基因的基本策略課件

從上世紀(jì)70年代以來，與DNA、RNA操作相關(guān)的各種分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，到目前已經(jīng)形成了一個(gè)龐大而復(fù)雜的技術(shù)體系?；虿僮饕殉蔀獒t(yī)學(xué)研究的重要手段。簡(jiǎn)單地說，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技術(shù)。本章主要討論如何對(duì)基因進(jìn)行定性、定量分析；在隨后的2章里分別介紹基因功能研究的技術(shù)和基因工程的有關(guān)內(nèi)容。第十一章基因分析的基本策略1、需要進(jìn)行基因的DNA序列分析:序列測(cè)定2、基因的染色體上定位：原位雜交技術(shù)3、研究基因在基因組中的拷貝數(shù)：SouthernBlot4、研究基因表達(dá)水平：NorthernBlot、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR技術(shù)5、研究基因表達(dá)產(chǎn)物的水平：WesternBlot、流式細(xì)胞儀（FACS）對(duì)一個(gè)已知或未知基因的內(nèi)容進(jìn)行研究步驟：第一節(jié)利用DNA定性、定量分析可從不同角度對(duì)基因和基因組進(jìn)行研究一、DNA序列測(cè)定可以揭示基因和基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)變化DNA測(cè)序技術(shù)：

1、雙脫氧鏈終止法(Sanger法)2、化學(xué)裂解法

3、PCR測(cè)序技術(shù)

4、全自動(dòng)DNA測(cè)序儀這些技術(shù)的發(fā)明,都依賴于高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)1968年華裔生物化學(xué)、生物學(xué)家吳瑞博士（Dr．RayWu）獨(dú)創(chuàng)性地設(shè)計(jì)出一種嶄新的引物一延伸測(cè)序策略，并于1971年首次成功地測(cè)定了λ噬菌體兩個(gè)COS末端的完整序列；1977，F(xiàn).Sanger在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了快速測(cè)定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采納他的方法，完善了PCR擴(kuò)增DNA的方法；M.Smith發(fā)明了堿基定點(diǎn)突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。引物—延伸測(cè)序策略Sanger雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑。

2ˊ,3ˊ-ddNTP脫氧核糖的3ˊ位缺少羥基，它可以與多核苷酸鏈的3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個(gè)核苷酸縮合，導(dǎo)致多核苷酸鏈的延伸終止。如果在DNA的合成反應(yīng)中，加入一種少量的ddNTP，則多核苷酸鏈的延伸將在隨機(jī)的位點(diǎn)終止，生成一系列長短不一的核苷酸鏈。在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個(gè)A，G，C，T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。雙脫氧測(cè)序方法原理反應(yīng)：同時(shí)加入引物和模板、DNA聚合酶I、一種ddNTP、以及四種dNTP（有一種帶放射性標(biāo)記）。變性膠電泳分離反應(yīng)混合物。放射自顯影術(shù)，檢測(cè)單鏈DNA片段的放射性。結(jié)果判讀，從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序。TheDNAsequencingmethoddevelopedbySanger.