微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱

《食品微生物學(xué)》實(shí)驗(yàn)大綱總學(xué)時(shí)：24學(xué)分：1.5面向?qū)I(yè)：食品科學(xué)與工程（大類）課程代碼：B32100014先開課程：化學(xué)、生物化學(xué)等課程性質(zhì)：必修課執(zhí)筆人：宮春波審定人：宮春波孫慶杰第一部分：實(shí)驗(yàn)教學(xué)部分一、說明1、本門課程實(shí)驗(yàn)的性質(zhì)任務(wù)、目的與要求本實(shí)驗(yàn)課是《食品微生物學(xué)》的重要組成部分，是《食品微生物學(xué)》課程的必修環(huán)節(jié)。在系統(tǒng)地學(xué)習(xí)了理論知識的同時(shí)，通過課程實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生能掌握一定的基本實(shí)驗(yàn)技能；通過分析實(shí)驗(yàn)過程出現(xiàn)的各種現(xiàn)象和問題，培養(yǎng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力；通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析處理以及實(shí)驗(yàn)報(bào)告的撰寫，培養(yǎng)和訓(xùn)練學(xué)生的實(shí)際應(yīng)用能力和組織報(bào)告的能力。本實(shí)驗(yàn)的開設(shè)要求實(shí)驗(yàn)室具備微生物實(shí)驗(yàn)要求的基本設(shè)備和相關(guān)測試儀器，同時(shí)要求學(xué)生具備化學(xué)、生物化學(xué)等基本理論知識。2、本門課程實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置情況序號實(shí)驗(yàn)名稱學(xué)時(shí)必開選開實(shí)驗(yàn)類型內(nèi)容提要驗(yàn)證基本操作綜合性、設(shè)計(jì)性1微生物的個(gè)體形態(tài)觀察及群體形態(tài)特征的觀察2√√微生物涂片、染色的基本技術(shù)；顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術(shù)。2培養(yǎng)基的制備、滅菌以及無菌檢測4√√微生物培養(yǎng)基的制備；高壓蒸汽滅菌技術(shù)和微生物接種技術(shù)3微生物個(gè)體大小測定2√√4微生物直接計(jì)數(shù)（血球板計(jì)數(shù)）2√√5微生物營養(yǎng)譜的測定2√√6環(huán)境因素對發(fā)酵微生物的影響及藥敏實(shí)驗(yàn)2√√紫外線、化學(xué)消毒劑對微生物生長的影響；微生物之間的相互作用。7微生物的選育及其鑒定、分類、命名4√√微生物的純種分離方法；菌種鑒定；微生物生產(chǎn)特性的測定及其檢測。8基于培養(yǎng)介質(zhì)的微生物消長的測定4√√微生物生長曲線的測定繪制，微生物生長的影響因素及其程度的探索。9微生物遺傳物質(zhì)提取、鑒定實(shí)驗(yàn)6√√微生物遺傳物質(zhì)的提取，檢測及其測序比較。10原生質(zhì)體融合技術(shù)雜交育種二、各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目教學(xué)要求實(shí)驗(yàn)一微生物的個(gè)體形態(tài)觀察及群體形態(tài)特征的觀察(一).顯微鏡的構(gòu)造、性能和使用方法1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）掌握顯微鏡的構(gòu)造、性能和使用方法，重點(diǎn)掌握普通光學(xué)顯微鏡油鏡的使用。（2）了解和利用普通光學(xué)顯微鏡油鏡對細(xì)菌、放線菌進(jìn)行個(gè)體形態(tài)觀察。（3）觀察并比較不同來源的的微生物生長的數(shù)量和類型。2.原理顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，有兩組重要的透鏡，這兩組透鏡雖然結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，但它們的作用都相當(dāng)于一個(gè)凸透鏡。凸鏡的成像原理，也就是顯微鏡放大成像的光學(xué)原理。只不過是通過兩次放大而已。顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介質(zhì)折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時(shí)折射率為1，而香柏油的折射率為1.51，和載片玻璃的折射率（1.52）相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過載片、香柏油進(jìn)入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。來自不同場所與不同條件下細(xì)菌的數(shù)量和類型不同。通過環(huán)境中微生物的檢測，比較來自不同場所與不同條件下細(xì)菌的數(shù)量和類型。3.試劑和儀器設(shè)備（1）儀器或其他用具：顯微鏡（帶油鏡頭，每人1臺）、擦鏡紙、棉簽、廢物缸等。（2）溶液或試劑：香柏油、二甲苯。（3）菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）及枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）染色玻片標(biāo)本；鏈霉菌（Stretomycessp.）及青霉（Penicillium）的水封片；細(xì)菌染色片：單球菌、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、鏈球菌、葡萄球菌、無芽孢桿菌、莢膜、鞭毛、弧菌、螺菌）；放線菌染色片：細(xì)黃鏈霉菌（5406放線菌）、弗氏鏈霉菌。3.實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)本片→低倍鏡觀察→高倍鏡觀察→油鏡觀察=1\*GB3①低倍鏡的使用方法：（1）取鏡和放置（2）對光（3）放置玻片標(biāo)本（4）調(diào)節(jié)焦距=2\*GB3②高倍鏡的使用方法：（1）選好目標(biāo)（2）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，調(diào)換上高倍鏡頭，轉(zhuǎn)換高倍鏡時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)速度要慢，并從側(cè)面進(jìn)行觀察（防止高倍鏡頭碰撞玻片），如高倍鏡頭碰到玻片，說明低倍鏡的焦距沒有調(diào)好，應(yīng)重新操作。（3）調(diào)節(jié)焦距=3\*GB3③油鏡的使用方法：（1）在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。（2）將集光器上升到最高位置，光圈開到最大。（3）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時(shí)，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。（4）用左眼觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。（5）油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及其處理繪出你觀察到的經(jīng)簡單染色的細(xì)菌菌體形態(tài)圖。

