異葉敗醬中藥材中化學(xué)成分研究,藥學(xué)論文

異葉敗醬中藥材中化學(xué)成分研究,藥學(xué)論文摘要：目的研究異葉敗醬PatriniaheterophyllaBunge的化學(xué)成分及其生物活性。方式方法異葉敗醬75%乙醇提取物采用大孔樹(shù)脂、硅膠、中壓液相、半制備高壓液相進(jìn)行分離純化,根據(jù)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)鑒定所得化合物的構(gòu)造。CCK-8法檢測(cè)各化合物抑制白血病細(xì)胞HL-60、K562活性。結(jié)果從中分離得到7個(gè)化合物,分別鑒定為patrinoside(1)、roseosideⅡ(2)、(3-O--L-arabinopyranosylhederagenin28-O--D-glucopyranosyl-(16)--D-glucopyranoside(3)、apigenin4-O--D-glucopyranoside(4)、fissosideB(5)、芹菜素-7-O--D-蘆丁糖苷(6)、rhamnocitrin3-O-[-L-rhamnopyranosyl(l4)-O--L-rhamnopyranosyl(16)]--D-galactopyranoside(7)。化合物1～6的IC50100g/mL。結(jié)論化合物2～6為初次從該屬植物中分離得到,化合物1為初次從該植物中分離得到?；衔?～3、5～6對(duì)HL-60細(xì)胞具有一定的毒性抑制作用,化合物2～6對(duì)K562細(xì)胞具有一定的毒性抑制作用。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：異葉敗醬;化學(xué)成分;分離鑒定;生物活性;Abstract：AIMTostudythechemicalconstituentsfromPatriniaheterophyllaBunge.andtheirbiologicalactivities.METHODSThe75%ethanolextractfromP.heterophyllawasisolatedandpurifiedbymacroporousresin,silica,mediumpressureandliquidphaseandsemi-preparativeHPLC,thenthestructuresofobtainedcompoundswereidentifiedbyphysicochemicalpropertiesandspectraldata.TheactivitiesofinhibitingleukemiacellsHL-60andK562weredetectedbyCCK-8method.RESULTSSevencompoundswereisolatedandidentifiedaspatrinoside(1)、roseosideⅡ(2)、(3-O--L-arabinopyranosylhederagenin28-O--D-glucopyranosyl-(16)--D-glucopyranoside(3)、apigenin4-O--D-glucopyranoside(4)、fissosideB(5)、apigenin-7-O--D-lutinoside(6)、rhamnocitrin3-O-[-L-rhamnopyranosyl(l4)-O--L-rhamnopyranosyl(16)]--D-galactopyranoside(7).IC50valuesofcompounds1-6werebelow100g/mL.CONCLUSIONCompounds2-6areisolatedfromgenusPatriniaforthefirsttime,andcompound1isisolatedfromthisplantforthefirsttime.Compounds1-3and5-6haveacertaintoxicityinhibitioneffectsonHL-60cells,whilecompounds2-6haveacertaintoxicinhibitoryeffectsonK562cells.Keyword：PatriniaheterophyllaBunge;chemicalconstituents;isolationandidentification;biologicalactivities;異葉敗醬PatriniaheterophyllaBunge是敗醬科敗醬屬多年生草本植物,其根莖或根與糙葉敗醬的根莖或根混用,藥材名墓頭回[1]。文獻(xiàn)報(bào)道墓頭回對(duì)各類(lèi)急慢性白血病細(xì)胞有抑制作用,并且臨床上用于治療白血病[2-3]。異葉敗醬作為墓頭回的藥源植物,對(duì)其化學(xué)成分報(bào)道較少,為進(jìn)一步明確異葉敗醬中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)對(duì)異葉敗醬進(jìn)行化學(xué)成分研究,并對(duì)其單體化合物進(jìn)行抗腫瘤活性挑選。從中分離得到7個(gè)化合物,化合物2～6均為初次從該屬植物中分離得到,化合物1為初次從該植物中分離得到,化合物1～6對(duì)白血病細(xì)胞有一定的抑制作用。1、儀器與材料高效液相色譜儀(日本Hitachi公司);2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Altech公司);R1-102示差檢測(cè)器(日本Shodex公司);NP7000半制備液相泵(漢邦公司);R200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、中壓反相色譜柱(瑞士Buchi公司);BrukerAV-ⅢHD600超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker公司);Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Sciex公司);YT-CJ-1ND超凈工作臺(tái)(北京亞泰科隆技術(shù)有限公司);MCO-15ACCO2恒溫培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司);DT5-2離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);1420-012酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer公司);ECLIPSETS100顯微鏡(日本Nikon公司);D-101大孔樹(shù)脂(天津南開(kāi)和成科技有限公司);薄層層析硅膠GF254、柱層析硅膠100～200目(青島海洋化工廠)。