基本步驟驟：1、先將DNA的末端之之一標(biāo)記記放射性性同位素素（32P、35S）；2、再將DNA樣品分別別進(jìn)行多多組具堿堿基特異異性、隨隨機(jī)的、、不完全全的化學(xué)學(xué)修飾；；3、采用修修飾堿基基敏感的的特異化化學(xué)試劑劑在修飾飾堿基位位置斷開開DNA鏈；4、通過具具有可分分辨鏈長長短僅一一個(gè)核苷苷酸之差差的聚丙丙烯胺凝凝膠電泳泳，將DNA斷裂片段段按分子子大小分分離開；；5、根據(jù)放放射自顯顯影膠片片上顯示示的末端端標(biāo)記片片段分布布情況，，直接讀讀出DNA序列?；瘜W(xué)裂解解法（Maxam-Gilbert）1977反應(yīng)體系系堿堿基修飾飾堿堿基基修飾主主鏈斷斷裂斷斷裂點(diǎn)試劑反反應(yīng)試試劑劑G硫酸二甲甲酯鳥鳥嘌嘌呤甲基基化六六氫吡啶啶GG+A甲酸脫脫嘌呤作作用六六氫氫吡啶G/AC+T肼嘧嘧啶開開環(huán)六六氫吡吡啶C/TC肼（加鹽鹽）胞胞嘧啶開開環(huán)六六氫吡吡啶C在化學(xué)修修飾反應(yīng)應(yīng)中，通通過控制制反應(yīng)溫溫度和反反應(yīng)時(shí)間間，只有有一小部部分堿基基被修飾飾，隨后后進(jìn)行斷斷裂反應(yīng)應(yīng)也是定定量。5`-GATCACTACTG-3`5`*-GATCACTACTG-3`5`*G5`*GATCACTACTG5`*G5`*GA5`*GATCA5`*GATCACTA5`*GATCACTACTG5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACT5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTACGG+AC+TCGA/GC/TC5`*G5`*GA5`*GAT5`*GATC5`*GATCAC5`*GATCACTAC5`*GATCA5`*GATCACT5`*GATCACTA5`*GATCACTAC5`*GATCACTACT5`*GATCACTACTG硫酸酸二二甲甲酯酯甲酸酸肼肼（（加加鹽鹽））DNA自動(dòng)動(dòng)測(cè)測(cè)序序儀儀上述述兩兩種種方方法法都都不不適適應(yīng)應(yīng)大大規(guī)規(guī)模模DNA測(cè)定定需需要要。。存存在在操操作作步步驟驟繁繁瑣瑣、、效效率率低低、、速速度度慢慢的的缺缺點(diǎn)點(diǎn)，，特特別別是是讀讀結(jié)結(jié)果果的的讀讀片片過過程程。。1987年發(fā)發(fā)明明了了一一種種準(zhǔn)準(zhǔn)確確快快速速的的DNA測(cè)序序方方法法，，即即激激光光測(cè)測(cè)序序法法和和配配套套的的自自動(dòng)動(dòng)測(cè)測(cè)序序儀儀。。（（用用熒熒光光染染料料結(jié)結(jié)合合引引物物））。。隨隨后后又又發(fā)發(fā)明明了了終終止止標(biāo)標(biāo)記記系系統(tǒng)統(tǒng)法法。。1、揭揭示示基基因因和和基基因因組組一一級(jí)級(jí)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)變變化化在在醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)研研究究中中具具有有重重要要意意義義。。2、通通過過DNA序列列分分析析，，可可以以鑒鑒定定基基因因和和基基因因組組變變異異。。3、通通過過DNA序列列分分析析，，可可以以鑒鑒定定分分析析人人工工重重組組的的基基因因。。4、通通過過DNA序列列測(cè)測(cè)定定對(duì)對(duì)定定點(diǎn)點(diǎn)突突變變進(jìn)進(jìn)行行確確認(rèn)認(rèn)。。DNA序列列測(cè)測(cè)定定的的意意義義分析析基基因因拷拷貝貝數(shù)數(shù)變變化化一、、Southernblot檢測(cè)測(cè)基基因因拷拷貝貝數(shù)數(shù)變變化化Southernblot印跡跡雜雜交交是是指指DNA與DNA的雜交，將將電泳分離離的待測(cè)DNA片段轉(zhuǎn)印并并結(jié)合到一一定的固定定支持物上上，然后用用標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)待待測(cè)DNA的一種方法法。