīng)過(guò)純化后的病原細(xì)菌制成菌懸液，再接種到反應(yīng)板上，在4-24h便可得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。該系統(tǒng)的使用，在很大程度上簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定程序。目前應(yīng)用3.70數(shù)據(jù)庫(kù)軟件可鑒定567種革蘭氏陰性菌（G-）和256種革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）。（五）致病性測(cè)定致病性測(cè)定多用于驗(yàn)證分離菌的致病性以排除培養(yǎng)性狀與病原菌相近的腐生菌。（六）過(guò)敏性反應(yīng)測(cè)定煙草是最常用的測(cè)定植物。取新鮮培養(yǎng)的待測(cè)細(xì)菌，制成細(xì)菌懸液，用注射器接種。注射針頭由煙草葉片背面主脈附近插入表皮下，注入菌懸液。若為致病細(xì)菌，1-2d后，注射部位變?yōu)楹稚^(guò)敏性壞死斑塊，葉組織變薄變褐，具黑褐色邊緣。（七）血清學(xué)檢驗(yàn)最常用的血清學(xué)方法有免疫電泳和免疫電鏡、瓊脂雙擴(kuò)散、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法還有：瓊脂擴(kuò)散法、試管沉淀法、凝集反應(yīng)法、微量沉淀法等，因存在靈敏度低、消耗血清量大、檢測(cè)速度慢等缺點(diǎn)，已經(jīng)很少應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外用于植物病原細(xì)菌檢測(cè)的血清學(xué)方法中，應(yīng)用最普遍的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）和免疫熒光抗體法。1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的幾種常用檢測(cè)方法（仿朱西儒等,2004）名稱(chēng)用途試劑備注間接法篩選抗體；確定抗原決定簇純化的或半純化的抗原；第一抗體；用于與第一抗體結(jié)合的酶不需要酶標(biāo)的第一抗體直接競(jìng)爭(zhēng)法篩選抗原；檢測(cè)可溶性抗原純化或半純化的抗原；特異性抗原的酶—抗體復(fù)合物快速檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)抗原交叉反應(yīng)效果很好抗體夾心法篩選抗原；檢測(cè)可溶性抗原捕捉抗體；特異性抗原的酶—抗體復(fù)合物最靈敏的抗原測(cè)試方法；需大量的捕捉抗體雙抗體夾心法篩選抗體；確定抗原決定簇捕捉抗體；特異性抗原的酶—抗體復(fù)合物不需要純抗原；實(shí)驗(yàn)步驟較長(zhǎng)，有五步直接細(xì)胞法篩選抗原陽(yáng)性細(xì)胞；檢測(cè)細(xì)胞抗原的表達(dá)表達(dá)特異抗原的細(xì)胞；針對(duì)細(xì)胞抗原的酶—抗體復(fù)合物用于大量篩選的一種敏感方法；它對(duì)測(cè)試在混合的細(xì)胞群體中不同抗原不敏感間接細(xì)胞法篩選針對(duì)細(xì)胞抗原的抗體用于免疫的細(xì)胞；第一抗體；與第一抗體結(jié)合的酶結(jié)合物不能檢出對(duì)低表達(dá)量抗原的特異性抗體（1）直接酶聯(lián)法用特異性酶標(biāo)抗體球蛋白檢出樣品中的抗原。操作時(shí)先將待測(cè)抗原置于微量反應(yīng)板凹孔中培育，在吸附抗原后洗滌，保留吸附孔壁的抗原，隨后加入特異性酶標(biāo)記抗體，經(jīng)洗滌后保留與抗原相結(jié)合的酶標(biāo)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物，再加酶的底物形成有色產(chǎn)物，用肉眼定性判斷或用分光光度計(jì)定量測(cè)定。（2）間接酶聯(lián)法利用抗家兔或雞球蛋白的山羊抗體與酶結(jié)合制備的酶標(biāo)記抗體，只要制備出抗原的家兔特異抗血清，不需要再制備酶標(biāo)記抗體就可用以檢出抗原。國(guó)內(nèi)多用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記。操作時(shí)先將待測(cè)抗原吸附于微量反應(yīng)板孔壁上，培育一定時(shí)間后洗滌，加入特異性抗血清，經(jīng)培育和洗滌后再加入羊抗兔酶標(biāo)抗體，最后加入酶的底物，并及時(shí)觀察結(jié)果。（3）三抗體夾心酶聯(lián)分析（TAS-ELISA）該方法利用結(jié)合于酶聯(lián)板上的病毒多克隆抗體，去捕獲相關(guān)特異性病毒抗原，然后用小鼠單克隆抗體去檢測(cè)相應(yīng)病毒抗原。用抗某種動(dòng)物的抗體與酶結(jié)合物，去檢測(cè)單克隆抗體。