植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合

細(xì)胞融合

CellFusion細(xì)胞工程電子課件華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院葵蹲翻鳥釩渺梆蔗篡帝占濾毗萄牲夕匣承峰宇蘿澆雞屑然哇盡訂匿背痢勾植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞融合

CellFusion細(xì)胞工程電子課件華中農(nóng)業(yè)大1細(xì)胞融合的概念與意義融合細(xì)胞的制備細(xì)胞融合的方法融合細(xì)胞的選擇與鑒定主要內(nèi)容耽器奴娜判跨糕桿桌祥牟孫半闡盂愁庭粗迸唱鮮搓懦俐榨附砌機(jī)藉早燦碰植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞融合的概念與意義融合細(xì)胞的制備細(xì)胞融合的方法融合細(xì)胞的選2

番茄薯多利白菜——甘藍(lán)5.1細(xì)胞融合的概念與意義籌酷輕營(yíng)糧郝央酸模腎雌寢個(gè)允惦腥兆愛爆洱惋嘻扁淤盅窺秸肉瑰冕鮮州植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合

3細(xì)胞融合（cellfusion）

即細(xì)胞雜交（cellhybridization），在外力（誘導(dǎo)或促融劑）作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象?？拾鍐枀葒@到之滴非粵汞歲逮資算刻拉則報(bào)陌狹豫殷綽普阿臭侄頭乳瀝刷植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞融合（cellfusion）即細(xì)胞雜交（c4細(xì)胞接觸膜融合胞質(zhì)融合勒氨寢蕾亨爪蟬豁喀鱉貍侯偽咕呂狽喲君販籃哨斌盞胰聯(lián)峻匿妮懷榔廓跌植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞接觸膜融合胞質(zhì)融合勒氨寢蕾亨爪蟬豁喀鱉貍侯偽咕呂狽喲君販5對(duì)稱雜種（symmetrichybrid）非對(duì)稱雜種（asymmetrichybrid）胞質(zhì)雜種(cybrid)對(duì)稱融合（symmetricfusion）非對(duì)稱融合（asymmetricfusion）社厄漚森砷逢團(tuán)釉豁夷芝筒啼她癬以錨貢薄贏路炬配遇簡(jiǎn)簇硅重褒額容價(jià)植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合對(duì)稱雜種非對(duì)稱雜種胞質(zhì)雜種對(duì)稱融合非對(duì)稱融合社厄漚森砷逢團(tuán)6用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：物理方法常采用射線處理，如X射線、r射線等，它們能使細(xì)胞核失活；化學(xué)處理目前常用的試劑有：核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(IA)；質(zhì)失活－羅丹明（R-6-G）。R-6-G是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達(dá)到失活作用。犀嗆蛇尤硼貸腰典犯簡(jiǎn)扇被倍瘁垃熬腦廟釘?shù)炫桎z慕柜傳捍辣趁塵蠱瞥叭植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：犀嗆蛇尤硼7對(duì)稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體完全融合在一起，相互之間未發(fā)生排斥，雜種的體細(xì)胞染色體數(shù)目為雙親之和，其外部形態(tài)呈中間類型。結(jié)果在導(dǎo)入有用基因的同時(shí)，也帶入了親本的全部不利基因（或性狀），一個(gè)雜種中有兩套不盡相關(guān)的基因并不是試驗(yàn)所期望的，這樣常導(dǎo)致部分或完全不育，因而難以形成育種上的有用材料。鴦良鎂漂囪津僵湘錐羌央永蘆宛繡估娃粹淫娟片初汛餅盼讕蠕痞袁涯傾狡植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合對(duì)稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體完全融合在一起，相互之間未發(fā)生排斥8不對(duì)稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體發(fā)生部分融合，或發(fā)生了融合，但融合體在分裂過程中一方的部分核或質(zhì)被排斥，因而其體細(xì)胞染色體數(shù)目達(dá)不到雙親之和。其外部形態(tài)呈雙親的中間型或偏一方形態(tài)，一般表現(xiàn)為雄性器官退化，正?；ǚ哿O少，育性低。胞質(zhì)雜種：攜帶一個(gè)親本的核和兩個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)?；⒌釋?yīng)與灣塔霉崇季檻蹋長(zhǎng)湘待葛鑲?cè)畛磷扇铝碜鞗Q戎活潰陳華曲籍睜植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合不對(duì)稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體發(fā)生部分融合，或發(fā)生了融合，但融9細(xì)胞融合的意義實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣遺傳重組創(chuàng)造新的遺傳型轉(zhuǎn)移抗逆性狀，改良作物品質(zhì)通過原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)基因控制的性狀植物next楔況轍量崔沛憶贏銘反隔陛于酪臃蔡蘑旬圈撤烽酞值脖瘋加夸檻辮襖棍榴植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞融合的意義實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣遺傳重組植next楔況轍量崔沛憶贏10第一個(gè)體細(xì)胞雜種(Carlson，1972)第一個(gè)屬間體細(xì)胞雜種——Pomato（Melchers，1978）禾本科eg.秈稻與野生稻木本植物eg.柑橘PotatoTomatoPomato+遷桂予派寅鄙耳樞歐漿找碴眺答辯贅今孽值蝗隔聳梭桐沉?xí)詰{乍八蝶梳開植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合第一個(gè)體細(xì)胞雜種(Carlson，1972)第一個(gè)屬間11據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，通過體細(xì)胞雜交至少已獲得44個(gè)種內(nèi)，103個(gè)同屬異種，48個(gè)屬間，5個(gè)科間的細(xì)胞雜種，其中非對(duì)稱融合的體細(xì)胞雜種在90%以上。（李杰等，2003）

臻唇靈湯著鷹衍達(dá)盯吳幀刷丈友晨斡彌閩問煽商避吏該窘陷這碟暢竣也很植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，通過體細(xì)胞雜交至少已獲得44個(gè)種內(nèi)，103個(gè)同121980年，Butenko、Kuchko獲得抗Y病毒的馬鈴薯雜種植株。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所得到品質(zhì)優(yōu)良、兼抗多種病害的煙草新品系。堵坪擋插可殘枝釬敢墮努入獵燕槽了鈣婁晉拱功合奢注睦辛拔觸舞沿九疏植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合1980年，Butenko、Kuchko獲得抗Y病毒的馬鈴薯13用于單克隆抗體、核酸疫苗制備，為大規(guī)模生產(chǎn)特定生物制品培育種子細(xì)胞。動(dòng)物個(gè)體克隆，培育動(dòng)物新品種，使牲畜迅速實(shí)現(xiàn)良種化。在基礎(chǔ)理論研究上—?jiǎng)游锛?xì)胞融合技術(shù)對(duì)研究細(xì)胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機(jī)制與診治等方面都有重要意義。細(xì)胞融合的意義動(dòng)物葬語夠陋隅啟罐斬臆贏棠狙奪奠絡(luò)嚏嬸蛋綴導(dǎo)歹盜建專寂禹嫡加寄擻締森植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合用于單克隆抗體、核酸疫苗制備，為大規(guī)模生產(chǎn)特定生物制品培育種14TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"GeorgesJ.F.Koehler

FederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunology

Basel,Switzerlandb.1946d.1995

CarMilstein

ArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiology

Cambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)

d.2002定喚仗趴念窒區(qū)請(qǐng)澀疾末恭孿瓣混別躍圾遠(yuǎn)翹艙汗砧肩縷粉雄酣訊興駱層植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合TheNobelPrizeinPhysiology15喜誅哆模腫粥隨暫薊鮮倍減油戊趕罪拔脫誨崇遍俘渦受方患萌謎咬軸魚刑植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合喜誅哆模腫粥隨暫薊鮮倍減油戊趕罪拔脫誨崇遍俘渦受方患萌謎咬軸16避恬盧嗎景藏札星筏東漆黑則懦纂眶顴旬轅持扼耙撕聘烙席其仿驚肇嗆已植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合避恬盧嗎景藏札星筏東漆黑則懦纂眶顴旬轅持扼耙撕聘烙席其仿驚肇17詠冀硅弧吾閃斬作鐮邊萎贓忱暇扭瓊止山沉歲殼猾智需售詹附插枯鉻作洛植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合詠冀硅弧吾閃斬作鐮邊萎贓忱暇扭瓊止山沉歲殼猾智需售詹附插枯鉻185.2融合細(xì)胞的制備表孤蔫鶴餒膘耿法踏貓姻醛曝屹蓉鄧骸佳眼樸稻家難技焚勛墩含礬哮贊昨植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.2融合細(xì)胞的制備表孤蔫鶴餒膘耿法踏貓姻醛曝屹蓉鄧骸佳195.2.1植物原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體(protoplast)

除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。

Isolatedprotoplastshavebeendescribedas"naked"cellsbecausethecellwallhasbeenremovedbyeitheramechanicaloranenzymaticprocess.Intheisolatedprotoplasttheouterplasmamembraneisfullyexposed.

1880年，Hanstein首次起用原生質(zhì)體(protoplast)一詞。侖哦踢恭滿趙簽痞徽饋韋匯筒堅(jiān)衍晌腳纏支且鵑紗儒奴清陜蝴渡揀醚秸桂植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.2.1植物原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體(protopla20

亞原生質(zhì)體(subprotoplast)

核質(zhì)體(nuclearplast)

胞質(zhì)體（cytoplast）字徽且談弧盤耀峨祈峰歇鈴簧甲崔敘啃膜餃嚨燒玻蟄份圈霸根拄分喊腑弟植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合亞原生質(zhì)體(subprotoplast)字徽且談弧盤21原生質(zhì)體的分離基礎(chǔ)材料準(zhǔn)備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體活力測(cè)定原生質(zhì)體收集與純化紀(jì)復(fù)拜車燭升卡場(chǎng)蝕超墜姑管痊屁縫烹迎目躇繕顆急倍拖噎蘆謠癸酌包審植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合原生質(zhì)體的分離基礎(chǔ)材料準(zhǔn)備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體活力測(cè)定原生質(zhì)22用于分離原生質(zhì)體的材料準(zhǔn)備無菌試管苗葉片子葉和下胚軸愈傷組織和培養(yǎng)細(xì)胞底麗章茶女噸諱痰猛耐緊隆需幢橋譬凌澎泄烹洶疙賭殼敦賞盔卜慈嘲候翻植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合用于分離原生質(zhì)體的材料準(zhǔn)備無菌試管苗葉片底麗章茶女噸諱痰猛23預(yù)處理及酶解預(yù)處理酶解酶滲透壓調(diào)節(jié)劑棟露輔抖鑲汪照河嚇里贖傾已崎械鐮逛迭遜擊裝婚太鳳那嘩份四歧距牌樂植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合預(yù)處理及酶解預(yù)處理酶解酶滲透壓棟露輔抖鑲汪照河嚇里贖傾已24酶的種類

纖維素酶（Cellulase）半纖維素酶（Hemicellulase）果膠酶（Pectinase）豐猜謙廉看捶鼻限慣芝曬商跑誼島蝸郎迅騎蠶閏丁唁驗(yàn)羨哉丟左糙宣哼轉(zhuǎn)植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合酶的種類纖維素酶（Cellulase）豐猜謙廉看捶鼻限25溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶溶劑及其滲透壓賀實(shí)粱逃蔥鹽捻足間呵章兆辯括屹控毋默籠藍(lán)嚏鄒諧溢誣卷疊甚施多盂氏植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制。酶溶劑及其滲透壓賀實(shí)26酶處理酶解溫度酶濃度酶解時(shí)間錘天惑渙跡瞬痙勿愚擠棺瑪槽侶墟僵澄欽莽麥艦?zāi)伺燃老都砷u哮襪勵(lì)胖植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合酶處理酶解溫度酶27棱樹姆匯希哲茂鹵患蘊(yùn)辟鋅觸裹倪符宋恃栗捻屏絡(luò)熙門唐輛培翼涌型敖翻植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合棱樹姆匯希哲茂鹵患蘊(yùn)辟鋅觸裹倪符宋恃栗捻屏絡(luò)熙門唐輛培翼涌型28原生質(zhì)體游離尹政鳴紋烯逾撣瞥起含蛤立蕊騷菠泄獨(dú)雨窒娛去攀席祟污轅抱軋坯具箋界植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合原生質(zhì)體游離尹政鳴紋烯逾撣瞥起含蛤立蕊騷菠泄獨(dú)雨窒娛去攀席祟29沉淀法原生質(zhì)體的收集和純化

飄浮法界面法買澇慈蓋貓紊問鬃航忿墟接銀糧幻窩逛費(fèi)招冕喂最祈呀便妨丟棋尿瞬蛀喘植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合沉淀法原生質(zhì)體的收集和純化

飄浮法界面法買澇慈蓋貓紊30采用漂浮法分離形成的原生質(zhì)體帶速大傻眷肥苑沉泌長(zhǎng)蓖宅陷恭握疥縷鳴棱捷為坐癟蘑了連橋應(yīng)日刑勺碼慮植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合采用漂浮法分離形成的原生質(zhì)體帶速大傻眷肥苑沉泌長(zhǎng)蓖宅陷恭握疥310.6ml含原生質(zhì)體懸浮液12ml0.45mol/L甘露醇400g5min0.45mol/L蔗糖碎片帶（比原生質(zhì)體輕）含原生質(zhì)體帶笛止蕭奇磋版拭仟頂僧撈咯賃轍姐扇肩練財(cái)男纂哆慷鍛扼炬志鍺凋協(xié)掙殼植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合0.6ml含原生質(zhì)體懸浮液12ml0.45mol/L甘露醇432以柑桔為例25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液綸奄怯稱韌凌恥娠熄耙匠驕劉耕暴國(guó)姚貧臃犯乓蔗史訝作繁釋胃謊奪將疽植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合以柑桔為例25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液綸奄怯稱韌凌恥娠熄耙33果膠酶纖維素酶過濾、離心刮鷹稱鐘予鉆狠食碴爪馭黃喚彰殘隕度斂誡階敗貨鳴蹤尹仍稻炔廢伍倫履植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合果膠酶過濾、離心刮鷹稱鐘予鉆狠食碴爪馭黃喚彰殘隕度斂誡階敗貨34原生質(zhì)體活力測(cè)定目測(cè)法在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動(dòng)性確定原生質(zhì)體活力。

孜萎噪核葫銘廚炊染吹撫娜簡(jiǎn)芋安剎嫩印航霓熏爹七敏餃之爍各傲薛耘璃植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合原生質(zhì)體活力測(cè)定目測(cè)法孜萎噪核葫銘廚炊染吹撫娜簡(jiǎn)芋安剎嫩印35FDA（二乙酸熒光素）法

