熒光光譜課件

生物物理學的內(nèi)容分子生物物理學（MolecularBiophysics)

生物物理儀器與技術(shù)(BiophysicalInstrumentationandTechniques)膜與細胞生物物理學(MembraneandCellBiophysics)理論生物物理學(TheoreticalBiophysics)

感官與神經(jīng)生物物理學(SensoryandNeuralBiophysics)自由基與電磁生物物理學生物物理學的內(nèi)容分子生物物理學（Molecular1熒光分光光度術(shù)Spectrophotofluorimetry熒光分光光度術(shù)Spectrophotofluorimetry2一、熒光的發(fā)現(xiàn)二、熒光與熒光光譜三、熒光光譜儀及主要譜參量四、熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點五、影響熒光測量的因素六、熒光技術(shù)在生物學、醫(yī)學研究中的應用熒光分光光度術(shù)一、熒光的發(fā)現(xiàn)熒光分光光度術(shù)3熒光光譜課件4夜明珠發(fā)光成因

1、礦物的發(fā)光性

礦物在外來的能量激發(fā)下，產(chǎn)生可見光的性質(zhì)稱為礦物的發(fā)光性。外來的能量有日光、紫外線、X射線、陰極射線、加熱、加壓、摩擦等。根據(jù)其發(fā)光的性質(zhì)不同，分為熒光和磷光二類。

2、礦物的發(fā)光機理

礦物的發(fā)光是礦物能量的一種轉(zhuǎn)換過程，物體受激發(fā)吸收能量而躍遷至激發(fā)態(tài)（非穩(wěn)定態(tài)）在反回到基態(tài)的過程中，以光的形式放出能量。

夜明珠發(fā)光成因

1、礦物的發(fā)光性

礦物在外來的能量激5一熒光的發(fā)現(xiàn)

1575：N.Monardes

LignumNephriticum1852：Stokes分光計

植物抽提液、礦物、夜明珠、葉綠素、奎寧借用螢石的（Fluospar）發(fā)光現(xiàn)象而推演，熒光Fluorescence1867年：GoppelsroderAL與桑色素的配合測定AL的含量1880：Liebeman

提出“熒光與化學結(jié)構(gòu)關(guān)系”的經(jīng)驗法則為熒光技術(shù)的開發(fā)應用拉開了序幕一熒光的發(fā)現(xiàn)1575：N.Monardes1856（一）熒光的產(chǎn)生（二）熒光光譜與吸收光譜二熒光與熒光光譜二熒光與熒光光譜7（一）熒光的產(chǎn)生1分子的能量狀態(tài)在光學分析中涉及的分子能量有：Eo=Ee+Ev+ErEe：價電子運動能,electronEv：原子在平衡位置附近的振動,vibrationEr：分子繞其重心的轉(zhuǎn)動能,rotation其中，Ee>Ev>Er（一）熒光的產(chǎn)生1分子的能量狀態(tài)在光學分析中涉及的分子8（一）熒光的產(chǎn)生2分子的能級EnergyLevels與躍遷Transition（一）熒光的產(chǎn)生2分子的能級EnergyLevels與9（二）熒光光譜與吸收光譜（二）熒光光譜與吸收光譜10熒光分光光度術(shù)：

又稱熒光光譜術(shù)，屬于光譜技術(shù)中的一種發(fā)射光譜術(shù)。其原理是電磁波和物質(zhì)作用后，物質(zhì)首先吸收電磁波的能量，然后再重新發(fā)射電磁波。激發(fā)波段在100-800nm之間，相當于紫外與可見光波段。熒光分光光度術(shù)：11（一）熒光光譜儀（二）熒光分光光度術(shù)中的參量三熒光光譜儀與主要參量（一）熒光光譜儀三熒光光譜儀與主要參量12（一）熒光光譜儀吸收光譜儀光路圖熒光光譜儀光路圖（一）熒光光譜儀吸收光譜儀光路圖熒光光譜儀光路圖13氫燈的能量分布氘燈的能量分布氙燈（紅線）和帶有玻璃外套的汞燈的能量分布1激發(fā)光源在紫外-可見光區(qū)，可供熒光激發(fā)用的光源很多包括：鎢燈，碘鎢燈，氫燈，氘燈，汞燈，氙燈等。主要根據(jù)光源穩(wěn)定性和強度選擇光源。氫燈的能量分布氘燈的能量分布氙燈（紅線）和帶有玻璃外套的汞燈14實踐中常不選用強光源：隨著光強的增加，會同時導致散射光和熱量的增多強光源照射，容易使樣品產(chǎn)生光化分解強光源需要的穩(wěn)壓穩(wěn)流裝置復雜而昂貴產(chǎn)生大量臭氧，損害健康實踐中常不選用強光源：隨著光強的增加，會同時導致散射光和熱量15對于光源要注意以下幾點:（1）正負極不要接錯。（2）拿燈時，不要碰窗口，以免手上的油污經(jīng)紫外照射后，難以清除。應及時用無水乙醇擦干凈。（3）燈有壽命，要節(jié)約使用。（4）啟動間隔一般要大于半小時，待燈冷卻后，在重新啟動。啟動后要預熱半小時。（5）不要用眼睛直視燈。對于光源要注意以下幾點:（1）正負極不要接錯。162樣品池在可見可用玻璃池，但紫外區(qū)一定要用石英池。（1）設(shè)置空白對照。