1975年英國愛丁丁堡大學(xué)的的Southern建立了該方方法，Southern印跡雜交由由此得名。。Southernblot步驟（1）待測(cè)核酸樣樣品的制備備：提取基因因組DNA，并用適當(dāng)當(dāng)?shù)南拗菩孕詢?nèi)切酶消消化水解基基因組DNA，成大小不不一的DNA片段。（2）待測(cè)DNA樣品的電泳泳分離。（3）凝膠中核酸酸的變性：DNA在制備與電電泳過程中中DNA片段始終保保持雙鏈結(jié)結(jié)構(gòu)。電泳泳結(jié)束后DNA變性并轉(zhuǎn)移移到適當(dāng)?shù)牡墓潭ㄖС殖治锷喜拍苣苓M(jìn)行Southernblot。變性通常用用堿變性法法。（4）Southern轉(zhuǎn)膜：將凝膠中中的DNA進(jìn)行堿變性性并將pH恢復(fù)中性后后，即可將將凝膠中DNA轉(zhuǎn)移到固定定支持物上上。固定支持物物：硝酸纖維維素（NC）膜、尼龍龍膜、化學(xué)學(xué)活化膜和和濾紙等。。轉(zhuǎn)移方法：毛吸管虹虹吸印跡法法、電轉(zhuǎn)印印跡法、真真空轉(zhuǎn)移法法。（5）已知序列列的DNA探針的制備備（6）Southern雜交：在將固定于于膜上的DNA片段與探針針進(jìn)行雜交交前，必須須先進(jìn)行一一個(gè)預(yù)雜交的過程。因因?yàn)槟軌蚪Y(jié)結(jié)合DNA的膜同樣可可以和探針針DNA結(jié)合，在進(jìn)進(jìn)行雜交實(shí)實(shí)驗(yàn)前，必必須將膜上上所有能與與DNA結(jié)合的位點(diǎn)點(diǎn)全部封閉閉。（7）雜交結(jié)果的的檢測(cè)：采用核素標(biāo)標(biāo)記的探針針或發(fā)光劑劑標(biāo)記的探探針進(jìn)行雜雜交時(shí)，在在雜交洗膜膜后，將濾濾膜和X線片裝入入暗盒，，感光后后，經(jīng)沖沖洗，在在X線片上可可見黑色色條帶。。提取DNA限制性內(nèi)內(nèi)切酶消消化瓊脂糖凝凝膠電泳泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜與DNA或RNA探針雜交放射自顯顯影DNA印跡雜交交（Southernblotting）檢測(cè)靶分分子為DNA,檢測(cè)靶分分子是否否含有目目的基因因1、對(duì)某種生生物體基基因組拷拷貝數(shù)研研究，需需要完整整提取出基因因組，并并需要適適當(dāng)?shù)南尴拗菩詢?nèi)內(nèi)切酶酶酶切；2、通常要要研究的的基因序序列是已已知的。。3、探針序列的的選擇和探針針信號(hào)的選擇擇。Southernblot檢測(cè)基因拷貝貝數(shù)注意事項(xiàng)項(xiàng)二、采用PCR技術(shù)也可以分分析基因拷貝貝數(shù)原理：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制是一個(gè)復(fù)復(fù)雜過程。參參與復(fù)制的有有多種因素。。PCR是在試管中進(jìn)進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，PCR原理與細(xì)胞內(nèi)內(nèi)DNA復(fù)制相似，但但反應(yīng)體系相相對(duì)簡(jiǎn)單。PCR反應(yīng)體系：耐熱的TaqDNA聚合酶、化學(xué)學(xué)合成的寡聚聚核苷酸引物物、4種dNTP、以及合適的的緩沖液體系系。PCR反應(yīng)的基本過過程：變性、、退火、延伸伸PCR技術(shù)對(duì)擴(kuò)增的的模板濃度雖雖然很低，擴(kuò)擴(kuò)增產(chǎn)量以一一個(gè)恒定的指指數(shù)率上升，，但經(jīng)過25至30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)量量會(huì)達(dá)到一個(gè)個(gè)平臺(tái)期，同同時(shí)PCR過程中，還會(huì)會(huì)出現(xiàn)“試管管效應(yīng)”，因因些對(duì)不同樣樣本量的比較較無法直接用用PCR技術(shù)來鑒定。。