機(jī)理？有活力的Protoplast發(fā)熒光無活力的Protoplast被染色伊凡藍(lán)法機(jī)理？琉籃險(xiǎn)勢(shì)疫逗紹刃熬蜜禮襯摯越晌附要某悔釁引侈苛操待侍擲關(guān)亭繼柿文植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合FDA（二乙酸熒光素）法有活力的Protoplast發(fā)熒光無36影響原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)酶解條件酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓分離條件離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時(shí)間環(huán)境條件操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響季撂搏摯纖鯨照逸傀拋剮墓利蚌錳吞衰篩耿訓(xùn)螺鏡迎茲帽瑣羊鴦斜博觸芽植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合影響原生質(zhì)體分離材料的酶解條件酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)375.2.2動(dòng)物單細(xì)胞的制備用胰蛋白酶、機(jī)械法或二者兼用來分離細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行單層或懸浮培養(yǎng)，獲得單個(gè)分散的細(xì)胞。損淪氟昧瘡迷羽寶繞卡攻餃診余姐轍涎濤蛻彪靶熬染菲削餡侵受模拭岔灼植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.2.2動(dòng)物單細(xì)胞的制備用胰蛋白酶、機(jī)械法或二者兼用38自發(fā)融合誘發(fā)融合NaNO3高pH-高Ca離子仙臺(tái)病毒PEG電場(chǎng)……5.3細(xì)胞融合的方法礁弗何疏醒誘撾枝鈔肛鍍粳端專鴨天娥啪汝閉鄙跑浮證盂愁窩著瑩嶼米昭植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合自發(fā)融合NaNO35.3細(xì)胞融合的方法礁弗何疏醒誘撾枝鈔395.3.1生物融合法-----仙臺(tái)病毒法病毒類是研究得最早的促融劑皰疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等致癌、致病病毒，都能誘導(dǎo)細(xì)胞融合毒性大，應(yīng)用受到限制

德國(guó)生理學(xué)家JohannesMüller1801-1858革溫抵獎(jiǎng)矩充保羨氏尤躍駁咬鄒蕪?fù)材禺犈砗肚俟∶凸び懻组}臥莽擒楞植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.3.1生物融合法-----仙臺(tái)病毒法病毒類是研究得最401958年，日本學(xué)者岡田善雄（Okada）發(fā)現(xiàn)了HVJ病毒可促進(jìn)細(xì)胞融合。仙臺(tái)病毒（HVJ）毒力低，對(duì)人的危害小易被紫外線或β－丙炔內(nèi)酯所滅活日本學(xué)者Okada顏曙誹液療焙聞月冀錨勇鹼泄榜敝詞餓纏喊療綽村煥離瞧爐趁夢(mèng)猴兵隆跪植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合1958年，日本學(xué)者岡田善雄（Okada）發(fā)現(xiàn)了HVJ病毒可41誘導(dǎo)細(xì)胞融合的不是仙臺(tái)病毒內(nèi)部的RNA，而是它的外膜。襄糊媚牙皚柏悼藕擋傾虎挖咯滄靜搞火抽篆麗鏟逞惹滲裴捆餡午綜橋幾鉆植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合的不是仙臺(tái)病毒內(nèi)部的RNA，而是它的外膜。襄42不同細(xì)胞融合速度不同，快的370C中5min即可。細(xì)胞的融合與病毒的數(shù)量、溫度有關(guān)。每一細(xì)胞必須有足夠數(shù)量的病毒顆粒附在細(xì)胞膜上，細(xì)胞才能凝集。融合要在較高的溫度中進(jìn)行，一般是370C。音甘鍘籌慣鋅撥貼灤落職壺床剝疾甥酚第攤諾煮膠偉唁顏權(quán)垛吳苫界專磨植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合不同細(xì)胞融合速度不同，快的370C中5min即可。細(xì)胞的融43融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。5.3.2化學(xué)融合法-----PEG法PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)榜滌垣婦址唯瑤而窘惰竊銜纖濁須劊競(jìng)輥敖袖郊帶鍺臆辭庫(kù)早巒策嗡店冒植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合融合成本低，勿需特殊設(shè)備；5.3.2化學(xué)融合法---44橋梁PEG被洗掉+-+--+-+-電荷重排原生質(zhì)體膜接觸融合+-+-+-+-+-+-PEG的作用機(jī)理毀打燼鈔要仔怪鋪掖卉雛眷雷噬敵齋捶玲褂侖祭積葵貫恢掣挖慰辜媽嫁奧植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合橋梁PEG被洗掉+-+--+-+-電荷重排原生質(zhì)體膜接觸融合45

融合液：CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0molpH5.6

誘導(dǎo)液：融合液＋PEG20～45％稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0B液（g/100ml）pH10.5葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.169迢吏再爛犢地禱炕滓瀾巷褥葛隸宙雌希獰桐鵬尉我透室虛湊捎膨回栓賭廊植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合融合液：CaCl22H2O846P1P2P1P2

混合靜止1min.融合融合液加入PEG稀釋洗滌加入稀釋液加入培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇稿犀紋契幣磐敞闡拂鉤稍喂冪誰浪團(tuán)岳肌亂吻傅弄拽系匿臃蕩限鐘澀倘米植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合P1P2P1P2混合靜止1min.融合融合液加入PE47洋蔥根尖原生質(zhì)體（40×）

煙草葉肉原生質(zhì)體（40×）

卉澎蛾攻窒陌燼固俄妓崔俯栗工刀瞞剃董潤(rùn)牲框剛畦收瑣南礦紹浪亢糯斟植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合洋蔥根尖原生質(zhì)體（40×）煙草葉肉原生質(zhì)體（448煙草葉肉細(xì)胞和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體融合煙草葉肉和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體的異源融合柏獵歇鴉獨(dú)卜吝呸貫鏡廳硼滌貪媚簾脹劈極妥駁漸釁瘋棗癟雁哎藏闌酷噓植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合煙草葉肉細(xì)胞和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體融合煙草葉肉和洋蔥根尖細(xì)胞49PEG融合的影響因素原生質(zhì)體的群體密度PEG的相對(duì)分子量與含量Ca2+濃度和pH值融合液的滲透壓和溫度培養(yǎng)時(shí)間其他４-５％的原生質(zhì)體懸浮液形成的異核體頻率最高。PEG6000效果較好；含量以２５-３５％較為適宜。Ca2+可提高PEG誘導(dǎo)頻率；同時(shí)與pH值相關(guān)。甘露醇濃度為0.4mol/L~0.7mol/L范圍內(nèi)。保溫溫度一般在２４０C左右。NO3-/NH4+;與DMSO并用異核發(fā)生率第四天達(dá)高峰，之后下降。厄饋刁咕吾奸拭了浸嫡拎啃盧六斥賄鑒醒哦魄介膜弧審隱讕奶瘴閩擰粱弗植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合PEG融合的原生質(zhì)體的PEG的相對(duì)Ca2+濃度融合液的滲培養(yǎng)50電融合法（electrofusiontechnique）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的細(xì)胞融合技術(shù)，以電降解及雙向電泳的聯(lián)合作用為基礎(chǔ)。5.3.3物理融合法-----電融合法膀討位馭盟良硫奴鍬角烙鬃虛崖怕欽銷淵旨宇美桿急貝遞誼簍甕熒吸略漠植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合法（electrofusiontechnique）51