（2）清洗問題，關(guān)鍵是即時沖洗。自來水沖洗SDS浸泡雙蒸水沖洗濃硝酸處理雙蒸水沖洗2樣品池在可見可用玻璃池，但紫外區(qū)一定要用石英池。（1）設(shè)17（二）熒光分光光度術(shù)中的參量ex—Maximumexcitationwavelength

em,max—Maximumemissionwavelength（二）熒光分光光度術(shù)中的參量ex—Maximumexci18A熒光強度的定義：在一定激發(fā)波長(λex)作用下，發(fā)射的熒光強弱。

F=Ia

Ia=I0-I，I=I010-εcL

F=I0(1-10-εcL){當C很低時F=I0εcL，{當C較大時F=I0

B

=發(fā)射光子數(shù)/吸收光子數(shù)

2熒光強度（fluorescenceintensity,F,I）與量子產(chǎn)率（quantumyield,）（二）熒光分光光度術(shù)中的參量A熒光強度的定義：在一定激發(fā)波長(λex)作用下，發(fā)射的19熒光強度與濃度的關(guān)系熒光強度與濃度的關(guān)系20熒光偏振(fluorescencepolarization)（二）熒光分光光度術(shù)中的參量自然光部分偏振光偏振光熒光偏振(fluorescencepolarizatio21I//-II//+IP=I//-II//+2IA=熒光偏振度Fluorescencepolarization--p

熒光各向異性Fluorescenceanisotropy--AI//-II//+IP=I//-II//+2IA=熒22(1)熒光偏振度的物理意義：A：I//=I，P=0，自然光，熒光分子運動很快，取向隨機。（稀溶液）B：I//或I為0，P=±1偏振光，熒光分子運動很慢，取向有序。C：I//I0，0<P<1，生物大分子的熒光屬于這種情況。(1)熒光偏振度的物理意義：23(2)環(huán)境因素及分子運動對熒光偏振度的影響

A.溫度的影響：溶液粘度

A：溫度的影響溫度升高，P降低B：溶液粘度粘度升高，P升高C：分子的運動—轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)弛豫時間rotationalrelaxationtime—(2)環(huán)境因素及分子運動對熒光偏振度的影響A.溫度的影24（二）熒光分光光度術(shù)中的參量4熒光壽命（Fluorescenceliftime--）熒光衰減為原來激發(fā)時最大熒光強度的1/e所需要的時間I=I0e-kt,=1/k

分子所處的環(huán)境有無淬滅有無能量轉(zhuǎn)移有無分子間相互作用影響因素（二）熒光分光光度術(shù)中的參量4熒光壽命（Fluores255熒光探劑具有環(huán)狀共軛雙鍵即π電子系統(tǒng)量子產(chǎn)率隨環(huán)境變化，而且變化很大(3)能產(chǎn)生穩(wěn)定熒光的小分子藻膽蛋白phycobiliprotein綠色熒光蛋白GreenFluorescentProtein(4)與研究對象的特定基團共價結(jié)合或與蛋白質(zhì)非共價結(jié)合5熒光探劑26（5）熒光探針的應用分類測定細胞活性的熒光探針：活細胞探針和死細胞探針膜熒光探針：熒光基團標記的磷脂，陰離子膜探針，陽離子膜探針，其它非極性和雙親性膜探針。細胞器熒光探針：線粒體探針，溶酶體、酵母菌液泡和其它酸性細胞器的探針Ca2＋，