近年來，隨著著PCR技術(shù)的不斷改改進(jìn)，如差異異顯示PCR和實(shí)時(shí)PCR的發(fā)明，可以以用于基因拷拷貝數(shù)的分析析。根據(jù)PolyA序列起點(diǎn)前2個(gè)堿基除AA外只有12種可能性的特特征，設(shè)計(jì)合合成了12種下游引物，，稱3′-錨定引物；同時(shí)為擴(kuò)增出出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能能性的mRNA序列，在5′端又設(shè)計(jì)了20種10bp長的隨機(jī)引物物。這樣構(gòu)成的引引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出出20000條左右的DNA條帶，其中每每一條都代表表一種特定mRNA種，這一數(shù)字字大體涵蓋了了在一定發(fā)育育階段某種細(xì)細(xì)胞類型中所所表達(dá)的全部部mRNA。（1）差異顯示PCR用于基因拷貝貝數(shù)分析將差別表達(dá)條條帶中的DNA回收，擴(kuò)增至至所需含量，，進(jìn)行Southernblot或Northernblot或直接測(cè)序，，從而對(duì)差異異條帶鑒定分分析，以便最最終獲得差異異表達(dá)的目的的基因。差異顯示PCR方法仍然存在在幾個(gè)難以解解決的問題：：(1)重復(fù)率低，至至少有20%的差異條帶不不能被準(zhǔn)確重重復(fù)；(2)假陽性率可以以高達(dá)90%；(3)獲得的差異異表達(dá)序列列極少包含含編碼信息息。（2）代表性差差異分析技技術(shù)該技術(shù)是將將差減雜交交與PCR有機(jī)結(jié)合形形成的一種種方法.主要步驟:1、將對(duì)照組組(driver)和待測(cè)組(tester)mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段群,接上接頭進(jìn)進(jìn)行第一次次PCR擴(kuò)增;2、將兩組PCR產(chǎn)物片段群群用限制性內(nèi)切切酶酶切,形成平均長長度256bp的長度；3、將接頭消消化,在tester組末端接上上新的接頭頭,tester組和driver組按1:100比例混合，，過量的driver可與tester中互補(bǔ)的部部分形成雙雙鏈；4、復(fù)復(fù)性性,按新新接接頭頭序序列列設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)引引物物進(jìn)進(jìn)行行第第2輪PCR，只只有有tester和tester雜合合體體才才能能和和引引物物配配對(duì)對(duì),大量量擴(kuò)擴(kuò)增增；；實(shí)時(shí)時(shí)PCR根據(jù)據(jù)PCR反應(yīng)應(yīng)動(dòng)動(dòng)力力學(xué)學(xué)特特點(diǎn)點(diǎn)設(shè)設(shè)計(jì)計(jì)的的分分析析方方法法。。在在PCR反應(yīng)應(yīng)的的初初始始階階段段，，反反應(yīng)應(yīng)體體系系中中的的模模板板的的產(chǎn)產(chǎn)物物濃濃度度較較低低，，而而引引物物是是過過量量的的，，產(chǎn)產(chǎn)物物和和模模板板復(fù)復(fù)性性不不會(huì)會(huì)形形成成與與引引物物競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)，，此此時(shí)時(shí)產(chǎn)產(chǎn)物物含含量量呈呈指指數(shù)數(shù)增增加加。。當(dāng)PCR產(chǎn)物物積積累累后后，，產(chǎn)產(chǎn)物物的的復(fù)復(fù)性性可可以以競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)引引物物與與模模板板的的結(jié)結(jié)合合，，產(chǎn)產(chǎn)物物增增加加減減慢慢，，最最后后進(jìn)進(jìn)入入平平臺(tái)臺(tái)期期。。