生物合成青蒿酸課件

1簡(jiǎn)介1.瘧疾是一種由瘧原蟲造成的，通過瘧蚊傳播的全球性急性寄生蟲傳染病2.瘧原蟲惡性瘧原蟲具有復(fù)雜的生命周期，因而很難根除這種疾病，治療是唯一的選擇。而抗藥瘧原蟲突變系的出現(xiàn)更嚴(yán)重阻礙了對(duì)這種疾病的控制。

據(jù)WTO統(tǒng)計(jì)，2010年有2億瘧疾病例，并導(dǎo)致655000人死亡。3.青蒿素一種由我國(guó)學(xué)者在20世紀(jì)70年代初從ArtemisiaannuaL（菊科植物，俗稱青蒿）中提煉出來的倍半萜內(nèi)酯環(huán)內(nèi)過氧化物（C-15倍半萜），通過釋放高劑量的自由基殺死隱藏于紅細(xì)胞中的惡性瘧原蟲。是目前世界上最有效的治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的藥物，被世界衛(wèi)生組織稱為“治療瘧疾的最大希望”。1簡(jiǎn)介1.瘧疾2簡(jiǎn)介4.青蒿素工藝路徑人工全化學(xué)合成青蒿素由于其工藝復(fù)雜、毒副作用大、成本高而不能投入生產(chǎn)。世界上青蒿素藥物的生產(chǎn)主要依靠我國(guó)從野生和栽培青蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低(0.1%-1%

w/w),且受地域性種植影響較大。用酵母生產(chǎn)青蒿酸，再由青蒿酸合成青蒿素本文使用了半化學(xué)合成法來生產(chǎn)青蒿素。

2簡(jiǎn)介4.青蒿素工藝路徑研究人員已經(jīng)探明青蒿素是通過以下途徑在青蒿細(xì)胞內(nèi)合成的：焦磷酸法呢酯（FPP）Amorphadiene（合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前體原料）青蒿酸青蒿素青蒿素天然合成路徑由于酵母也可以合成FPP，所以我們所需要做的只是將FPP到Amorphadiene再到青蒿酸這兩個(gè)過程克隆進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)的其他與之相關(guān)的基因進(jìn)行調(diào)控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。

研究人員已經(jīng)探明青蒿素是通過以下途徑在青蒿細(xì)胞內(nèi)合成的：焦磷4酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合成鯊烯，最終獲得固醇CYP71AV1：控制一種細(xì)胞色素P450合成的酶CPR1：與CYP71AV1對(duì)應(yīng)的還原酶的表達(dá)基因4酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合5主要工作開發(fā)了一種利用純態(tài)氧（singletoxygen）將青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素的有效、可行的化學(xué)合成途徑2本文證實(shí)了青蒿酸在酵母體內(nèi)全生物合成途徑，并發(fā)現(xiàn)了一種植物脫氫酶和另一種細(xì)胞色素（CYB5）

15主要工作開發(fā)了一種利用純態(tài)氧（singleto6酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合成鯊烯，最終獲得固醇CYP71AV1：控制一種細(xì)胞色素P450合成的酶CPR1：與CYP71AV1對(duì)應(yīng)的還原酶的表達(dá)基因6酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合7Amorphadiene

合成青蒿酸途徑1.已有文獻(xiàn)指出細(xì)胞色素b5與細(xì)胞色素P450酶作用會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞色素P450酶的反應(yīng)速率。本文鑒定出一種細(xì)胞色素b5的cDNA,從而獲得編碼細(xì)胞色素b5的基因CYB5。2.近期分離出了青蒿醛脫氫酶的cDNA,并將其對(duì)應(yīng)的基因ALDH1在酵母體內(nèi)表達(dá)3.檢測(cè)到一種脫氫酶，對(duì)其純化分析，并通過ESTs、序列分析等獲得基因ADH1綜上，我們認(rèn)為有5種酶（CYP71AV1、CPR1、CYB1、ADH1和ALDH1）參與了amorphadiene氧化為青蒿酸的過程，并將其重新在酵母中構(gòu)建形成生物合成amorphadiene的完整路徑。7Amorphadiene

合成青蒿酸途徑1.已有文獻(xiàn)指出細(xì)8生物合成青蒿酸菌株改造：Y337（原始菌株，PMET3-ERG9）Y1516（PCTR3-ERG9）將控制ERG9基因表達(dá)的啟動(dòng)子PMET3替換為PCTR3Y285（PMET3-ERG9）導(dǎo)入表達(dá)CYP71AV1和CPR1基因的高拷貝質(zhì)粒Y301（PCTR3-ERG9）導(dǎo)入表達(dá)CYP71AV1和CPR1基因的高拷貝質(zhì)粒將控制ERG9基因表達(dá)的啟動(dòng)子PMET3替換為PCTR38生物合成青蒿酸菌株改造：Y337（原始菌株，PMET3-9