Mg2＋，Zn2＋，Na＋，K＋，Cl－等離子熒光探針pH熒光探針:近中性pH應用的探針，酸性，探針交聯(lián)物活性氧和一氧化氮探針信號轉(zhuǎn)導探針：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸結(jié)合蛋白探針入胞作用、受體和離子通道探針pH細胞形態(tài)和流體測量的熒光示蹤劑細胞骨架蛋白熒光探針（5）熒光探針的應用分類27四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點1天然熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（1）碳原子骨架：分子具有共軛雙鍵體系，大多含有芳香環(huán)或雜環(huán)任何有利于提高π電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高

熒光效率。例如：對苯基化，間苯基化等。

四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點1天然熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（28（2）分子的幾何排布：

具有剛性平面結(jié)構(gòu)

熒光素酚酞四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（2）分子的幾何排布：熒光素酚酞四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點29（4）取代基的位置：鄰位、對位—熒光增強，間位—熒光減弱（-CN基例外）(5)環(huán)境、溶劑、溫度及pH等均會影響分子結(jié)構(gòu)，從而影響熒光四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（3）取代基的類型：（1）加強熒光的基團：給電子取代基，-NH2,-NHR,-OH,-OR,-CN,-OCH3,-OC2H5（2）減弱熒光的基團：得電子取代基，-CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I（3）影響不明顯的基團：-R,-SO3H,-NH3（4）取代基的位置：四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（3）取代基的類302蛋白質(zhì)和核酸中的熒光生色團Tryptophan(W,Trp)Phenylalanine(F,Phe)Tyrosine(Y,Tyr)四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點2蛋白質(zhì)和核酸中的熒光生色團TryptophanPhen31生色團條件exnmmax10-3emnmFFns敏感度maxF10-2TrpH2O,pH72805.63480.22.611TyrH2O,pH72741.43030.13.61.4PheH2O,pH72570.22820.046.40.08Y-baseYeast-RNAPhe3201.34600.076.30.91亞硝基奈酚+Tyr茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Pheex:460nm,em:570nmex:365nm,em:515nm四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點生色團條件exmaxemFF敏感度maxF132

五影響熒光測量的因素1光化分解（photodissociation）光照后導致化學鍵斷裂——熒光減弱2淬滅(quenching)溫度淬滅：

溫度每升高10C，熒光減少的百分比，稱為溫度系數(shù)。在20-300C的范圍內(nèi)，溫度系數(shù)大約為1.5。濃度淬滅：21內(nèi)濾光效應（innerfiltereffect)(3)雜質(zhì)淬滅：3O2

1O2五影響熒光測量的因素1光化分解（photodissoci333溶液pH的影響利用一些物質(zhì)在不同pH值溶液中熒光強度和顏色的改變，可以判別各種滴定的終點。指示劑顏色變化pH范圍萘酚無色變黃綠8.2-10.3熒光素淺綠變綠4.0-5.0丫啶橙淺黃綠變黃8.0-10.03溶液pH的影響利用一些物質(zhì)在不同pH值溶液中熒光強度和顏344溶液極性的影響熒光物質(zhì)在非極性溶液中的發(fā)射峰位比其在極性溶液中的峰位向短波方向（或高頻方向）移動，即藍移，同時熒光強度前者也高于后者。DPH水溶液中膜中發(fā)射波長：440nm發(fā)射波長：430nm4溶液極性的影響熒光物質(zhì)在非極性溶液中的發(fā)射峰位比其在極355溶劑和化學試劑(1)溶劑選擇要適宜例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。(2)溶劑要純6熒光污染(1)涂活塞用的潤滑油以及橡皮塞和軟木塞(2)去污劑(3)微生物污染(4)濾紙5溶劑和化學試劑(1)溶劑選擇要適宜6熒光污染(1)36六熒光分光光度術(shù)的應用(一）.物質(zhì)的檢測1測量原理：稀溶液，F(xiàn)=I0εcL