6.問題討論（1）顯微鏡的工作原理是什么？（2）使用顯微鏡有哪些注意事項(xiàng)？（3）使用油鏡觀察細(xì)菌染色標(biāo)本片時(shí)為何要加香柏油？（二）細(xì)菌的染色與形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)。（2）初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征。（3）鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術(shù)。（4）學(xué)習(xí)并初步掌握革蘭氏染色法。（5）了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。（6）觀察芽孢的形態(tài)特征。2.原理細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實(shí)際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇（或丙酮）溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。3.試劑和儀器設(shè)備（1）主要儀器設(shè)備或其他用具：顯微鏡（帶油鏡頭，每人1臺），酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，生理鹽水等。（2）試劑：呂氏堿性美藍(lán)染液（或草酸銨結(jié)晶紫染液），齊氏石炭酸復(fù)紅染液；革蘭氏染色液。5%孔雀綠水溶液，0.5%番紅水溶液。繪圖墨水（上海墨水廠的“滬光繪圖墨水”效果較好；必要時(shí)用濾紙過濾后使用），1%甲基紫水溶液，1%結(jié)晶紫水溶液，6%葡萄糖水溶液，20%硫酸銅水溶液，甲醇。（3）菌種：枯草芽孢桿菌12～18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，藤黃微球菌（Ｍicrococcusluteus）約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。大腸桿菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，蠟樣芽孢桿菌（B.cercus）12-20h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。革蘭氏染色液。蠟樣芽孢桿菌約2d營養(yǎng)瓊脂余斜面培養(yǎng)物，球形芽孢桿菌（B.Sphaericus）1-2d營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。4.實(shí)驗(yàn)步驟無菌操作挑取菌種→涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及其處理記錄大腸桿菌和枯草芽孢桿菌染色后的觀察結(jié)果。6.問題討論（1）在制作涂片中，為什么要進(jìn)行固定這一步？（2）革蘭氏染色中哪一步關(guān)鍵，為什么？（3）作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚?其染色成敗的關(guān)鍵是什么?

（4）當(dāng)你對一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基的制備、滅菌以及無菌檢測1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）明確培養(yǎng)基的配制原理；通過對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。（2）了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍；學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的操作方法。（3）了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍；學(xué)習(xí)干熱滅菌的操作技術(shù)。2.原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基要具備以下條件：①要有適宜的營養(yǎng)物質(zhì)和水分；②具有適宜的PH值；③配制后應(yīng)經(jīng)滅菌呈無菌狀態(tài)。培養(yǎng)基按物理狀態(tài)可分液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。常用瓊脂作凝固劑。3.試劑和儀器設(shè)備（1）儀器或其他用具：手提式高壓蒸汽滅菌鍋，電烘箱，培養(yǎng)皿（6套一包），培養(yǎng)皿，試管，吸管，試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，pH試紙（pH5.5-9.0），棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。（2）溶液或試劑：①牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LNaOH,1mol/LHCl。②可溶性淀粉，KNO3,NaCl,K2HPO4·3H2O,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O。4.實(shí)驗(yàn)步驟稱量→溶化→過濾→定容→分裝→包裝→滅菌微生物樣品→接種→觀察5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及其處理根據(jù)你所制作的培養(yǎng)基，簡述其制作過程。