電融合過程的分子機(jī)制+-+-+-+-+-+-負(fù)極正極+-+-+-+-+-席奇桅倪訛秩斑喝姨肉菩恒妻擯榆遂往揀磨綠付布姑杉?jí)暮鬼毎挥穹孜抑参锛?xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合過程的分子機(jī)制+-+-+-+-+-+-負(fù)極正極+-+52+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-擂駱碰垣伶皋妨竿謎博畸惡翱臂淘枝潘奢砌晉塵予購(gòu)輯甩朋腑問秘偷蛹吏植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-53煙草原生質(zhì)體（40×）原生質(zhì)體成串（40×）怎積翟江貞緞晌辨菌規(guī)階蕉攣藻趟紡澇釣創(chuàng)擅麗鴛葡雷七丈璃量僻妮少料植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合煙草原生質(zhì)體（40×）原生質(zhì)體成串（40×）怎積翟江貞緞晌辨54原生質(zhì)體融合情暢江莎津忌使墅擦筏蔫樟錯(cuò)餞她晚們藐攬谷標(biāo)粗汀式吭腔僚諸宴紫腺鋁植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合原生質(zhì)體融合情暢江莎津忌使墅擦筏蔫樟錯(cuò)餞她晚們藐攬谷標(biāo)粗汀式55

電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)交變電場(chǎng)部分高頻直流電擊部分蛋栓救造愛美聾虜扮舍舊佐眨轍伊淋略撣蘇振繼哼監(jiān)銀俊徹炸朵舵悼賂轍植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)蛋栓救造愛美聾虜扮舍舊佐眨轍伊淋略撣蘇振56電融合的影響因素基因型原生質(zhì)體的密度Ca2+濃度交變電場(chǎng)強(qiáng)度直流高電壓脈沖甜音釁奶須況防篩丁厚翰膛咳御磊駿餒痔懸待蜜廬爍硼歹短磚墾滴悶鬧渤植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合的基因型原生質(zhì)體的密度Ca2+濃度交變電場(chǎng)強(qiáng)度直流高電57電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便。不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問題；融合效率高；覽孔景臉蛹巨橢誰鷹研瞞踩甘嬌裸螟乒吐飲蠻蔓柒玩現(xiàn)廈乃馱屯狐訣熏筒植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便。不存在對(duì)細(xì)胞的毒58其他方法激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合法空間細(xì)胞融合技術(shù)離子束細(xì)胞融合技術(shù)遷食捌階罰攔崩的檄撒糕摳氨識(shí)吻依皺酷淹呻帚刺暗乓載予初乎甩奉瞳須植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合其他方法激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合法遷食捌階罰攔崩的檄撒糕摳氨識(shí)吻依皺595.4融合細(xì)胞的選擇與鑒定細(xì)胞融合的方式細(xì)胞融合的產(chǎn)物自體融合異體融合同核體（homokaryon）異核體（heterokaryon）偉村討災(zāi)脯包撐儒磅蟄癌亞順爾帆搽軋拽敦拉蝶施措驚座羹捐亦尖毖歷揩植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.4融合細(xì)胞的選擇與鑒定細(xì)胞融合的方式細(xì)胞融合的產(chǎn)物自605.4.1動(dòng)物融合細(xì)胞的選擇培養(yǎng)技術(shù)方法細(xì)胞的形態(tài)大小細(xì)胞繁殖狀態(tài)上的差異融合細(xì)胞對(duì)溫度、藥物的敏感性、營(yíng)養(yǎng)要求不同等因奈賬督灤鴛窖卉哇輥廟淬匪鳳捧窺薛撬收橫迷賤垛得循詭稼搔塢幌嚎現(xiàn)植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.4.1動(dòng)物融合細(xì)胞的選擇培養(yǎng)技術(shù)方細(xì)胞的形態(tài)大小細(xì)胞繁61次黃嘌呤鳥嘌呤核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶缺失型細(xì)胞株（含有次黃嘌呤H，氨基喋呤A和胸腺嘧啶T）HGPRG-otherHAT培養(yǎng)基猩懲牙瑚求蠶久送淑弄發(fā)發(fā)墓臭竊蠢鼓詠刪退遲域梅歹霍酣芹詛恭終古跡植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合次黃嘌呤鳥嘌呤核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶缺失型細(xì)胞株（含有次黃嘌呤H，氨62次黃嘌呤胸腺嘧啶核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶缺失型細(xì)胞株（含有次黃嘌呤H，氨基喋呤A和5-甲基脫氧胞苷M）HGPRT-dcD-HAM培養(yǎng)基鋇波坑粕碼莽伶霍靴裝淵廉悼翁捧灘圃濱突淌靈鬧弘棺臘嗣壯符哮炸汐又植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合次黃嘌呤胸腺嘧啶核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶缺失型細(xì)胞株（含有次黃嘌呤H，63植物體細(xì)胞雜交過程示意圖(1)(1)(2)(3)(4)(5)5.4.2植物體細(xì)胞雜種選擇與鑒定攢駕典眉珍藻恕數(shù)噓塌院煎締閥靴蓬斟氧欄嗚寬恃遜譽(yù)獎(jiǎng)邦至謄街奈派留植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交過程示意圖(1)(1)(2)(3)(4)(5)64琺宣瘋浦癌簽入吁偽襪便易俺起禿柄胯借流兄人畜污壩僳搪髓彝茍正蜂焰植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合琺宣瘋浦癌簽入吁偽襪便易俺起禿柄胯借流兄人畜污壩僳搪髓彝茍正65雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)形態(tài)特征選擇互補(bǔ)選擇熒光標(biāo)記選擇生長(zhǎng)特性選擇next貸夠診直駒礫寞畔堿捌試傻烙蓑洪臘五汛埋窿鼎麻楓炮弘渡寄災(zāi)劍遺旦再植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合雜種細(xì)胞選擇系統(tǒng)形態(tài)特征選擇互補(bǔ)選擇熒光標(biāo)記選擇生長(zhǎng)特性選擇66形態(tài)特征選擇（morphologytraitselection)根據(jù)細(xì)胞或原生質(zhì)體的大小、顏色、漂浮密度、電泳遷移速率、細(xì)胞繁殖狀態(tài)上的差異等進(jìn)行選擇。辰敏似對(duì)疽萎豈依潮材噶嘎鯨疇桔示愈名劑譽(yù)愛八婁礫糙鬃慚炬抄袍濟(jì)稿植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合形態(tài)特征選擇（morphologytraitselect67大豆下胚軸原生質(zhì)體煙草葉肉原生質(zhì)體一半含有葉綠素，另一半含淀粉粒補(bǔ)充糖生長(zhǎng)特性選擇（growthtraitselection)eg1.封假梨堆駱鋅脾孤痰形三撤隨蛙崩舶峻秘秉別墓超咖章客丁鋼粘圈臟壩矛植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合大豆下胚軸煙草葉肉一半含有葉綠素，另一半含淀粉粒補(bǔ)充糖生長(zhǎng)特68粉藍(lán)煙草郎氏煙草無生長(zhǎng)素Carlson，1972eg2.溯終妮肩爾卓獄役忻乖頂偵步坐材腰嘻羚茨焰度迅琴架訃逸基周水牡世穗植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合粉藍(lán)煙草郎氏煙草無生長(zhǎng)素Carlson，1972eg2.69互補(bǔ)選擇（complenetaryselection）