如果兩種單克隆抗體是用不同種動(dòng)物制備的，也可以用單克隆抗體去捕獲抗原。檢測(cè)條件：底物、緩沖液、陰性及陽(yáng)性等對(duì)照孔的吸光值（OD值）應(yīng)該在產(chǎn)品質(zhì)量控制范圍內(nèi)；底物和緩沖液孔的OD值應(yīng)小于0.10，陽(yáng)性對(duì)照OD值和陰性對(duì)照OD值之比應(yīng)大于10；樣品OD值等于原始OD值減去底物OD平均值；樣品OD值大于或等于2倍陰性對(duì)照OD值，判為陽(yáng)性；樣品OD值小于2倍陰性對(duì)照OD值，判為陰性。（4）雙抗體酶聯(lián)夾心（DAS-ELISA）該方法是將抗病毒的抗體包被在酶聯(lián)板上，相應(yīng)病毒抗原和抗體結(jié)合后，用酶標(biāo)記的抗體和檢測(cè)的病毒相結(jié)合。酶標(biāo)結(jié)合的多少和樣品中病毒的濃度直接相關(guān)。多余的游離酶標(biāo)物被洗滌液沖洗掉后，結(jié)合的酶標(biāo)物在加入底物后，通過(guò)酶促反應(yīng)形成顏色反應(yīng)。顏色的深淺可用目測(cè)或酶聯(lián)儀進(jìn)行檢測(cè)。如果是定性鑒定，可以用目測(cè)法。如果是定量鑒定，則可以用酶聯(lián)儀檢測(cè)。如果所得OD值達(dá)到臨界判定位置，則可以進(jìn)行樣品濃度等重新設(shè)計(jì)，進(jìn)行生產(chǎn)檢測(cè)。注意事項(xiàng)同三抗體酶聯(lián)夾心法。（5）A蛋白酶聯(lián)分析（SPA-ELISA）A蛋白酶聯(lián)分析是一種常用的ELISA血清學(xué)檢測(cè)方法。其原理是以A蛋白替代了相應(yīng)的特異性病毒抗體。A蛋白是一種金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁蛋白，其分子量為42000道爾頓（1道爾頓=1.67×10-24g）。它是由6個(gè)不同的區(qū)域組成，其中5個(gè)區(qū)域可以和抗體IgG的Fc片段（免疫球蛋白上的可結(jié)晶片段）特異性地結(jié)合，并有連接抗體的抗原結(jié)合部位。此方法是將A蛋白包被在酶聯(lián)板上，被檢測(cè)的特異性病毒抗體IgG的Fc片段和A蛋白結(jié)合后捕獲病毒抗原，使檢測(cè)抗體和病毒結(jié)合。A蛋白和檢測(cè)抗體的Fc片段相連接后，再與酶結(jié)合。當(dāng)加入特異性底物后形成顯色反應(yīng)，通過(guò)目測(cè)或酶聯(lián)儀判定的顏色深淺，來(lái)確定病毒種類(lèi)或含量。（6）生物素放大免疫酶聯(lián)分析（biotin-avidinamplificationELISA，BA-ELISA）鑒于普通ELISA難于檢測(cè)極微量抗原和靈敏度不足，利用生物素既可聯(lián)結(jié)一系列大分子生物活性物質(zhì)，又可以被生物酶或多種材料進(jìn)行標(biāo)記的特性，產(chǎn)生了BA-ELISA。其特點(diǎn)是可以產(chǎn)生100-1000倍的多級(jí)放大效應(yīng)，從而增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性，縮短檢測(cè)時(shí)間。其基本做法是包被待檢測(cè)抗原病毒，分別加入特異性抗體、生物素化免疫球蛋白G（IgG）、抗生物素酶結(jié)合物后，加入反應(yīng)底物顯色，再進(jìn)行目測(cè)或OD值檢測(cè)，判定其陰陽(yáng)性。酶聯(lián)法已成功用于檢測(cè)包括種傳病毒在內(nèi)的多種病毒，靈敏度高，有些病毒的濃度低至0.1μg/ml也能被檢測(cè)出來(lái)，用種子提取液供測(cè)，效率高，可快速檢測(cè)大量種子。應(yīng)注意該法有高度的株系專(zhuān)化性，可能產(chǎn)生將某些病毒感染材料誤判為健康的情況。2.免疫熒光抗體法（Immunofluorescent，IF）熒光抗體測(cè)定是先將熒光染料（異硫氰酸熒光黃或羅丹明等）與抗體以化學(xué)方法結(jié)合起來(lái)，形成標(biāo)記抗體。當(dāng)與相應(yīng)的抗原反應(yīng)后，產(chǎn)生有熒光標(biāo)記的抗體—抗原復(fù)合物。熒光染料不影響抗體的免疫特性，但在熒光顯微鏡下，能觀察到黃綠色熒光。熒光的存在就表示抗原的存在。熒光抗體法有直接法和間接法兩種。直接法是將標(biāo)記的特異抗體直接與待查抗原產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)，從而測(cè)知抗原的存在。間接法是標(biāo)記的抗體與抗原之間結(jié)合有未標(biāo)記的抗體。