所所以以對(duì)對(duì)樣樣品品中中的的cDNA進(jìn)行行定定量量分分析析的的最最佳佳時(shí)時(shí)期期是是反反應(yīng)應(yīng)早早期期。。（3）實(shí)實(shí)時(shí)時(shí)PCR用于于基基因因拷拷貝貝數(shù)數(shù)分分析析實(shí)時(shí)PCR原理是是：在在PCR反應(yīng)體體系中中加入入一種種雙色色熒光光標(biāo)記記的寡寡核苷苷酸探探針，，并根根據(jù)探探針上上熒光光信號(hào)號(hào)的變變化計(jì)計(jì)算模模板DNA含量。。如：：TaqMan系統(tǒng)。。在寡核核苷酸酸探針針的5`端標(biāo)記記一個(gè)個(gè)報(bào)告告熒光光染料料，3`端標(biāo)記記一個(gè)個(gè)猝滅滅染料料。當(dāng)光光源照照射到到探針針時(shí)，，被激激活的的報(bào)告告熒光光染料料將能能量轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移給給附近近的猝猝滅染染料而而不發(fā)發(fā)光。。當(dāng)PCR產(chǎn)物擴(kuò)擴(kuò)增時(shí)時(shí)，聚聚合酶酶遇到到結(jié)合合在模模板上上的熒熒光探探針時(shí)時(shí)，利利用聚聚合酶酶所具具有的的5`-3`外切酶酶作用用，將將兩種種染料料分離離，因因此根根據(jù)報(bào)報(bào)告熒熒光所所發(fā)射射的熒熒光強(qiáng)強(qiáng)度與與被切切探針針成正正比，，由此此可以以計(jì)算算出PCR產(chǎn)物的的含量量。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)特特別適適合于于低拷拷貝基基因的的定量量。實(shí)時(shí)PCR需要包包括熱熱循環(huán)環(huán)儀、、計(jì)算算機(jī)、、光學(xué)學(xué)儀器器用于于熒光光激發(fā)發(fā)和收收集器器、數(shù)數(shù)據(jù)處處理和和分析析軟件件。ROMA分析基因拷拷貝數(shù)ROMA（代表性寡寡核苷酸陣陣列分析））：是將RDA與芯片微距距陣分析技技術(shù)相結(jié)合合。利用人類基基因組序列列預(yù)測(cè)并設(shè)設(shè)計(jì)了能與與代表性片片段雜交的的寡核苷酸酸探針，制制成芯片，，然后與RDA篩選出來的的代表性差差異PCR產(chǎn)物在芯片片上進(jìn)行雜雜交，用計(jì)計(jì)算機(jī)分析析雜交結(jié)果果。核酸保持在在細(xì)胞或組組織切片中中，經(jīng)適當(dāng)當(dāng)方法處理理細(xì)胞或組組織后，將將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織織中的核酸酸進(jìn)行雜交，，稱為原位雜交。原位雜交不不需要從組組織提取核核酸，對(duì)組組織中含量量極低的靶靶序列有很高的靈敏敏度，并可完整保持組組織與細(xì)胞胞形態(tài)，更能準(zhǔn)確確反映出組組織細(xì)胞的的相互關(guān)系系及功能狀狀態(tài)。三、原位雜雜交技術(shù)可可以分析基基因在染色色體上位置置根據(jù)檢測(cè)對(duì)對(duì)象不同可可將原位雜雜交分為細(xì)胞內(nèi)原位位雜交和組織切片原原位雜交。同時(shí)原位位雜交既可可檢測(cè)DNA，也可檢測(cè)測(cè)RNA，所用探針針不同而已已。核酸探針根根據(jù)標(biāo)記方方法的不同同可粗略分分為放射性探針針和非放射性探探針兩類。放射射性同位素標(biāo)記記探針具有有放射性既既污染環(huán)境境，又對(duì)人人體有害，，且受半衰衰期限制等等缺點(diǎn)，非放射性探探針可以用用生物素、、地高辛、、熒光素素標(biāo)記探針針。（一）固定：保持細(xì)胞胞結(jié)構(gòu)，最最大限度地地保持細(xì)胞胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使使探針易于于進(jìn)入細(xì)胞胞或組織。。最常用的的固定劑是是多聚甲醛醛，其它的的固定劑（（如戊二醛醛）。