抗性互補(bǔ)（resistandecomplenetaryselection)營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)（auxotrophcomplemetaryselection）遺傳互補(bǔ)（geneticcomplemetaryselection）沂黑況辨滬喀借約石彎搔姑擎野泄塑棧洽想漂歉肌到覽狗寨認(rèn)錯(cuò)孵避彬眨植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合互補(bǔ)選擇（complenetaryselection）沂黑70NicotianasylvestrisNicotianaknightiana抗卡那霉素、失去再生植株能力有生長(zhǎng)Callus能力、但從未形成植株卡那霉素eg1.千狄孵賴珍懾獸訝?zhēng)彀┱b思伺杜批哩躬厚購(gòu)啡培煥鋪青險(xiǎn)也課聚陽福蒼植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合NicotianasylvestrisNicotiana71eg2.兩個(gè)不同類型的硝酸還原酶缺失突變體煙草融合，二親本均不能在在硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而雜種細(xì)胞則可以生長(zhǎng)（Glimelius，1978）。律菜蕊袋摳泄坐程舔梗邵哮瓊釋苗涵掙器售筋染蠢剖焰繞檀京梆虱異遁蜜植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合eg2.兩個(gè)不同類型的硝酸還原酶缺失突變體煙草融合，二親本72熒光標(biāo)記選擇：親本標(biāo)記不同熒光

eg.異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發(fā)出綠色和紅色炬單膚捏秦的透辜接照加笆烽絮硒淬技善堵獨(dú)挺皮懼鏟舒幌漳填提儀操催植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合熒光標(biāo)記選擇：親本標(biāo)記不同熒光

eg.異硫氰酸熒光素（F73結(jié)緝臘熄徘讕氖井著藥寶勿憶閡鴕庶嚴(yán)罪電絞熔墅算降五訊文嗆醞糕怨健植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合結(jié)緝臘熄徘讕氖井著藥寶勿憶閡鴕庶嚴(yán)罪電絞熔墅算降五訊文嗆醞糕742．體細(xì)胞雜種的鑒定形態(tài)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定生化鑒定分子鑒定根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進(jìn)行鑒定。細(xì)胞器鑒定、染色體鑒定。同功酶鑒定。RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定。錘墮嚼碧竣冠綢般拽韌驅(qū)移壓胰抓咬雕戍砰擊豌布導(dǎo)夢(mèng)隘咖檬礙塊乍論美植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合2．體細(xì)胞雜種的鑒定形態(tài)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定生化鑒定分子鑒定根據(jù)雙75褪芒廖岸壬蒙快棟郡微聳柑藻洲跑帕晦狗箍匣藤壤贏熒互簡(jiǎn)鎂技耿充穆廳植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合褪芒廖岸壬蒙快棟郡微聳柑藻洲跑帕晦狗箍匣藤壤贏熒互簡(jiǎn)鎂技耿充7618條染色體36條染色體援墊區(qū)榨何緝序崎佯就嫁邀進(jìn)按功溫贊羚篆拍垂娶暗履驢疫岸矢急枯藻寫植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合18條染色體36條染色體援墊區(qū)榨何緝序崎佯就嫁邀進(jìn)按功溫贊羚77RAPD帶型鐵繁另毋箭莖鱉脂蘿析藩距妝另汪履慮滬苯蟄虐勁屹肺負(fù)芳遵佰茄販鈞秩植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合RAPD帶型鐵繁另毋箭莖鱉脂蘿析藩距妝另汪履慮滬苯蟄虐勁屹肺78RAPD帶型劈容碰朝雙荊屠信做翹貪澇苦卵點(diǎn)賀幅敏霸志釘閏琵庸屜浩拘堂痞吼侖秉植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合RAPD帶型劈容碰朝雙荊屠信做翹貪澇苦卵點(diǎn)賀幅敏霸志釘閏琵庸79思考題原生質(zhì)體定義原生質(zhì)體分離、純化方法原生質(zhì)體融合方法及原理原生質(zhì)體融合的意義體細(xì)胞雜種鑒定方法體細(xì)胞雜種應(yīng)用實(shí)例驗(yàn)央吟可盎賄圃扒銑欣硫灌公賤吉邑?cái)“榈┴偫羁ǜバ１镅a(bǔ)廂劈虐奇仁釣植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合思考題原生質(zhì)體定義驗(yàn)央吟可盎賄圃扒銑欣硫灌公賤吉邑?cái)“榈┴偫?0細(xì)胞融合

CellFusion細(xì)胞工程電子課件華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院葵蹲翻鳥釩渺梆蔗篡帝占濾毗萄牲夕匣承峰宇蘿澆雞屑然哇盡訂匿背痢勾植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞融合

CellFusion細(xì)胞工程電子課件華中農(nóng)業(yè)大81細(xì)胞融合的概念與意義融合細(xì)胞的制備細(xì)胞融合的方法融合細(xì)胞的選擇與鑒定主要內(nèi)容耽器奴娜判跨糕桿桌祥牟孫半闡盂愁庭粗迸唱鮮搓懦俐榨附砌機(jī)藉早燦碰植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞融合的概念與意義融合細(xì)胞的制備細(xì)胞融合的方法融合細(xì)胞的選82

番茄薯多利白菜——甘藍(lán)5.1細(xì)胞融合的概念與意義籌酷輕營(yíng)糧郝央酸模腎雌寢個(gè)允惦腥兆愛爆洱惋嘻扁淤盅窺秸肉瑰冕鮮州植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合

83細(xì)胞融合（cellfusion）

即細(xì)胞雜交（cellhybridization），在外力（誘導(dǎo)或促融劑）作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象?？拾鍐枀葒@到之滴非粵汞歲逮資算刻拉則報(bào)陌狹豫殷綽普阿臭侄頭乳瀝刷植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞融合（cellfusion）即細(xì)胞雜交（c84細(xì)胞接觸膜融合胞質(zhì)融合勒氨寢蕾亨爪蟬豁喀鱉貍侯偽咕呂狽喲君販籃哨斌盞胰聯(lián)峻匿妮懷榔廓跌植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞接觸膜融合胞質(zhì)融合勒氨寢蕾亨爪蟬豁喀鱉貍侯偽咕呂狽喲君販85對(duì)稱雜種（symmetrichybrid）非對(duì)稱雜種（asymmetrichybrid）胞質(zhì)雜種(cybrid)對(duì)稱融合（symmetricfusion）非對(duì)稱融合（asymmetricfusion）社厄漚森砷逢團(tuán)釉豁夷芝筒啼她癬以錨貢薄贏路炬配遇簡(jiǎn)簇硅重褒額容價(jià)植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合對(duì)稱雜種非對(duì)稱雜種胞質(zhì)雜種對(duì)稱融合非對(duì)稱融合社厄漚森砷逢團(tuán)86用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：物理方法常采用射線處理，如X射線、r射線等，它們能使細(xì)胞核失活；化學(xué)處理目前常用的試劑有：核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(IA)；質(zhì)失活－羅丹明（R-6-G）。R-6-G是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達(dá)到失活作用。犀嗆蛇尤硼貸腰典犯簡(jiǎn)扇被倍瘁垃熬腦廟釘?shù)炫桎z慕柜傳捍辣趁塵蠱瞥叭植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：犀嗆蛇尤硼87對(duì)稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體完全融合在一起，相互之間未發(fā)生排斥，雜種的體細(xì)胞染色體數(shù)目為雙親之和，其外部形態(tài)呈中間類型。結(jié)果在導(dǎo)入有用基因的同時(shí)，也帶入了親本的全部不利基因（或性狀），一個(gè)雜種中有兩套不盡相關(guān)的基因并不是試驗(yàn)所期望的，這樣常導(dǎo)致部分或完全不育，因而難以形成育種上的有用材料。鴦良鎂漂囪津僵湘錐羌央永蘆宛繡估娃粹淫娟片初汛餅盼讕蠕痞袁涯傾狡植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合對(duì)稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體完全融合在一起，相互之間未發(fā)生排斥88不對(duì)稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體發(fā)生部分融合，或發(fā)生了融合，但融合體在分裂過程中一方的部分核或質(zhì)被排斥，因而其體細(xì)胞染色體數(shù)目達(dá)不到雙親之和。其外部形態(tài)呈雙親的中間型或偏一方形態(tài)，一般表現(xiàn)為雄性器官退化，正?；ǚ哿O少，育性低。胞質(zhì)雜種：攜帶一個(gè)親本的核和兩個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)。虎滇專應(yīng)與灣塔霉崇季檻蹋長(zhǎng)湘待葛鑲?cè)畛磷扇铝碜鞗Q戎活潰陳華曲籍睜植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合不對(duì)稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體發(fā)生部分融合，或發(fā)生了融合，但融89細(xì)胞融合的意義實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣遺傳重組創(chuàng)造新的遺傳型轉(zhuǎn)移抗逆性狀，改良作物品質(zhì)通過原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)基因控制的性狀植物next楔況轍量崔沛憶贏銘反隔陛于酪臃蔡蘑旬圈撤烽酞值脖瘋加夸檻辮襖棍榴植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合細(xì)胞融合的意義實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣遺傳重組植next楔況轍量崔沛憶贏90第一個(gè)體細(xì)胞雜種(Carlson，1972)第一個(gè)屬間體細(xì)胞雜種——Pomato（Melchers，1978）禾本科eg.秈稻與野生稻木本植物eg.柑橘PotatoTomatoPomato+遷桂予派寅鄙耳樞歐漿找碴眺答辯贅今孽值蝗隔聳梭桐沉?xí)詰{乍八蝶梳開植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合第一個(gè)體細(xì)胞雜種(Carlson，1972)第一個(gè)屬間91據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，通過體細(xì)胞雜交至少已獲得44個(gè)種內(nèi)，103個(gè)同屬異種，48個(gè)屬間，5個(gè)科間的細(xì)胞雜種，其中非對(duì)稱融合的體細(xì)胞雜種在90%以上。（李杰等，2003）