2結(jié)構(gòu)特點：含有“芳香環(huán)”結(jié)構(gòu)3靈敏度：10-7~10-8g/ml六熒光分光光度術(shù)的應用(一）.物質(zhì)的檢測37檢測物質(zhì)激發(fā)波長nm發(fā)射波長nm維生素A345490維生素B2，pH7370565維生素B12，pH7275305維生素C4905303,4-苯并芘10-6g/ml3814035羥色胺，中性或弱酸性2953305羥色胺，鹽酸295550，330檢測物質(zhì)激發(fā)波長nm發(fā)射波長nm維生素A345490維生素B38研究生物大分子構(gòu)象

（二）蛋白質(zhì)的熒光分析1蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光研究生物大分子構(gòu)象（二）蛋白質(zhì)的熒光分析1蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒392蛋白質(zhì)的外源熒光2蛋白質(zhì)的外源熒光40（三）核酸的熒光分析１嘌呤及衍生物室溫，用紫外和可見光照射，中性水溶液中，均無熒光。酸性介質(zhì)中，腺嘌呤和鳥嘌呤有熒光。堿性介質(zhì)中，鳥嘌呤有熒光２嘧啶及衍生物游離的胸腺嘧啶有自發(fā)熒光，但量子產(chǎn)率極低Φ＝0.00153核酸的熒光標記（三）核酸的熒光分析１嘌呤及衍生物室溫，用紫外和可見光照射，41ProbesexemNoteEthidiumBromide545610非透膜，RNA,DNAPropidiumIodine530615PO-PRO-1iodine435455AcridineOrange490590透膜，RNA,DNAPyroninY545580Bisbenzimide345460透膜，DNAProbesexemNoteEthidiumBrom42（四）利用熒光技術(shù)檢測分子間結(jié)合程度1用熒光偏振變化檢測結(jié)合程度當一些小分子，如輔酶、輔基、半抗原等與特異蛋白質(zhì)反應時，改變其熒光特性（強度與偏振），通過這些參數(shù)的變化，可以了解他們結(jié)合時的信息。結(jié)合后的大分子馳豫時間長，熒光偏振就大。（四）利用熒光技術(shù)檢測分子間結(jié)合程度1用熒光偏振變化43用殺鼠靈滴定HSAScatchard圖r

=[L]

Ka(n-r)

[L]=[L0]–[LP]=[L0]–r[P0]λex=320nmλem=400nm2用熒光強度變化檢測結(jié)合程度用殺鼠靈滴定HSAScatchard圖r=[L]K44（五）大分子內(nèi)基團間或分子間距離的測定熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)（五）大分子內(nèi)基團間或分子間距離的測定熒光共振能量轉(zhuǎn)移(45熒光共振能量轉(zhuǎn)移的三個條件：供體和受體都能發(fā)光供體的發(fā)射譜和受體的激發(fā)譜必須有部分重疊供體和受體的距離必須小于100?熒光共振能量轉(zhuǎn)移的三個條件：供體和受體都能發(fā)光46Forster公式E=R06/(R6+R06)R0:臨界距離，E：轉(zhuǎn)移效率，R：基團間距離E=1-IDA/ID

IDA:受體存在時的熒光強度，ID：受體不存在時的熒光強度大分子內(nèi)基團間或分子間距離的測定Forster公式E=R06/(R6+R06)R0:臨471膜流動性DPH：P值小，流動性高2-AS，6-AS，9-AS，12-AS高2膜滲漏性羧基熒光素(selfquenching)3膜電位的測量Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+)

KO+：細胞外濃度，KI+：細胞內(nèi)濃度熒光探劑：花菁（cyanine)

K+載體：纈氨霉素：

（六）膜生物物理研究1膜流動性（六）膜生物物理研究484膜融合機理的研究方法一：利用能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象4膜融合機理的研究方法一：利用能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象49λIλI方法二：利用淬滅現(xiàn)象λIλI方法二：利用淬滅現(xiàn)象501/25膜成分擴散速度的測定熒光漂白恢復技術(shù)fluorescencerecoveryafterphotobleaching，F(xiàn)RAP1/25膜成分擴散速度的測定熒光漂白恢復技術(shù)51D：擴散系數(shù)，ω：光斑半徑，1/2：漂白后的熒光值恢復到穩(wěn)定值的一半所需時間，rD：與光斑形狀有關(guān)的一個常數(shù)。常用探劑：標記脂類——DiI標記蛋白——異硫氰熒光素（FITC），蕊香紅（rhodamine）D=ω241/2rDD：擴散系數(shù)，ω：光斑半徑，1/2：漂白后的熒光值恢復到52（七）熒光技術(shù)與其它技術(shù)的結(jié)合