分析純石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇等試劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);色譜純甲醇、乙腈(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈公司)。RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(美國(guó)HyClone公司);二甲基亞砜(美國(guó)Amresco公司);CCK-8試劑盒(Biosharp生物科技公司)。異葉敗醬于2020年采于河南省,經(jīng)中國(guó)人民當(dāng)兵的人總醫(yī)院劉萍研究員鑒定為正品。人早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)、人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞(K562)均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞中心。2、提取與分離枯燥的異葉敗醬全草(2kg)粉碎,75%乙醇回流提取3次,過(guò)濾后減壓濃縮得異葉敗醬總浸膏?？偨嗉铀蓱腋∫?依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次,取有機(jī)相層,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,回收溶劑,分別得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位63、112、36、95g。取正丁醇部分用大孔樹(shù)脂色譜進(jìn)行分離,依次用30%、60%、95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫,減壓濃縮后得到30%、60%、95%部分浸膏。將30%部分浸膏(50g)經(jīng)硅膠柱(100～200目)分離,以氯仿-甲醇-水(25∶1∶0、9∶1∶0、9∶1∶0.1、8∶2∶0.2、7∶3∶0.5)梯度洗脫,共得到263個(gè)餾分A1-263,通過(guò)薄層色譜檢測(cè),合并一樣餾分。餾分A180-190合并后經(jīng)硅膠柱,以氯仿-甲醇-水(9∶1∶0.1、8∶2∶0.2)梯度洗脫,再經(jīng)半制備HPLC(乙腈-水2∶8)得化合物1(21.5mg)。餾分A120-159合并后經(jīng)中壓反相柱以乙腈-水(1∶9、3∶17、1∶4、1∶3、3∶7)梯度洗脫,得化合物2(12.1mg)。將60%部分的浸膏經(jīng)硅膠柱色譜(100～200目)分離,經(jīng)氯仿-甲醇-水(9∶1∶0.1、8∶2∶0.2、7∶3∶0.5)梯度洗脫,共得到245個(gè)餾分B1-245,通過(guò)薄層色譜檢測(cè),合并一樣餾分。餾分B93-100合并后經(jīng)中壓反相柱以甲醇-水(5∶95～55∶45)梯度洗脫得化合物3(11mg)。餾分B60-70號(hào)合并后經(jīng)中壓反相柱以乙腈-水(3∶97～48∶52)梯度洗脫,F23重結(jié)晶得化合物4(16.4mg),F26重結(jié)晶得化合物5(9.1mg)。餾分B77-91號(hào)合并后經(jīng)中壓反相柱以甲醇-水(5∶95～80∶20)梯度洗脫,F30重結(jié)晶得化合物6(8.8mg),F40重結(jié)晶得化合物7(10.6mg)。3、構(gòu)造鑒定化合物1:白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z:485[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD):1.78(1H,m,H-13),2.03(2H,m,H-6),2.13(1H,m,H-9),2.19(2H,dd,J=7.2Hz,H-12),2.95(1H,q,J=7.8Hz,H-8),3.15(1H,t,J=8.4Hz,H-7),3.24(2H,m,H-10),4.04(1H,d,J=11.4Hz,H-1),4.22(1H,m,H-11);13C-NMR(150MHz,CD3OD):93.5(C-1),140.0(C-3),116.4(C-4),34.1(C-5),40.9(C-6),73.3(C-7),49.0(C-8),42.7(C-9),62.2(C-10),69.6(C-11),103.4(C-1),75.1(C-2),78.1(C-3),71.7(C-4),77.9(C-5),62.8(C-6),173.3(C-1),44.1(C-2),26.8(3),22.6(4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]一致,故鑒定為patrinoside?；衔?:黃色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z:677[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD):2.10(1H,d,J=16.8Hz,H-2),2.47(1H,d,J=16.8Hz,H-2),5.81(1H,quin,H-4),4.36(1H,m,H-9),1.21(3H,d,J=6.6Hz,H-10),0.90(3H,s,H-11),0.91(3H,s,H-12),1.86(3H,d,J=1.2Hz,H-13),4.28(3H,d,J=7.8Hz,Glu-1);13C-NMR(150MHz,CD3OD):42.4(C-1),50.6(C-2),201.1(C-3),127.1(C-4),167.2(C-5),79.9(C-6),131.5(C-7),135.2(C-8),77.2(C-9),21.1(C-10),23.4(C-11),24.6(C-12),19.5(C-13),102.7(C-1),75.2(C-2),78.1(C-3),71.6(C-4),77.9(C-5),62.8(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]一致,故鑒定為roseosideⅡ?