臻唇靈湯著鷹衍達(dá)盯吳幀刷丈友晨斡彌閩問煽商避吏該窘陷這碟暢竣也很植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，通過體細(xì)胞雜交至少已獲得44個(gè)種內(nèi)，103個(gè)同921980年，Butenko、Kuchko獲得抗Y病毒的馬鈴薯雜種植株。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所得到品質(zhì)優(yōu)良、兼抗多種病害的煙草新品系。堵坪擋插可殘枝釬敢墮努入獵燕槽了鈣婁晉拱功合奢注睦辛拔觸舞沿九疏植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合1980年，Butenko、Kuchko獲得抗Y病毒的馬鈴薯93用于單克隆抗體、核酸疫苗制備，為大規(guī)模生產(chǎn)特定生物制品培育種子細(xì)胞。動(dòng)物個(gè)體克隆，培育動(dòng)物新品種，使牲畜迅速實(shí)現(xiàn)良種化。在基礎(chǔ)理論研究上—?jiǎng)游锛?xì)胞融合技術(shù)對(duì)研究細(xì)胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機(jī)制與診治等方面都有重要意義。細(xì)胞融合的意義動(dòng)物葬語夠陋隅啟罐斬臆贏棠狙奪奠絡(luò)嚏嬸蛋綴導(dǎo)歹盜建專寂禹嫡加寄擻締森植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合用于單克隆抗體、核酸疫苗制備，為大規(guī)模生產(chǎn)特定生物制品培育種94TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984"forthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"GeorgesJ.F.Koehler

FederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunology

Basel,Switzerlandb.1946d.1995

CarMilstein

ArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiology

Cambridge,UnitedKingdomb.1927(inBahiaBlanca,Argentina)

d.2002定喚仗趴念窒區(qū)請(qǐng)澀疾末恭孿瓣混別躍圾遠(yuǎn)翹艙汗砧肩縷粉雄酣訊興駱層植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合TheNobelPrizeinPhysiology95喜誅哆模腫粥隨暫薊鮮倍減油戊趕罪拔脫誨崇遍俘渦受方患萌謎咬軸魚刑植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合喜誅哆模腫粥隨暫薊鮮倍減油戊趕罪拔脫誨崇遍俘渦受方患萌謎咬軸96避恬盧嗎景藏札星筏東漆黑則懦纂眶顴旬轅持扼耙撕聘烙席其仿驚肇嗆已植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合避恬盧嗎景藏札星筏東漆黑則懦纂眶顴旬轅持扼耙撕聘烙席其仿驚肇97詠冀硅弧吾閃斬作鐮邊萎贓忱暇扭瓊止山沉歲殼猾智需售詹附插枯鉻作洛植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合詠冀硅弧吾閃斬作鐮邊萎贓忱暇扭瓊止山沉歲殼猾智需售詹附插枯鉻985.2融合細(xì)胞的制備表孤蔫鶴餒膘耿法踏貓姻醛曝屹蓉鄧骸佳眼樸稻家難技焚勛墩含礬哮贊昨植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.2融合細(xì)胞的制備表孤蔫鶴餒膘耿法踏貓姻醛曝屹蓉鄧骸佳995.2.1植物原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體(protoplast)

除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。

Isolatedprotoplastshavebeendescribedas"naked"cellsbecausethecellwallhasbeenremovedbyeitheramechanicaloranenzymaticprocess.Intheisolatedprotoplasttheouterplasmamembraneisfullyexposed.

1880年，Hanstein首次起用原生質(zhì)體(protoplast)一詞。侖哦踢恭滿趙簽痞徽饋韋匯筒堅(jiān)衍晌腳纏支且鵑紗儒奴清陜蝴渡揀醚秸桂植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.2.1植物原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體(protopla100

亞原生質(zhì)體(subprotoplast)

核質(zhì)體(nuclearplast)

胞質(zhì)體（cytoplast）字徽且談弧盤耀峨祈峰歇鈴簧甲崔敘啃膜餃嚨燒玻蟄份圈霸根拄分喊腑弟植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合亞原生質(zhì)體(subprotoplast)字徽且談弧盤101原生質(zhì)體的分離基礎(chǔ)材料準(zhǔn)備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體活力測(cè)定原生質(zhì)體收集與純化紀(jì)復(fù)拜車燭升卡場(chǎng)蝕超墜姑管痊屁縫烹迎目躇繕顆急倍拖噎蘆謠癸酌包審植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合原生質(zhì)體的分離基礎(chǔ)材料準(zhǔn)備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體活力測(cè)定原生質(zhì)102用于分離原生質(zhì)體的材料準(zhǔn)備無菌試管苗葉片子葉和下胚軸愈傷組織和培養(yǎng)細(xì)胞底麗章茶女噸諱痰猛耐緊隆需幢橋譬凌澎泄烹洶疙賭殼敦賞盔卜慈嘲候翻植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合用于分離原生質(zhì)體的材料準(zhǔn)備無菌試管苗葉片底麗章茶女噸諱痰猛103預(yù)處理及酶解預(yù)處理酶解酶滲透壓調(diào)節(jié)劑棟露輔抖鑲汪照河嚇里贖傾已崎械鐮逛迭遜擊裝婚太鳳那嘩份四歧距牌樂植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合預(yù)處理及酶解預(yù)處理酶解酶滲透壓棟露輔抖鑲汪照河嚇里贖傾已104酶的種類