（二二））玻片片和和組組織織切切片片的的處處理理：包包括括玻玻片片處處理理、、細(xì)細(xì)胞胞組組織織切切片片的的處處理理、、降降低低背背景景、、預(yù)預(yù)雜雜交交。。（三）雜交：調(diào)整探針的的濃度（0.5～5.0ng/μl）、探針長長度（50～100個(gè)堿基）、雜雜交的溫度和和時(shí)間?；痉椒ǎㄋ模╇s交后處理：包括系列不不同濃度，不不同溫度的鹽鹽溶液的漂洗洗。（五）顯示：根據(jù)核酸探探針標(biāo)記物的的種類分別進(jìn)進(jìn)行放射自顯顯影或利用酶酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)進(jìn)行不同顯色色處理。（六）結(jié)果分分析真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上上述RNA研究中，以mRNA研究最為熱點(diǎn)點(diǎn)。它的研究究可以提示基基因的結(jié)構(gòu)、、基因的活性性、或基因的的變異等。mRNA研究常用的方方法有Northernblot、原位雜交、實(shí)時(shí)PCR、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)、cDNA芯片技術(shù)和RT-PCR。第二節(jié)利用RNA定性定量分析析可從不同角度揭揭示基因表達(dá)達(dá)活性Northernblot印跡雜交是指指待測(cè)RNA樣品經(jīng)電泳分分離后轉(zhuǎn)移到到固定支持物物上，然后與與標(biāo)記的核酸酸探針進(jìn)行固固-液相雜交。原原理同Southernblot。但因因Northernblot印跡雜交交法檢測(cè)測(cè)的是RNA，在外界界環(huán)境中中極易被被環(huán)境中中的RNA酶所降解解，因此此制備RNA樣品時(shí)，，所需器器皿均需需要特殊殊處理。。同時(shí)作作為監(jiān)測(cè)測(cè)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)RNA含量不夠夠準(zhǔn)確，，只能作作為定性分析析RNA方法。（一）Northernblot定性分析析RNART-PCR是一種以以mRNA為模板的的體外擴(kuò)擴(kuò)增cDNA的技術(shù)。。其基本本程序是是：提取取細(xì)胞總總RNA，然后將將其中的的mRNA在體外逆逆轉(zhuǎn)錄成成cDNA，再以cDNA為模板，，進(jìn)行特特定基因因的PCR擴(kuò)增。因因?yàn)镻CR擴(kuò)增產(chǎn)物物有平臺(tái)效應(yīng)應(yīng)，故RT-PCR也一般用于于RNA的定性分分析。將陽性參參照基因因作為內(nèi)內(nèi)參照與與待測(cè)RNA在一個(gè)反反應(yīng)體系系中進(jìn)行行擴(kuò)增，，可以對(duì)對(duì)RNA進(jìn)行相對(duì)定量量分析。參照基基因：β-肌動(dòng)蛋白白（β-actin）、3-磷酸甘油油醛脫氫氫酶、rRNA基因等。。（二）RT-PCR用于定性性、定量量分析RNA三、RNA酶保護(hù)試試驗(yàn)—了解基因因轉(zhuǎn)錄后后的選擇擇性剪接接RNA酶保護(hù)試試驗(yàn)：可用于于①mRNA定量、②②mRNA末端定位位、③③mRNA剪切部位位④確定定內(nèi)含子子在相應(yīng)應(yīng)基因中中的位置置。RNA酶保護(hù)試試驗(yàn)：全全新的mRNA定量分析析方法其基本原原理是將將標(biāo)記的的特異RNA探針（32P或生物素素）與待待測(cè)的RNA樣品液相相雜交，，標(biāo)記的的特異RNA探針按堿堿基互補(bǔ)補(bǔ)的原則則與目的的基因特特異性結(jié)結(jié)合，形形成雙鏈鏈RNA；未結(jié)合的單鏈鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核核糖核酸，而而待測(cè)目的基基因與特異RNA探針結(jié)合后形形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故故該方法命名名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。。