6.問題討論（1）說明制備培養(yǎng)基應(yīng)注意哪些問題？（2）培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的？

（3）為什么高壓蒸汽滅菌比干熱滅菌所需的時(shí)間短，溫度低 實(shí)驗(yàn)三微生物營養(yǎng)譜的測定1.目的要求學(xué)習(xí)用生長譜法測定微生物營養(yǎng)需要的基本原理和方法。2.基本原理為了使微生物生長、繁殖，必須供給所需要的碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素、生長因子等，如果缺少其中一種，微生物便不能生長。根據(jù)這一特性，可將微生物接種在一種只缺少某種營養(yǎng)物的完全合適的瓊脂培養(yǎng)基中，倒成平板，再將所缺的營養(yǎng)物（例如各種碳源）點(diǎn)植于平板上，經(jīng)適溫培養(yǎng)，該營養(yǎng)物便逐漸擴(kuò)散于植點(diǎn)周圍。該微生物若需要此種營養(yǎng)物，便在這種營養(yǎng)物擴(kuò)散處生長繁殖，微生物繁殖之處便出現(xiàn)圓形落圈，即生長圖形，故稱此法為生長譜法。這種方法可以定性、定量的測定微生物對各種營養(yǎng)物質(zhì)的需要。在微生物育種和營養(yǎng)缺陷型的鑒定中也常用此法。3.

操作步驟1、24小時(shí)的大腸桿菌斜面用無菌水洗下，制成菌懸液。2、將合成培養(yǎng)基約20毫升，溶化后冷到50℃左右加入1毫升大腸桿菌懸液，搖勻，立即傾注于直徑為12㎝的無菌培養(yǎng)皿中，待充分凝固后，在平板背面用記號筆劃分為六個(gè)區(qū)，并標(biāo)明要點(diǎn)植的各種糖類，如圖1所。3、將6根無菌牙簽，挑取6種糖對號點(diǎn)植，糖粒大小如小米粒。