1顯微熒光光度術(shù)對細胞內(nèi)的不同成分進行定性定位或定量2流式細胞術(shù)熒光，激光和計算機結(jié)合3激光掃描共聚焦顯微鏡FRAP4光鑷（opticaltweezers)（七）熒光技術(shù)與其它技術(shù)的結(jié)合1顯微熒光光度術(shù)53Fluo-3/Ca2+，AM,ex=506nm,em=526nmFluo-3/Ca2+，AM,54熒光光譜課件55思考題1熒光產(chǎn)生的機理是什么？2熒光技術(shù)研究的生物學樣品的主要參數(shù)有哪些？量子產(chǎn)率與熒光強度的區(qū)別及關(guān)系是什么？熒光偏振的意義是什么？3舉例說明熒光技術(shù)的應用？

思考題564.如果嬰幼兒體內(nèi)缺乏使苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼岬拿笗r，則苯丙氨酸的含量異常增大而患“苯丙酮尿癥”且易引起智力低下，所以，對嬰幼兒的該項體查極為重要，但是，由于血液蛋白質(zhì)中其它芳香氨基酸的影響而難以測出苯丙氨酸的含量，請用本課程所學內(nèi)容提出一個檢測方案。4.如果嬰幼兒體內(nèi)缺乏使苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼岬拿笗r，則苯丙氨57參考資料1.趙南明，周海夢，生物物理學，北京：高等教育出版社，海德堡：施普林格出版社，20002.林克椿，生物物理技術(shù)波譜技術(shù)及其在生物學中的應用，北京：高等教育出版社，19893.林克椿，吳本玠，醫(yī)學生物物理學，北京醫(yī)科大學。北京大學醫(yī)學出版社，20044.李楠，王鳳翔，周春喜，熒光探針應用技術(shù)，北京：軍事醫(yī)學科學出版社，19985.PattabhiVasantha,GauthamN.Biophysics,Pangbourne:AlphaScience,c2002.

參考資料1.趙南明，周海夢，生物物理學，北京：高等教育出版58生物物理學的內(nèi)容分子生物物理學（MolecularBiophysics)

生物物理儀器與技術(shù)(BiophysicalInstrumentationandTechniques)膜與細胞生物物理學(MembraneandCellBiophysics)理論生物物理學(TheoreticalBiophysics)

感官與神經(jīng)生物物理學(SensoryandNeuralBiophysics)自由基與電磁生物物理學生物物理學的內(nèi)容分子生物物理學（Molecular59熒光分光光度術(shù)Spectrophotofluorimetry熒光分光光度術(shù)Spectrophotofluorimetry60一、熒光的發(fā)現(xiàn)二、熒光與熒光光譜三、熒光光譜儀及主要譜參量四、熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點五、影響熒光測量的因素六、熒光技術(shù)在生物學、醫(yī)學研究中的應用熒光分光光度術(shù)一、熒光的發(fā)現(xiàn)熒光分光光度術(shù)61熒光光譜課件62夜明珠發(fā)光成因

1、礦物的發(fā)光性

礦物在外來的能量激發(fā)下，產(chǎn)生可見光的性質(zhì)稱為礦物的發(fā)光性。外來的能量有日光、紫外線、X射線、陰極射線、加熱、加壓、摩擦等。根據(jù)其發(fā)光的性質(zhì)不同，分為熒光和磷光二類。

2、礦物的發(fā)光機理

礦物的發(fā)光是礦物能量的一種轉(zhuǎn)換過程，物體受激發(fā)吸收能量而躍遷至激發(fā)態(tài)（非穩(wěn)定態(tài)）在反回到基態(tài)的過程中，以光的形式放出能量。

夜明珠發(fā)光成因

1、礦物的發(fā)光性

礦物在外來的能量激63一熒光的發(fā)現(xiàn)

1575：N.Monardes

LignumNephriticum1852：Stokes分光計

植物抽提液、礦物、夜明珠、葉綠素、奎寧借用螢石的（Fluospar）發(fā)光現(xiàn)象而推演，熒光Fluorescence1867年：GoppelsroderAL與桑色素的配合測定AL的含量1880：Liebeman