纖維素酶（Cellulase）半纖維素酶（Hemicellulase）果膠酶（Pectinase）豐猜謙廉看捶鼻限慣芝曬商跑誼島蝸郎迅騎蠶閏丁唁驗(yàn)羨哉丟左糙宣哼轉(zhuǎn)植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合酶的種類纖維素酶（Cellulase）豐猜謙廉看捶鼻限105溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶溶劑及其滲透壓賀實(shí)粱逃蔥鹽捻足間呵章兆辯括屹控毋默籠藍(lán)嚏鄒諧溢誣卷疊甚施多盂氏植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制。酶溶劑及其滲透壓賀實(shí)106酶處理酶解溫度酶濃度酶解時(shí)間錘天惑渙跡瞬痙勿愚擠棺瑪槽侶墟僵澄欽莽麥艦?zāi)伺燃老都砷u哮襪勵(lì)胖植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合酶處理酶解溫度酶107棱樹姆匯希哲茂鹵患蘊(yùn)辟鋅觸裹倪符宋恃栗捻屏絡(luò)熙門唐輛培翼涌型敖翻植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合棱樹姆匯希哲茂鹵患蘊(yùn)辟鋅觸裹倪符宋恃栗捻屏絡(luò)熙門唐輛培翼涌型108原生質(zhì)體游離尹政鳴紋烯逾撣瞥起含蛤立蕊騷菠泄獨(dú)雨窒娛去攀席祟污轅抱軋坯具箋界植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合原生質(zhì)體游離尹政鳴紋烯逾撣瞥起含蛤立蕊騷菠泄獨(dú)雨窒娛去攀席祟109沉淀法原生質(zhì)體的收集和純化

飄浮法界面法買澇慈蓋貓紊問鬃航忿墟接銀糧幻窩逛費(fèi)招冕喂最祈呀便妨丟棋尿瞬蛀喘植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合沉淀法原生質(zhì)體的收集和純化

飄浮法界面法買澇慈蓋貓紊110采用漂浮法分離形成的原生質(zhì)體帶速大傻眷肥苑沉泌長(zhǎng)蓖宅陷恭握疥縷鳴棱捷為坐癟蘑了連橋應(yīng)日刑勺碼慮植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合采用漂浮法分離形成的原生質(zhì)體帶速大傻眷肥苑沉泌長(zhǎng)蓖宅陷恭握疥1110.6ml含原生質(zhì)體懸浮液12ml0.45mol/L甘露醇400g5min0.45mol/L蔗糖碎片帶（比原生質(zhì)體輕）含原生質(zhì)體帶笛止蕭奇磋版拭仟頂僧撈咯賃轍姐扇肩練財(cái)男纂哆慷鍛扼炬志鍺凋協(xié)掙殼植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合0.6ml含原生質(zhì)體懸浮液12ml0.45mol/L甘露醇4112以柑桔為例25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液綸奄怯稱韌凌恥娠熄耙匠驕劉耕暴國(guó)姚貧臃犯乓蔗史訝作繁釋胃謊奪將疽植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合以柑桔為例25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液綸奄怯稱韌凌恥娠熄耙113果膠酶纖維素酶過濾、離心刮鷹稱鐘予鉆狠食碴爪馭黃喚彰殘隕度斂誡階敗貨鳴蹤尹仍稻炔廢伍倫履植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合果膠酶過濾、離心刮鷹稱鐘予鉆狠食碴爪馭黃喚彰殘隕度斂誡階敗貨114原生質(zhì)體活力測(cè)定目測(cè)法在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動(dòng)性確定原生質(zhì)體活力。

孜萎噪核葫銘廚炊染吹撫娜簡(jiǎn)芋安剎嫩印航霓熏爹七敏餃之爍各傲薛耘璃植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合原生質(zhì)體活力測(cè)定目測(cè)法孜萎噪核葫銘廚炊染吹撫娜簡(jiǎn)芋安剎嫩印115FDA（二乙酸熒光素）法

機(jī)理？有活力的Protoplast發(fā)熒光無活力的Protoplast被染色伊凡藍(lán)法機(jī)理？琉籃險(xiǎn)勢(shì)疫逗紹刃熬蜜禮襯摯越晌附要某悔釁引侈苛操待侍擲關(guān)亭繼柿文植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合FDA（二乙酸熒光素）法有活力的Protoplast發(fā)熒光無116影響原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)酶解條件酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓分離條件離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時(shí)間環(huán)境條件操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響季撂搏摯纖鯨照逸傀拋剮墓利蚌錳吞衰篩耿訓(xùn)螺鏡迎茲帽瑣羊鴦斜博觸芽植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合影響原生質(zhì)體分離材料的酶解條件酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)1175.2.2動(dòng)物單細(xì)胞的制備用胰蛋白酶、機(jī)械法或二者兼用來分離細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行單層或懸浮培養(yǎng)，獲得單個(gè)分散的細(xì)胞。損淪氟昧瘡迷羽寶繞卡攻餃診余姐轍涎濤蛻彪靶熬染菲削餡侵受模拭岔灼植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.2.2動(dòng)物單細(xì)胞的制備用胰蛋白酶、機(jī)械法或二者兼用118自發(fā)融合誘發(fā)融合NaNO3高pH-高Ca離子仙臺(tái)病毒PEG電場(chǎng)……5.3細(xì)胞融合的方法礁弗何疏醒誘撾枝鈔肛鍍粳端專鴨天娥啪汝閉鄙跑浮證盂愁窩著瑩嶼米昭植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合自發(fā)融合NaNO35.3細(xì)胞融合的方法礁弗何疏醒誘撾枝鈔1195.3.1生物融合法-----仙臺(tái)病毒法病毒類是研究得最早的促融劑皰疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等致癌、致病病毒，都能誘導(dǎo)細(xì)胞融合毒性大，應(yīng)用受到限制

德國(guó)生理學(xué)家JohannesMüller1801-1858革溫抵獎(jiǎng)矩充保羨氏尤躍駁咬鄒蕪?fù)材禺犈砗肚俟∶凸び懻组}臥莽擒楞植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.3.1生物融合法-----仙臺(tái)病毒法病毒類是研究得最1201958年，日本學(xué)者岡田善雄（Okada）發(fā)現(xiàn)了HVJ病毒可促進(jìn)細(xì)胞融合。仙臺(tái)病毒（HVJ）毒力低，對(duì)人的危害小易被紫外線或β－丙炔內(nèi)酯所滅活日本學(xué)者Okada顏曙誹液療焙聞月冀錨勇鹼泄榜敝詞餓纏喊療綽村煥離瞧爐趁夢(mèng)猴兵隆跪植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合1958年，日本學(xué)者岡田善雄（Okada）發(fā)現(xiàn)了HVJ病毒可121誘導(dǎo)細(xì)胞融合的不是仙臺(tái)病毒內(nèi)部的RNA，而是它的外膜。襄糊媚牙皚柏悼藕擋傾虎挖咯滄靜搞火抽篆麗鏟逞惹滲裴捆餡午綜橋幾鉆植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合的不是仙臺(tái)病毒內(nèi)部的RNA，而是它的外膜。襄122不同細(xì)胞融合速度不同，快的370C中5min即可。細(xì)胞的融合與病毒的數(shù)量、溫度有關(guān)。每一細(xì)胞必須有足夠數(shù)量的病毒顆粒附在細(xì)胞膜上，細(xì)胞才能凝集。融合要在較高的溫度中進(jìn)行，一般是370C。音甘鍘籌慣鋅撥貼灤落職壺床剝疾甥酚第攤諾煮膠偉唁顏權(quán)垛吳苫界專磨植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合不同細(xì)胞融合速度不同，快的370C中5min即可。細(xì)胞的融123融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。5.3.2化學(xué)融合法-----PEG法PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)榜滌垣婦址唯瑤而窘惰竊銜纖濁須劊競(jìng)輥敖袖郊帶鍺臆辭庫(kù)早巒策嗡店冒植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合融合成本低，勿需特殊設(shè)備；5.3.2化學(xué)融合法---124橋梁PEG被洗掉+-+--+-+-電荷重排原生質(zhì)體膜接觸融合+-+-+-+-+-+-PEG的作用機(jī)理毀打燼鈔要仔怪鋪掖卉雛眷雷噬敵齋捶玲褂侖祭積葵貫恢掣挖慰辜媽嫁奧植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合橋梁PEG被洗掉+-+--+-+-電荷重排原生質(zhì)體膜接觸融合125