4、倒置于37℃溫室培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀察各種糖周圍有無菌落圈。5.思考題營養(yǎng)缺陷性菌株?duì)I養(yǎng)譜確定的方法？實(shí)驗(yàn)四環(huán)境因素對發(fā)酵微生物的影響及藥敏實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)七環(huán)境因素對微生物的影響1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私猸h(huán)境條件的改變對微生物生長影響。2.原理微生物的生長受環(huán)境條件的影響，這些環(huán)境條件包括物理的、化學(xué)的及生物的因素。如溫度、氫離子濃度、水分活度、滲透壓、氧氣（氧化還原電位）、輻射、超聲波、無機(jī)和有機(jī)化學(xué)試劑及其他生物生長過程中產(chǎn)生的毒素、抗生素等因素。根據(jù)微生物與氧氣的關(guān)系，可將微生物分為好氧微生物、兼性厭氧微生物、厭氧微生物和微好氧微生物幾大類。通常對細(xì)菌分類要求進(jìn)行需氧性的測定。每種微生物都有其生長溫度范圍，根據(jù)其最適生長溫度范圍，可將微生物分為低溫型、中溫型和高溫型三大類。大多數(shù)微生物屬于中溫型，它們的適宜生長溫度在20～40℃之間。微生物對環(huán)境氫離子濃度即pH亦有一定的要求，一般細(xì)菌、放線菌適于在中性微偏堿的環(huán)境生長，而酵母和霉菌適于在微酸性環(huán)境中生長。如果pH過酸或過堿都將抑制微生物的生長。（1）常用化學(xué)消毒劑對微生物的作用。（2）紫外線滅菌的原理和方法。①紫外線照射。②化學(xué)消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用。（3）微生物之間的拮抗作用。①瓊脂移塊法。②瓊脂平面劃線法。3.試劑和儀器設(shè)備（1）儀器或其他用具：①恒溫培養(yǎng)箱，無菌濾紙片，吸管，三角涂棒。②紫外線燈，無菌平皿，接種環(huán)境。（2）溶液或試劑：①2.5%碘酒，0.1%升汞，5%石炭酸，75%乙醇，1%來蘇爾，0.25%新潔爾滅，0.005%龍膽紫，0.05%龍膽紫，無菌生理鹽水。②3%-5%石炭酸或者1-3%來蘇爾溶液。（3）菌種：①大腸桿菌，白色葡萄球菌（Staphylococcusalbus）②試驗(yàn)菌（植物病原菌）、拮抗菌（放線菌）；蘇云金桿菌（4）培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。4.實(shí)驗(yàn)步驟到平板→接種菌種→物理、化學(xué)藥劑處理→培養(yǎng)觀察5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及其處理記錄物理、化學(xué)因素對微生物生長的影響，分析影響的大小。6.問題討論（1）在化學(xué)因素實(shí)驗(yàn)中，影響抑（殺）菌圈大小的因素有哪些？（2）紫外線對微生物的殺滅原理是什么？紫外線滅菌應(yīng)注意什么問題？實(shí)驗(yàn)五微生物的選育及其鑒定、分類、命名1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)為綜合性實(shí)驗(yàn)。學(xué)生應(yīng)在掌握微生物分離純化、菌種鑒定知識的基礎(chǔ)上，結(jié)合微生物菌種分離、鑒定的技能，完成本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖鞘箤W(xué)生掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化接種培養(yǎng)的基本操作技術(shù)，了解微生物的保藏原理；掌握微生物的無菌操作技術(shù)；產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌的分離鑒定及產(chǎn)酶特性研究。學(xué)習(xí)、掌握和區(qū)別細(xì)菌、霉菌、酵母菌、放線菌、細(xì)菌菌落形態(tài)的方法。2.原理微生物在自然界中不僅分布廣，而且種類多，并多是混雜地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必須把混雜的微生物類群分離開來，以得到只含一種微生物的純培養(yǎng)。微生物學(xué)中將在實(shí)驗(yàn)室條件下由一個(gè)細(xì)胞或一種細(xì)胞群繁殖得到的后代稱為微生物的純培養(yǎng)。純培養(yǎng)技術(shù)包括兩個(gè)基本步驟：①從自然環(huán)境中分離培養(yǎng)對象。②在以培養(yǎng)對象為唯一生物種類的隔離環(huán)境中培養(yǎng)、增殖，獲得這一生物種類的細(xì)胞群體。針對不同微生物的特點(diǎn)，有許多分離方法。應(yīng)用最廣的是平板法分離純培養(yǎng)。微生物的接種技術(shù)有：①斜面接種法。②液體接種法。③穿剌接種法。根據(jù)枯草芽孢桿菌的生長特性利用純培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行鑒定，研究枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性。3.試劑和儀器設(shè)備（1）儀器或其他用具：①凈化工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計(jì)、培養(yǎng)基、分離樣品、滅菌培養(yǎng)皿、滅菌１ml吸管、接種環(huán)、接種針、酒精燈、火柴、玻棒、試管架、記號筆、牛皮紙、棉繩、廢物缸。②放大鏡（每1人1個(gè)），直尺。（2）溶液或試劑：盛有90ml無菌水三角瓶（內(nèi)放少量玻璃珠），盛有9ml無菌水試管。（3）菌種：霉菌（根霉、毛霉、青霉、曲霉、木霉、赤霉菌）、酵母菌、放線菌、細(xì)菌的菌落。4.實(shí)驗(yàn)步驟學(xué)生應(yīng)通過查閱相關(guān)資料，采集土樣，樣品處理――樣品稀釋――菌種分離――菌落觀察――鑒定――特性研究5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及其處理（1）記錄平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，并分析土壤微生物分布狀況。（2）將你所觀察到的微生物菌落特征記載入下表菌種名稱培養(yǎng)條件菌落特征時(shí)間溫度培養(yǎng)基形狀邊緣表面干濕隆起度透明度粘性光澤大小顏色（3）分別描述細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌的主要特征。