；衔?:白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z:951[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD):3.06(1H,dd,J=4.8Hz,H-3),5.20(1H,brs,H-12),4.21(1H,d,J=8.4Hz,H-Ara-1),4.29(1H,d,J=8.4Hz,H-Glu-1),5.30(1H,d,J=7.8Hz,H-Glu-1);13C-NMR(150MHz,CD3OD):39.8(C-1),27.0(C-2),90.7(C-3),40.1(C-4),57.0(C-5),19.3(C-6),33.9(C-7),40.7(C-8),49.0(C-9),37.9(C-10),24.5(C-11),123.8(C-12),144.8(C-13),42.8(C-14),28.9(C-15),24.0(C-16),49.0(C-17),41.8(C-18),41.4(C-19),36.7(C-20),29.2(C-21),32.4(C-22),28.5(C-23),16.9(C-24),16.1(C-25),17.8(C-26),26.3(C-27),178.0(C-28),74.3(C-29),107.1(C-Ara-1),78.1(C-Ara-2),72.8(C-Ara-3),69.5(C-Ara-4),66.3(C-Ara-5),95.7(C-Glu-1),73.8(C-Glu-2),78.0(C-Glu-3),70.9(C-Glu-4),78.0(C-Glu-5),69.5(C-Glu-6),104.6(C-Glu-1),75.4(C-Glu-2),78.0(C-Glu-3),71.5(C-Glu-4),77.8(C-Glu-5),62.7(C-Glu-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]一致,故鑒定為(3-O--L-arabinopyranosylhederagenin28-O--D-glucopyranosyl-(16)--D-glucopyranoside?；衔?:黃色晶體(DMSO)。ESI-MSm/z:455[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD):7.95(2H,d,J=8.4Hz,H-2,6),6.93(2H,d,J=8.4Hz,H-3,5),6.82(1H,s,H-3),5.06(1H,d,J=7.8Hz,H-Glu-1),3.76(1H,s,H-Glu-6);13C-NMR(150MHz,CD3OD):182.0(C-4),164.2(C-7),162.9(C-2),161.4(C-4),161.1(C-9),156.9(C-5),128.6(C-2,C-6),121.0(C-1),116.0(C-3,C-5),105.3(C-10),103.1(C-3),99.9(C-Glu-1),99.5(C-6),94.8(C-8),77.2(C-Glu-3),76.4(C-Glu-5),73.1(C-Glu-2),69.5(C-Glu-4),60.6(C-Glu-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]一致,故鑒定為apigenin4-O--D-glucopyranoside?；衔?:白色針晶(DMSO)。ESI-MSm/z:483[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD):5.00(1H,m,H-10),4.78(1H,s,H-10),4.58(1H,s,H-1),4.35(1H,d,J=7.8Hz,H-3),4.23(1H,d,J=7.8Hz,H-1),2.42(1H,t,J=5.4Hz,H-1),2.28(1H,m,H-7),1.63(1H,d,J=9.6Hz,H-7),2.12(1H,m,H-4),1.95(1H,overlap,H-4),1.23(3H,s,H-8),0.61(3H,s,H-9);13C-NMR(150MHz,CD3OD):150.8(C-2),113.4(C-10),101.1(C-1),100.9(C-1),76.6(C-3),75.2(C-5),73.3(C-2),71.8(C-3),70.7(C-4),70.5(C-3),70.3(2),68.3(C-5),67.2(C-6),50.0(C-1),40.3(C-6),39.9(C-5),31.9(C-4),26.8(C-7),25.8(C-8),21.9(C-9),17.9(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]一致,故鑒定為fissosideB?；衔?:黃色晶體(DMSO)。ESI-MSm/z:577[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD):1.07(3H,d,J=6.0Hz,H-6),4.54(1H,d,J=6.0Hz,H-1),5.06(1H,d,J=7.2Hz,H-1),6.44(1H,s,H-6),6.76(1H,s,H-8),6.85(1H,s,H-3),6.95(2H,d,J=8.4Hz,H-3,H-5),7.95(2H,d,J=8.4Hz,H-2,H-6),10.37(1H,s,4-OH),12.95(1H,s,5-OH);13C-NMR(150MHz,CD3OD):17.8(C-6),66.0(C-6),68.3(C-5),69.5(C-2),70.3(C-3),70.7(C-4),72.0(C-2),73.1(C-4),75.6(C-3),76.3(C-5),94.8(C-8),99.5(C-6),99.9(C-1),100.5(C-1),103.1(C-3),105.4(C-10),116.1(C-3),121.0(C-1),128.6(C-2,C-6),156.9(C-9),161.2(C-4),161.3(C-7),162.9(C-5),164.4(C-2),182.0(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]一致,故鑒定為芹菜素-7-O--D-蘆丁糖苷?；衔?:黃色晶體(甲醇)。ESI-MSm/z:807[M+Na]+。