RPA有NorthernBlot無法比擬的優(yōu)優(yōu)勢(shì)：1.探針與目的基基因的雜交在在液相環(huán)境完完成，反應(yīng)更更加完全。2.RPA比NorthernBlot靈敏15－150倍。3.RPA通量高，同時(shí)時(shí)檢測(cè)多個(gè)基基因，可評(píng)價(jià)價(jià)他們?cè)谕灰磺闆r下的差差異表達(dá)。4.一次RPA就能完成10多次NorthernBlot的工作，加快快研究速度。。監(jiān)測(cè)大量基因因表達(dá)的最好好方法之一是是cDNA微陣列技術(shù)，，利用這種技技術(shù)可以同時(shí)時(shí)測(cè)定成千上上萬個(gè)基因的的轉(zhuǎn)錄活性。?；驹恚簯?yīng)應(yīng)用已知核酸酸序列作為探探針與互補(bǔ)的的靶核酸序列列雜交，通過過隨后的信號(hào)號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定定性或定量分分析基因的表表達(dá)情況。特點(diǎn)：能在同同一時(shí)間內(nèi)平平行分析大量量的基因轉(zhuǎn)錄錄產(chǎn)物，進(jìn)行行大量的信息息篩選和檢測(cè)測(cè)分析。三、cDNA微陣列（cDNA芯片）可同時(shí)分析大大量基因因的轉(zhuǎn)錄活活性研究蛋白質(zhì)質(zhì)的技術(shù)一一般多采用用免疫印記記技術(shù)（Westernblot）或免疫組組化染色對(duì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)進(jìn)行分析。。目前在1、研究轉(zhuǎn)基基因的活性性。2、研究克隆隆基因的表表達(dá)。上必必須選用蛋蛋白質(zhì)技術(shù)術(shù)對(duì)基因的的表達(dá)活性性進(jìn)行分析析。第三節(jié)利利用蛋白質(zhì)質(zhì)的定性定定量定位分析揭示基基因的表達(dá)達(dá)活性Westernblot是一種免疫疫印記技術(shù)術(shù)，其基本本原理與核核酸分子雜雜交相似，，以偶聯(lián)標(biāo)標(biāo)記記物物的的抗抗體體分分子子作為為探探針針，，檢檢測(cè)測(cè)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移到到固固相相支支持持物物上上的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)分分子子。?；颈具^過程程：蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)樣樣品品制制備備和和SDS分離離；；蛋白白質(zhì)質(zhì)的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜膜；；標(biāo)記記的的抗抗體體與與膜膜上上蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的抗抗原原抗抗體體雜雜交交；；檢測(cè)測(cè)并并分分析析標(biāo)標(biāo)記記物物信信號(hào)號(hào)。。（一一））Westernblot可對(duì)對(duì)細(xì)細(xì)胞胞總總蛋蛋白白中中的的特定定基基因因產(chǎn)產(chǎn)物物進(jìn)進(jìn)行行鑒鑒定定流式式細(xì)細(xì)胞胞術(shù)術(shù)也也稱稱為為熒熒光光激激活活細(xì)細(xì)胞胞分分揀揀技技術(shù)術(shù)。。是是一一種種快快速速定定量量分分析析細(xì)細(xì)胞胞的的新新技技術(shù)術(shù)。。其基基本本原原理理也也是是抗抗原原抗抗體體的的特特異異結(jié)結(jié)合合，，但但抗抗原原一一般般位位于于活活細(xì)細(xì)胞胞表表面面或或內(nèi)內(nèi)部部的的蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)分分子子，，用用熒熒光光標(biāo)標(biāo)記記的的抗抗體體與與抗抗原原結(jié)結(jié)合合，，經(jīng)經(jīng)過過流流式式細(xì)細(xì)胞胞儀儀分分析析熒熒光光信信號(hào)號(hào)，，從從而而根根據(jù)據(jù)其其信信號(hào)號(hào)的的強(qiáng)強(qiáng)弱弱，，來來判判斷斷細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)某某基基因因的的表表達(dá)達(dá)活活性性。。