6.問題討論（1）枯草芽孢桿菌分離方法是什么？（2）如何初步鑒定其產(chǎn)酶活性的高低？（3）試比較細(xì)菌與酵母菌、放線菌與霉菌的菌落形態(tài)差異。實(shí)驗(yàn)六基于培養(yǎng)介質(zhì)的微生物消長的測定1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解大腸桿菌的生長曲線特征和繁殖規(guī)律，并學(xué)會(huì)繪制生長曲線。2.復(fù)習(xí)光電比濁法測量細(xì)菌數(shù)量的方法。2.實(shí)驗(yàn)原理將一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標(biāo)作圖所繪制的曲線稱為該細(xì)菌的生長曲線。不同的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同樣的細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不相同。3.試劑與器材1.材料與試劑大腸桿菌、LB液體培養(yǎng)基70ml、分裝2支大試管(5ml／支)、剩余60ml裝入250ml的三角瓶。2.器材722型分光光度計(jì)、恒溫振蕩搖床、無菌試管、無菌吸管等。4.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容編號→接種→培養(yǎng)→比濁測定5.關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)1.測定OD值時(shí)，要求從低濃度到高濃度測定2.嚴(yán)格控制培養(yǎng)時(shí)間6.思考題1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)畫出生長曲線，并說明大腸桿菌生長特征。2.如果用活菌計(jì)數(shù)法制作生長曲線，你認(rèn)為會(huì)有什么不同?兩者各有什么缺點(diǎn)7．3.次生禮謝產(chǎn)物的大量積累在哪個(gè)時(shí)期?根據(jù)細(xì)菌生實(shí)驗(yàn)七微生物遺傳物質(zhì)提取、測序?qū)嶒?yàn)1.目的要求1.了解分光光度計(jì)測定DNA含量的原理和方法。2.熟悉質(zhì)粒的基本特性及質(zhì)粒DNA提取的基本原理。3.掌握堿變性法提取質(zhì)粒DNA的基本操作過程。2.實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒(Plasmid)是獨(dú)立存在于染色體外、能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，但在細(xì)菌細(xì)胞中含量最多。細(xì)菌質(zhì)粒大小介于1～200Kb之間，是應(yīng)用最多的質(zhì)粒類群，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)它們利用宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)構(gòu)合成質(zhì)粒自身的DNA。質(zhì)粒DNA具特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，在特殊的環(huán)境條件下，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA變性，去除變性條件又可以使DNA復(fù)性。SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能裂解細(xì)菌細(xì)胞，又能使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性。所以，SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，從而使質(zhì)粒DNA及細(xì)菌基因組DNA從細(xì)胞中同時(shí)釋放出來。釋放出來的DNA遇到強(qiáng)堿性（NaOH）環(huán)境就會(huì)變性。然后，用酸性乙酸鉀中和溶液堿性使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而染色體DNA由于分子巨大在短時(shí)間內(nèi)難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將留在上清中，染色體DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細(xì)菌中提取出來。測定DNA濃度的方法有兩種：一是利用分光光度計(jì)法測定DNA的紫外光吸收值；一是利用溴化乙錠熒光強(qiáng)度法測定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光強(qiáng)度來計(jì)算核酸的含量。（1）紫外光吸收法：因?yàn)榻M成核酸的堿基在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測定260nm處的吸收峰即可對DNA進(jìn)行定量。一般在中性pH環(huán)境條件下進(jìn)行測定，此方法常用于測定比較純凈的DNA樣品。（2）溴化乙錠熒光強(qiáng)度法：溴化乙錠能與DNA結(jié)合并嵌入雙鏈中，當(dāng)受紫外光照射時(shí)會(huì)激發(fā)產(chǎn)生熒光，且熒光的強(qiáng)度與DNA含量成正比。3.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備一、器材1.電泳儀（包括直流電源整流器和電泳槽兩部分）2.臺式離心機(jī)與高壓滅菌鍋3.超凈工作臺、搖床和各式加樣槍二、試劑1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖10mmol/LEDTA，20mmol/L20mMTris-HClpH8.0100mg/mlRNaseA（抽質(zhì)粒時(shí)現(xiàn)加）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶約100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高壓下蒸汽滅菌15分鐘，40C冰箱貯存（注：不能將RNaseA加入溶液Ⅰ中一起滅菌，RNaseA用時(shí)現(xiàn)加）。2.溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH（臨用前用10mol/LNaOH貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀解）1%SDS（臨用前用10mol/LSDS貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀解）3.溶液Ⅲ60mL