1H-NMR(600MHz,CD3OD):3.83(3H,s,H-7),5.01(1H,d,J=7.8Hz,H-1),6.29(1H,d,J=7.2Hz,H-6),6.55(1H,s,H-8),6.83(2H,d,J=9.0Hz,H-3,H-5),8.07(2H,d,J=8.4Hz,H-2,H-6);13C-NMR(150MHz,CD3OD):179.7(C-4),167.4(C-7),162.7(C-5),161.8(C-4),159.7(C-9),158.5(C-2),135.9(C-3),132.6(C-2,C-6),122.5(C-1),116.2(C-3),106.5(C-10),105.5(C-1),104.0(C-1),101.9(C-1),99.2(C-6),93.3(C-8),79.6(C-4),75.4(C-5),75.0(C-3),74.0(C-4),73.2(C-3),73.0(C-2),72.2(C-2),72.1(C-3),71.9(C-2),70.2(C-5),70.0(C-5,C-4),67.6(C-6),56.6(C-OMe),18.0(C-6),18.0(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]一致,故鑒定為rhamnocitrin3-O-[-L-rhamnopyranosyl(l4)-O--L-rhamnopyranosyl(16)]--D-galactopyranoside。4、活性測(cè)試4.1、細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞從液氮罐中取出,常規(guī)方式方法[11-12]復(fù)蘇,將細(xì)胞用含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,在37℃,5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。根據(jù)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)速度1～2d更換新鮮的培養(yǎng)液或者傳代。4.2、CCK-8檢測(cè)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60、K562細(xì)胞制成密度9104/mL、8104/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔板中,每孔100L,每組設(shè)置5個(gè)平行孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后分別參加不同質(zhì)量濃度的化合物1～6(從低到高依次為0、20、40、60、80、100g/mL)及陽(yáng)性對(duì)照品順鉑50L。給藥后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,取出培養(yǎng)板,每孔參加10LCCK-8溶液。1～2h(K5621.5h,HL-602h)后在450nm處測(cè)OD值。并計(jì)算細(xì)胞抑制率及IC50值。4.3、對(duì)白血病細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)定各化合物的IC50值見(jiàn)表1。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13],單體化合物的IC50100g/mL,表示清楚實(shí)驗(yàn)樣品具有明顯的細(xì)胞毒活性。結(jié)果顯示,化合物1～3、5～6對(duì)HL-60細(xì)胞具有一定的毒性抑制作用,化合物2～6對(duì)K562細(xì)胞具有一定的毒性抑制作用。5、討論異葉敗醬是墓頭回最早的藥源植物[14],是歷代本草中以墓頭回使用的主流,但是關(guān)于異葉敗醬的化學(xué)成分報(bào)道卻很少,當(dāng)前國(guó)內(nèi)外有12個(gè)三萜類(lèi)、5個(gè)環(huán)烯醚萜酯、3個(gè)木脂素、2個(gè)甾體類(lèi)、3個(gè)黃酮類(lèi)、1個(gè)多糖和1個(gè)香豆素類(lèi)化合物的報(bào)道。異葉敗醬總皂苷和粗制劑可用于治療急慢性白血病、子宮癌、宮頸癌和大腸癌[15],但是其發(fā)揮藥效確實(shí)切化合物尚未確定。本研究從異葉敗醬中分離得到7個(gè)化合物,華而不實(shí)化合物1為環(huán)烯醚萜類(lèi)、化合物2為單環(huán)降倍半萜苷類(lèi)、化合物3為三萜皂苷類(lèi)、化合物5為單萜類(lèi)龍腦苷、化合物4、6～7為黃酮類(lèi)。通過(guò)CCK-8法挑選了化合物1～6對(duì)HL-60和K562細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示,各單體化合物對(duì)白血病細(xì)胞具有一定的毒性抑制作用,且化合物1～3、5～6對(duì)HL-60細(xì)胞、化合物2～6對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用與藥物質(zhì)量濃度有一定的依靠關(guān)系,以期為今后進(jìn)一步研究異葉敗醬的抗白血病作用提供參考。固然單體化合物對(duì)白血病細(xì)胞表現(xiàn)出了體外毒性,但中藥成分復(fù)雜,異葉敗醬化學(xué)成分抗白血病作用確實(shí)切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。表1各化合物抗白血病細(xì)胞IC50值(g/mL)以下為參考文獻(xiàn)[1]陳虎彪,誠(chéng)靜容.國(guó)產(chǎn)敗醬科藥用植物種類(lèi)整理[J].中國(guó)中藥雜志,1994,19(2):67-70.[2]萬(wàn)增智,楊文華,史哲新,等.墓頭回對(duì)HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,1999,6(6):415.[3]程衛(wèi)東,李立.墓頭回提取物誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(1):51-53.[4]NishiyaK,KimuraT,TakeyaK,etal.Sesquiterpenoidsandiridoidglycosidesfrom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