對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)細(xì)胞的外外源基因因表達(dá)情情況也可可以采用用此法。。二、流式式細(xì)胞術(shù)術(shù)可在細(xì)細(xì)胞水平平上分析特定定蛋白質(zhì)質(zhì)CD133和抑制性性協(xié)同刺刺激分子子B7-H4,PD-L1在NSCLC患者胸水水單個(gè)核核細(xì)胞中中的表達(dá)達(dá)Figure3-1ExpressionofCD133andB7-H4,PD-L1inmononuclearcellsofpleuralfluidfromNSCLC免疫組化化其基本本原理是是利用顯顯色劑標(biāo)標(biāo)記的特特異抗體體在組織織或細(xì)胞胞原位通通過抗原原抗體反反應(yīng)和組組織化學(xué)學(xué)顯色反反應(yīng)檢測(cè)測(cè)特定抗抗原。免疫組化化將免疫疫反應(yīng)的的特異性、組織化化學(xué)的可見性和顯微鏡鏡的顯像和放放大作用用巧妙地結(jié)結(jié)合起來來，成為為蛋白質(zhì)質(zhì)水平分分析基因因的直觀觀特異的的方法之之一。（三）免免疫組化化方法可可對(duì)細(xì)胞胞內(nèi)或組組織中的的特定基因因表達(dá)產(chǎn)產(chǎn)物進(jìn)行行定性和和半定量量分析9、靜靜夜夜四四無無鄰鄰，，荒荒居居舊舊業(yè)業(yè)貧貧。。。。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、雨中黃黃葉樹，，燈下白白頭人。。。06:04:3506:04:3506:0412/23/20226:04:36AM11、以我獨(dú)獨(dú)沈久，，愧君相相見頻。。。12月-2206:04:3606:04Dec-2223-Dec-2212、故人江江海別，，幾度隔隔山川。。。06:04:3606:04:3606:04Friday,December23,202213、乍見翻翻疑夢(mèng)，，相悲各各問年。。。12月-2212月-2206:04:3606:04:36December23,202214、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。23十二二月20226:04:36上上午06:04:3612月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月226:04上上午12月-2206:04December23,202216、行動(dòng)出出成果，，工作出出財(cái)富。。。2022/12/236:04:3606:04:3623December202217、做前，，能夠環(huán)環(huán)視四周周；做時(shí)時(shí)，你只只能或者者最好沿沿著以腳腳為起點(diǎn)點(diǎn)的射線線向前。。。6:04:36上午午6:04上午午06:04:3612月-229、沒有失失敗，只只有暫時(shí)時(shí)停止成成功！。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多多事情情努力力了未未必有有結(jié)果果，但但是不不努力力卻什什么改改變也也沒有有。。。06:04:3606:04:3606:0412/23/20226:04:36AM11、成功功就是是日復(fù)復(fù)一日日那一一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小小努力力的積積累。。。12月月-2206:04:3606:04Dec-2223-Dec-2212、世間間成事事，不不求其其絕對(duì)對(duì)圓滿滿，留留一份份不足足，可可得無無限完完美。。。06:04:3606:04:3606:04Friday,December23,20