提出“熒光與化學結(jié)構(gòu)關(guān)系”的經(jīng)驗法則為熒光技術(shù)的開發(fā)應用拉開了序幕一熒光的發(fā)現(xiàn)1575：N.Monardes18564（一）熒光的產(chǎn)生（二）熒光光譜與吸收光譜二熒光與熒光光譜二熒光與熒光光譜65（一）熒光的產(chǎn)生1分子的能量狀態(tài)在光學分析中涉及的分子能量有：Eo=Ee+Ev+ErEe：價電子運動能,electronEv：原子在平衡位置附近的振動,vibrationEr：分子繞其重心的轉(zhuǎn)動能,rotation其中，Ee>Ev>Er（一）熒光的產(chǎn)生1分子的能量狀態(tài)在光學分析中涉及的分子66（一）熒光的產(chǎn)生2分子的能級EnergyLevels與躍遷Transition（一）熒光的產(chǎn)生2分子的能級EnergyLevels與67（二）熒光光譜與吸收光譜（二）熒光光譜與吸收光譜68熒光分光光度術(shù)：

又稱熒光光譜術(shù)，屬于光譜技術(shù)中的一種發(fā)射光譜術(shù)。其原理是電磁波和物質(zhì)作用后，物質(zhì)首先吸收電磁波的能量，然后再重新發(fā)射電磁波。激發(fā)波段在100-800nm之間，相當于紫外與可見光波段。熒光分光光度術(shù)：69（一）熒光光譜儀（二）熒光分光光度術(shù)中的參量三熒光光譜儀與主要參量（一）熒光光譜儀三熒光光譜儀與主要參量70（一）熒光光譜儀吸收光譜儀光路圖熒光光譜儀光路圖（一）熒光光譜儀吸收光譜儀光路圖熒光光譜儀光路圖71氫燈的能量分布氘燈的能量分布氙燈（紅線）和帶有玻璃外套的汞燈的能量分布1激發(fā)光源在紫外-可見光區(qū)，可供熒光激發(fā)用的光源很多包括：鎢燈，碘鎢燈，氫燈，氘燈，汞燈，氙燈等。主要根據(jù)光源穩(wěn)定性和強度選擇光源。氫燈的能量分布氘燈的能量分布氙燈（紅線）和帶有玻璃外套的汞燈72實踐中常不選用強光源：隨著光強的增加，會同時導致散射光和熱量的增多強光源照射，容易使樣品產(chǎn)生光化分解強光源需要的穩(wěn)壓穩(wěn)流裝置復雜而昂貴產(chǎn)生大量臭氧，損害健康實踐中常不選用強光源：隨著光強的增加，會同時導致散射光和熱量73對于光源要注意以下幾點:（1）正負極不要接錯。（2）拿燈時，不要碰窗口，以免手上的油污經(jīng)紫外照射后，難以清除。應及時用無水乙醇擦干凈。（3）燈有壽命，要節(jié)約使用。（4）啟動間隔一般要大于半小時，待燈冷卻后，在重新啟動。啟動后要預熱半小時。（5）不要用眼睛直視燈。對于光源要注意以下幾點:（1）正負極不要接錯。742樣品池在可見可用玻璃池，但紫外區(qū)一定要用石英池。（1）設(shè)置空白對照。

（2）清洗問題，關(guān)鍵是即時沖洗。自來水沖洗SDS浸泡雙蒸水沖洗濃硝酸處理雙蒸水沖洗2樣品池在可見可用玻璃池，但紫外區(qū)一定要用石英池。（1）設(shè)75（二）熒光分光光度術(shù)中的參量ex—Maximumexcitationwavelength

em,max—Maximumemissionwavelength（二）熒光分光光度術(shù)中的參量ex—Maximumexci76A熒光強度的定義：在一定激發(fā)波長(λex)作用下，發(fā)射的熒光強弱。

F=Ia

Ia=I0-I，I=I010-εcL

F=I0(1-10-εcL){當C很低時F=I0εcL，{當C較大時F=I0

B

=發(fā)射光子數(shù)/吸收光子數(shù)

2熒光強度（fluorescenceintensity,F,I）與量子產(chǎn)率（quantumyield,）（二）熒光分光光度術(shù)中的參量A熒光強度的定義：在一定激發(fā)波長(λex)作用下，發(fā)射的77熒光強度與濃度的關(guān)系熒光強度與濃度的關(guān)系78熒光偏振(fluorescencepolarization)（二）熒光分光光度術(shù)中的參量自然光部分偏振光偏振光熒光偏振(fluorescencepolarizatio79I//-II//+IP=I//-II//+2IA=熒光偏振度Fluorescencepolarization--p