5mol/L醋酸鉀，5ml

冰醋酸，28.5mL

H2O4.TE緩沖液10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA（pH8.0）5.100%乙醇，70％乙醇6.上樣緩沖液(6×)：0.25%溴酚蘭，40％(W/V)蔗糖水溶液或30％的甘油7.5×Tris-硼酸（TBE）緩沖液445mmol/LTris堿，445mmol/L硼酸鹽，10mmol/LEDTA稱取54gTris堿、27.5g硼酸溶于500ml蒸餾水中，加入20ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0）混勻，補(bǔ)加蒸餾水至1000ml，40C冰箱貯存。8.5×Tris-乙酸（TAE）緩沖液2mol/LTris堿，1mol/L乙酸，100mmol/LEDTA稱取242gTris堿溶于500ml蒸餾水中，加入57.1ml冰乙酸（17.4mol/L）及200ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）混勻，補(bǔ)加蒸餾水至1000ml，40C冰箱貯存。

三、材料1.含有質(zhì)粒大腸桿菌2.瓊脂糖【實(shí)驗(yàn)操作】一、質(zhì)粒DNA的提取1.培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中，37℃2.取3ml細(xì)菌培養(yǎng)液（分2次，每次1.5ml）于Eppendorf管中，10，000×g離心1分鐘，棄上清液（盡可能完全）；3.加入100ul冰預(yù)冷的溶液Ⅰ，劇烈振蕩使細(xì)胞完全重懸；4.加入200ul新配制的溶液Ⅱ，快速顛倒4次，輕輕混合，將離心管放置于冰上；5.加入150ul冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，溫和振蕩10秒鐘使溶液Ⅲ均勻地分散在細(xì)菌裂解物中，置冰浴放置3～5分鐘；6.12，000×g離心5分鐘，將上清液移入另一離心管中；7.加等量酚：氯仿，振蕩混勻，用臺式高速離心機(jī)，10000r/min離心7min，上清移入另一干凈離心管；8.加2倍體積的100％乙醇混勻，于室溫凈置5分鐘沉淀雙鏈DNA；9.用臺式高速離心機(jī)

于40C、12000r/min離心5min；10.小心倒棄上清，將離心管倒置于濾紙上將剩余液體滴盡；11.用1ml70％乙醇于40C洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟11去上清，在空氣中使沉淀干燥10分鐘；12.取50ul含胰RnaseA（20ug/ml）無Dnase的TE重新溶解質(zhì)粒DNA，于-200C冰箱貯存?zhèn)溆谩６?、質(zhì)粒DNA含量測定1.取2ul提取的質(zhì)粒DNA，加入98ul蒸餾水對待測DNA樣品進(jìn)行1:50倍(或更高倍數(shù)的稀釋);1、

蒸餾水作為空白,在波長260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)至零。4.加入DNA稀釋液，測定260nm及280nm的吸收值。260nm讀數(shù)用于計(jì)算樣品中核酸的濃度，OD260值為1相當(dāng)于約50mg/ml雙鏈DNA，33mg/ml單鏈?？筛鶕?jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)的比值（OD260/OD280）估計(jì)核酸的純度。一般DNA的純品，其比值為1.8，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染5.記錄OD值，通過計(jì)算確定DNA濃度或純度，公式如下:2、

dsDNA=50×(OD260)×稀釋倍數(shù)（注：濃度單位為mg/ml）三、質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳

1.瓊脂糖凝膠的制備:稱取05g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入50mlTBE或TAE工作液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加熱至瓊脂糖溶解。

2.膠板的制備:取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠條(寬約1cm)，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，放好梳子。將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，使膠液緩慢地展開，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在含有0.5～1×

3.加樣:用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個(gè)樣品，換一個(gè)加樣頭。加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實(shí)驗(yàn)樣品孔容量約15～20ul。在第一個(gè)上樣孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)加入6ul的1kbDNAladder（50ng/ul）。

4.電泳（帶上手套操作）:加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳；建議在80～100V的電壓下電泳；當(dāng)溴酚蘭移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處停止電泳；將凝膠放入溴化乙啶（EB）工作液（0.5ug/ml左右）中染色約20min。為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm（兩電極間的距離）。電泳溫度視需要而定，對大分子的分離，以低溫較好，也可在室溫下進(jìn)行。在瓊脂糖凝膠濃度低于0.5%時(shí)，由于膠太稀，最好在4℃

5.觀察與拍照:在紫外燈(310nm波長)下觀察染色后的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。紫外光激發(fā)30s左右，肉眼可觀察到清晰的條帶。在紫外燈下觀察時(shí)，應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩，避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光損傷。拍照電泳圖