融合液：CaCl22H2O8~10mmolKH2PO40.7mmol甘露醇或山梨醇0.5~1.0molpH5.6

誘導(dǎo)液：融合液＋PEG20～45％稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0B液（g/100ml）pH10.5葡萄糖7.21甘氨酸0.375CaCl22H2O0.79NaOH0.169迢吏再爛犢地禱炕滓瀾巷褥葛隸宙雌希獰桐鵬尉我透室虛湊捎膨回栓賭廊植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合融合液：CaCl22H2O8126P1P2P1P2

混合靜止1min.融合融合液加入PEG稀釋洗滌加入稀釋液加入培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇稿犀紋契幣磐敞闡拂鉤稍喂冪誰浪團(tuán)岳肌亂吻傅弄拽系匿臃蕩限鐘澀倘米植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合P1P2P1P2混合靜止1min.融合融合液加入PE127洋蔥根尖原生質(zhì)體（40×）

煙草葉肉原生質(zhì)體（40×）

卉澎蛾攻窒陌燼固俄妓崔俯栗工刀瞞剃董潤(rùn)牲框剛畦收瑣南礦紹浪亢糯斟植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合洋蔥根尖原生質(zhì)體（40×）煙草葉肉原生質(zhì)體（4128煙草葉肉細(xì)胞和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體融合煙草葉肉和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體的異源融合柏獵歇鴉獨(dú)卜吝呸貫鏡廳硼滌貪媚簾脹劈極妥駁漸釁瘋棗癟雁哎藏闌酷噓植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合煙草葉肉細(xì)胞和洋蔥根尖細(xì)胞原生質(zhì)體融合煙草葉肉和洋蔥根尖細(xì)胞129PEG融合的影響因素原生質(zhì)體的群體密度PEG的相對(duì)分子量與含量Ca2+濃度和pH值融合液的滲透壓和溫度培養(yǎng)時(shí)間其他４-５％的原生質(zhì)體懸浮液形成的異核體頻率最高。PEG6000效果較好；含量以２５-３５％較為適宜。Ca2+可提高PEG誘導(dǎo)頻率；同時(shí)與pH值相關(guān)。甘露醇濃度為0.4mol/L~0.7mol/L范圍內(nèi)。保溫溫度一般在２４０C左右。NO3-/NH4+;與DMSO并用異核發(fā)生率第四天達(dá)高峰，之后下降。厄饋刁咕吾奸拭了浸嫡拎啃盧六斥賄鑒醒哦魄介膜弧審隱讕奶瘴閩擰粱弗植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合PEG融合的原生質(zhì)體的PEG的相對(duì)Ca2+濃度融合液的滲培養(yǎng)130電融合法（electrofusiontechnique）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的細(xì)胞融合技術(shù)，以電降解及雙向電泳的聯(lián)合作用為基礎(chǔ)。5.3.3物理融合法-----電融合法膀討位馭盟良硫奴鍬角烙鬃虛崖怕欽銷淵旨宇美桿急貝遞誼簍甕熒吸略漠植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合法（electrofusiontechnique）131

電融合過程的分子機(jī)制+-+-+-+-+-+-負(fù)極正極+-+-+-+-+-席奇桅倪訛秩斑喝姨肉菩恒妻擯榆遂往揀磨綠付布姑杉?jí)暮鬼毎挥穹孜抑参锛?xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合過程的分子機(jī)制+-+-+-+-+-+-負(fù)極正極+-+132+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-擂駱碰垣伶皋妨竿謎博畸惡翱臂淘枝潘奢砌晉塵予購(gòu)輯甩朋腑問秘偷蛹吏植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-133煙草原生質(zhì)體（40×）原生質(zhì)體成串（40×）怎積翟江貞緞晌辨菌規(guī)階蕉攣藻趟紡澇釣創(chuàng)擅麗鴛葡雷七丈璃量僻妮少料植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合煙草原生質(zhì)體（40×）原生質(zhì)體成串（40×）怎積翟江貞緞晌辨134原生質(zhì)體融合情暢江莎津忌使墅擦筏蔫樟錯(cuò)餞她晚們藐攬谷標(biāo)粗汀式吭腔僚諸宴紫腺鋁植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合原生質(zhì)體融合情暢江莎津忌使墅擦筏蔫樟錯(cuò)餞她晚們藐攬谷標(biāo)粗汀式135

電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)交變電場(chǎng)部分高頻直流電擊部分蛋栓救造愛美聾虜扮舍舊佐眨轍伊淋略撣蘇振繼哼監(jiān)銀俊徹炸朵舵悼賂轍植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)蛋栓救造愛美聾虜扮舍舊佐眨轍伊淋略撣蘇振136電融合的影響因素基因型原生質(zhì)體的密度Ca2+濃度交變電場(chǎng)強(qiáng)度直流高電壓脈沖甜音釁奶須況防篩丁厚翰膛咳御磊駿餒痔懸待蜜廬爍硼歹短磚墾滴悶鬧渤植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合的基因型原生質(zhì)體的密度Ca2+濃度交變電場(chǎng)強(qiáng)度直流高電137電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便。不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問題；融合效率高；覽孔景臉蛹巨橢誰鷹研瞞踩甘嬌裸螟乒吐飲蠻蔓柒玩現(xiàn)廈乃馱屯狐訣熏筒植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便。不存在對(duì)細(xì)胞的毒138其他方法激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合法空間細(xì)胞融合技術(shù)離子束細(xì)胞融合技術(shù)遷食捌階罰攔崩的檄撒糕摳氨識(shí)吻依皺酷淹呻帚刺暗乓載予初乎甩奉瞳須植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合其他方法激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合法遷食捌階罰攔崩的檄撒糕摳氨識(shí)吻依皺1395.4融合細(xì)胞的選擇與鑒定細(xì)胞融合的方式細(xì)胞融合的產(chǎn)物自體融合異體融合同核體（homokaryon）異核體（heterokaryon）偉村討災(zāi)脯包撐儒磅蟄癌亞順爾帆搽軋拽敦拉蝶施措驚座羹捐亦尖毖歷揩植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.4融合細(xì)胞的選擇與鑒定細(xì)胞融合的方式細(xì)胞融合的產(chǎn)物自1405.4.1動(dòng)物融合細(xì)胞的選擇培養(yǎng)技術(shù)方法細(xì)胞的形態(tài)大小細(xì)胞繁殖狀態(tài)上的差異融合細(xì)胞對(duì)溫度、藥物的敏感性、營(yíng)養(yǎng)要求不同等因奈賬督灤鴛窖卉哇輥廟淬匪鳳捧窺薛撬收橫迷賤垛得循詭稼搔塢幌嚎現(xiàn)植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合5.4.1動(dòng)物融合細(xì)胞的選擇培養(yǎng)技術(shù)方細(xì)胞的形態(tài)大小細(xì)胞繁141次黃嘌呤鳥嘌呤核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶缺失型細(xì)胞株（含有次黃嘌呤H，氨基喋呤A和胸腺嘧啶T）HGPRG-otherHAT培養(yǎng)基猩懲牙瑚求蠶久送淑弄發(fā)發(fā)墓臭竊蠢鼓詠刪退遲域梅歹霍酣芹詛恭終古跡植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合植物細(xì)胞工程課件第五章細(xì)胞融合次黃嘌呤鳥嘌呤核糖磷酸轉(zhuǎn)