熒光各向異性Fluorescenceanisotropy--AI//-II//+IP=I//-II//+2IA=熒80(1)熒光偏振度的物理意義：A：I//=I，P=0，自然光，熒光分子運動很快，取向隨機。（稀溶液）B：I//或I為0，P=±1偏振光，熒光分子運動很慢，取向有序。C：I//I0，0<P<1，生物大分子的熒光屬于這種情況。(1)熒光偏振度的物理意義：81(2)環(huán)境因素及分子運動對熒光偏振度的影響

A.溫度的影響：溶液粘度

A：溫度的影響溫度升高，P降低B：溶液粘度粘度升高，P升高C：分子的運動—轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)弛豫時間rotationalrelaxationtime—(2)環(huán)境因素及分子運動對熒光偏振度的影響A.溫度的影82（二）熒光分光光度術(shù)中的參量4熒光壽命（Fluorescenceliftime--）熒光衰減為原來激發(fā)時最大熒光強度的1/e所需要的時間I=I0e-kt,=1/k

分子所處的環(huán)境有無淬滅有無能量轉(zhuǎn)移有無分子間相互作用影響因素（二）熒光分光光度術(shù)中的參量4熒光壽命（Fluores835熒光探劑具有環(huán)狀共軛雙鍵即π電子系統(tǒng)量子產(chǎn)率隨環(huán)境變化，而且變化很大(3)能產(chǎn)生穩(wěn)定熒光的小分子藻膽蛋白phycobiliprotein綠色熒光蛋白GreenFluorescentProtein(4)與研究對象的特定基團共價結(jié)合或與蛋白質(zhì)非共價結(jié)合5熒光探劑84（5）熒光探針的應用分類測定細胞活性的熒光探針：活細胞探針和死細胞探針膜熒光探針：熒光基團標記的磷脂，陰離子膜探針，陽離子膜探針，其它非極性和雙親性膜探針。細胞器熒光探針：線粒體探針，溶酶體、酵母菌液泡和其它酸性細胞器的探針Ca2＋，

Mg2＋，Zn2＋，Na＋，K＋，Cl－等離子熒光探針pH熒光探針:近中性pH應用的探針，酸性，探針交聯(lián)物活性氧和一氧化氮探針信號轉(zhuǎn)導探針：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸結(jié)合蛋白探針入胞作用、受體和離子通道探針pH細胞形態(tài)和流體測量的熒光示蹤劑細胞骨架蛋白熒光探針（5）熒光探針的應用分類85四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點1天然熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（1）碳原子骨架：分子具有共軛雙鍵體系，大多含有芳香環(huán)或雜環(huán)任何有利于提高π電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高

熒光效率。例如：對苯基化，間苯基化等。

四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點1天然熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（86（2）分子的幾何排布：

具有剛性平面結(jié)構(gòu)

熒光素酚酞四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（2）分子的幾何排布：熒光素酚酞四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點87（4）取代基的位置：鄰位、對位—熒光增強，間位—熒光減弱（-CN基例外）(5)環(huán)境、溶劑、溫度及pH等均會影響分子結(jié)構(gòu)，從而影響熒光四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（3）取代基的類型：（1）加強熒光的基團：給電子取代基，-NH2,-NHR,-OH,-OR,-CN,-OCH3,-OC2H5（2）減弱熒光的基團：得電子取代基，-CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I（3）影響不明顯的基團：-R,-SO3H,-NH3（4）取代基的位置：四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點（3）取代基的類882蛋白質(zhì)和核酸中的熒光生色團Tryptophan(W,Trp)Phenylalanine(F,Phe)Tyrosine(Y,Tyr)四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點2蛋白質(zhì)和核酸中的熒光生色團TryptophanPhen89生色團條件exnmmax10-3emnmFFns敏感度maxF10-2TrpH2O,pH72805.63480.22.611TyrH2O,pH72741.43030.13.61.4PheH2O,pH72570.22820.046.40.08Y-baseYeast-RNAPhe3201.34600.076.30.91亞硝基奈酚+Tyr茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Pheex:460nm,em:570nmex:365nm,em:515nm四熒光生色團的結(jié)構(gòu)特點生色團條件exmaxemFF敏感度maxF190