國(guó)內(nèi)用間接法檢測(cè)玉米種子傳帶的玉米枯萎菌（Erwiniastewartii），該法先將種子提取液在載玻片上涂片，火焰固定后滴加目標(biāo)菌抗血清，在38℃下培養(yǎng)30min后，用磷酸緩沖液沖洗玻片，晾干后再滴加羊抗兔IgG熒光抗體（異硫氰酸熒光黃標(biāo)記的羊抗兔γ-球蛋白，用葡聚糖凝膠G-25過(guò)濾層析法除去游離熒光素制成），培育、沖洗、晾干后用熒光顯微鏡檢查。限制免疫熒光抗體測(cè)定靈敏度的主要因素，是抗血清的非專(zhuān)化性反應(yīng)，應(yīng)用單克隆抗體檢測(cè)，其靈敏度可達(dá)102-103cfu/m1。（八）免疫吸附分離法它結(jié)合血清學(xué)技術(shù)與平板分離技術(shù)，把目標(biāo)細(xì)菌從病組織中分離出來(lái)。常用的免疫吸附分離有：平皿免疫吸附評(píng)價(jià)測(cè)定法（petridishimmunosorptionevaluationtest）和免疫吸附稀釋培養(yǎng)法（immunosorbentdilutionplating，簡(jiǎn)稱(chēng)IDP）兩種。平皿免疫吸附評(píng)價(jià)測(cè)定法操作程序敘述如下：①用溶入丙酮的硝酸纖維素或指甲油包被L形玻棒；②用包被緩沖液（0.05mol/L碳酸緩沖液，pH9.6）稀釋抗血清，將包被有指甲油的玻棒放在抗血清中，27℃孵育1h或于4℃過(guò)夜。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照（正常血清和包被緩沖液）各1棒；③用RT緩沖液（NaCl：2.0g，KCl：0.05g，CaCl2：0.05g，NaHCO3：0.25g，KH2PO4：1.25g，吐溫20：1.00ml，蒸餾水：1000ml，PH7.4）淋洗玻棒3次，每次1min；④用RT緩沖液配置所測(cè)樣品懸浮液。在樣品液中，將包被有抗體的玻棒于27℃下孵育1h或4℃過(guò)夜，以吸附目標(biāo)細(xì)菌；⑤將玻棒垂直放置，在包被有抗體區(qū)域上方2cm處，用RT緩沖液輕輕滴洗玻棒；⑥將玻棒在預(yù)先凝好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面劃線，可適當(dāng)變換劃線壓力；⑦將培養(yǎng)皿置于適宜條件下，以便目標(biāo)細(xì)菌菌落的形成。平皿免疫吸附評(píng)價(jià)測(cè)定（petridishimmunosorptionevaluationtest仿VanVuurde，1990）A.用抗體包被樣本的測(cè)定點(diǎn)；B.用洗滌液洗后的測(cè)定點(diǎn)；C.所測(cè)樣本的孵育；D.經(jīng)洗滌后留下的免疫誘捕細(xì)菌；E.在45℃下加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂；F.免疫誘捕細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)六、植物病毒和植原體的檢驗(yàn)檢疫帶有病毒和植原體的植物種子、苗木和其它無(wú)性繁殖材料外觀很少表現(xiàn)特定的癥狀，難以直接檢驗(yàn)，通常要在隔離條件下種植，在生長(zhǎng)期間根據(jù)癥狀作出初步診斷，然后進(jìn)行常規(guī)的病毒鑒定，或者利用血清學(xué)方法檢驗(yàn)。也可以用種子、苗木、無(wú)性繁殖材料等作試材，利用血清學(xué)方法檢驗(yàn)。植物病毒的鑒定，一般可以通過(guò)病毒的生物學(xué)特性、物理性質(zhì)、癥狀學(xué)、形態(tài)學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)等方法進(jìn)行。（一）生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)1.直接檢驗(yàn)2.生長(zhǎng)檢驗(yàn)3.指示植物鑒定（二）血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)（三）物理方法檢測(cè)1.病毒形態(tài)的透射電鏡觀察2.熒光染色顯微檢驗(yàn)法（四）分子生物學(xué)檢測(cè)方法1.分子雜交檢測(cè)2.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)（PCR）（五）植原體的檢測(cè)植原體難以人工培養(yǎng)，不易提純，長(zhǎng)期以來(lái)主要依靠生物學(xué)測(cè)定、電鏡檢查、抗菌素實(shí)驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定，靈敏度和效率低。近十幾年來(lái)，顯微技術(shù)已由早期的組織染色法改進(jìn)為現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的DAPI（一種DNA專(zhuān)化染料：4，6-二脒基-二-苯基吲哚，與植原體DNA結(jié)合產(chǎn)生特異性