五影響熒光測量的因素1光化分解（photodissociation）光照后導致化學鍵斷裂——熒光減弱2淬滅(quenching)溫度淬滅：

溫度每升高10C，熒光減少的百分比，稱為溫度系數(shù)。在20-300C的范圍內(nèi)，溫度系數(shù)大約為1.5。濃度淬滅：21內(nèi)濾光效應（innerfiltereffect)(3)雜質(zhì)淬滅：3O2

1O2五影響熒光測量的因素1光化分解（photodissoci913溶液pH的影響利用一些物質(zhì)在不同pH值溶液中熒光強度和顏色的改變，可以判別各種滴定的終點。指示劑顏色變化pH范圍萘酚無色變黃綠8.2-10.3熒光素淺綠變綠4.0-5.0丫啶橙淺黃綠變黃8.0-10.03溶液pH的影響利用一些物質(zhì)在不同pH值溶液中熒光強度和顏924溶液極性的影響熒光物質(zhì)在非極性溶液中的發(fā)射峰位比其在極性溶液中的峰位向短波方向（或高頻方向）移動，即藍移，同時熒光強度前者也高于后者。DPH水溶液中膜中發(fā)射波長：440nm發(fā)射波長：430nm4溶液極性的影響熒光物質(zhì)在非極性溶液中的發(fā)射峰位比其在極935溶劑和化學試劑(1)溶劑選擇要適宜例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。(2)溶劑要純6熒光污染(1)涂活塞用的潤滑油以及橡皮塞和軟木塞(2)去污劑(3)微生物污染(4)濾紙5溶劑和化學試劑(1)溶劑選擇要適宜6熒光污染(1)94六熒光分光光度術(shù)的應用(一）.物質(zhì)的檢測1測量原理：稀溶液，F(xiàn)=I0εcL

2結(jié)構(gòu)特點：含有“芳香環(huán)”結(jié)構(gòu)3靈敏度：10-7~10-8g/ml六熒光分光光度術(shù)的應用(一）.物質(zhì)的檢測95檢測物質(zhì)激發(fā)波長nm發(fā)射波長nm維生素A345490維生素B2，pH7370565維生素B12，pH7275305維生素C4905303,4-苯并芘10-6g/ml3814035羥色胺，中性或弱酸性2953305羥色胺，鹽酸295550，330檢測物質(zhì)激發(fā)波長nm發(fā)射波長nm維生素A345490維生素B96研究生物大分子構(gòu)象

（二）蛋白質(zhì)的熒光分析1蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光研究生物大分子構(gòu)象（二）蛋白質(zhì)的熒光分析1蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒972蛋白質(zhì)的外源熒光2蛋白質(zhì)的外源熒光98（三）核酸的熒光分析１嘌呤及衍生物室溫，用紫外和可見光照射，中性水溶液中，均無熒光。酸性介質(zhì)中，腺嘌呤和鳥嘌呤有熒光。堿性介質(zhì)中，鳥嘌呤有熒光２嘧啶及衍生物游離的胸腺嘧啶有自發(fā)熒光，但量子產(chǎn)率極低Φ＝0.00153核酸的熒光標記（三）核酸的熒光分析１嘌呤及衍生物室溫，用紫外和可見光照射，99ProbesexemNoteEthidiumBromide545610非透膜，RNA,DNAPropidiumIodine530615PO-PRO-1iodine435455AcridineOrange490590透膜，RNA,DNAPyroninY545580Bisbenzimide345460透膜，DNAProbesexemNoteEthidiumBrom100（四）利用熒光技術(shù)檢測分子間結(jié)合程度1用熒光偏振變化檢測結(jié)合程度當一些小分子，如輔酶、輔基、半抗原等與特異蛋白質(zhì)反應時，改變其熒光特性（強度與偏振），通過這些參數(shù)的變化，可以了解他們結(jié)合時的信息。結(jié)合后的大分子馳豫時間長，熒光偏振就大。（四）利用熒光技術(shù)檢測分子間結(jié)合程度1用熒光偏振變化101用殺鼠靈滴定HSAScatchard圖r

=[L]

Ka(n-r)

[L]=[L0]–[LP]=[L0]–r[P0]λex=320nmλem=400nm2用熒光強度變化檢測結(jié)合程度用殺鼠靈滴定HSAScatchard圖r=[L]K102（五）