結(jié)果Y337產(chǎn)amorphadiene12g/LY285產(chǎn)青蒿酸3.3g/L+amorphadiene0.3g/L+青蒿酸乙酯0.18g/L（不產(chǎn)青蒿醛）Y285產(chǎn)量少，且生長(zhǎng)能力顯著變差，猜測(cè)是由細(xì)胞色素P450氧化amorphadiene，或青蒿酸的積累引起的9結(jié)果Y337產(chǎn)amorphadiene12g/L10生物合成青蒿酸菌株改造：Y657（PCTR3-ERG9）插入弱啟動(dòng)子GAL3控制CPR1的表達(dá)，并將其整合到基因組DNA上Y692（PCTR3-ERG9）將受強(qiáng)啟動(dòng)子GAL7控制的CYB5基因整合到染色體導(dǎo)入ALDH1基因Y1368（PCTR3-ERG9）Y1283（PCTR3-ERG9）Y1284（PCTR3-ERG9）敲除GAL80基因Y301（PCTR3-ERG9）導(dǎo)入ALDH1基因Y973（PCTR3-ERG9）導(dǎo)入ADH1基因10生物合成青蒿酸菌株改造：Y657插入弱啟動(dòng)子GAL3控制11

結(jié)果Y657較Y285（或Y301，是將Y285啟動(dòng)子PMET3替換為PCTR3

）細(xì)胞生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，但青蒿酸產(chǎn)量降低盡管降低CPR1的表達(dá)水平降低了青蒿酸的產(chǎn)量，總的倍半萜烯類物質(zhì)產(chǎn)量仍很高，說明低CPR1表達(dá)量增加細(xì)胞的生存能力，但減少了amorphadiene氧化物的生成速率11結(jié)果Y657較Y285（或Y301，是將Y285啟12

結(jié)果對(duì)比Y657和Y692，發(fā)現(xiàn)Y692的青蒿素、青蒿醛的產(chǎn)量均較高，總倍半萜烯類產(chǎn)物的產(chǎn)量增加了40%，說明CYB5基因的表達(dá)會(huì)提高青蒿素產(chǎn)率對(duì)比Y692和Y1368,說明ALDH1基因的表達(dá)顯著地增加了青蒿酸的產(chǎn)量，并且檢測(cè)不到產(chǎn)物青蒿醛，且菌株的生存能力顯著增加，產(chǎn)量是菌株Y285的兩倍多。對(duì)比Y1368和Y1283，青蒿酸產(chǎn)量增加了18%，說明ADH1基因的表達(dá)能增加目的產(chǎn)物產(chǎn)量12結(jié)果對(duì)比Y657和Y692，發(fā)現(xiàn)Y692的青蒿素、13添加IMP表達(dá)ALDH1基因的菌株以胞外晶體沉淀的形式生產(chǎn)青蒿酸，沉淀在初期發(fā)酵時(shí)便能觀察到，這對(duì)使得多相發(fā)酵樣品中產(chǎn)品的精確測(cè)量變得復(fù)雜。為了克服由青蒿酸結(jié)晶沉淀帶來的困難，我們利用萃取發(fā)酵溶解沉淀的現(xiàn)象，在十四酸異丙酯（IMP)環(huán)境中培養(yǎng)菌體。13添加IMP表達(dá)ALDH1基因的菌株以胞外晶體14

結(jié)果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力顯著加強(qiáng)14結(jié)果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力顯著15

結(jié)果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力顯著加強(qiáng)。同時(shí)，對(duì)Y285、Y301、Y657和Y692菌株（缺乏ALDH1和ADH1基因）而言，添加IPM會(huì)導(dǎo)致中間產(chǎn)物的析出。而對(duì)有ALDH1和ADH1基因的菌株，添加IPM會(huì)提高青蒿酸的產(chǎn)量15結(jié)果添加10%的IPM，使得所有菌株的生存能力顯著16

化學(xué)途徑1.thereductionoftheD11(13)doublebond.2.theesterificationofthecarboxylicacid.3.an‘ene-type’reactionoftheC4–C5doublebondwithsingletoxygen.4.theallylichydroperoxideundergoesanacid-catalysedHockfragmentationandrearrangementtoaffordaringopenedketo-aldehydeenol16化學(xué)途徑1.thereductionofth生物合成青蒿酸課件18簡(jiǎn)介1.瘧疾是一種由瘧原蟲造成的，通過瘧蚊傳播的全球性急性寄生蟲傳染病2.瘧原蟲惡性瘧原蟲具有復(fù)雜的生命周期，因而很難根除這種疾病，治療是唯一的選擇。而抗藥瘧原蟲突變系的出現(xiàn)更嚴(yán)重阻礙了對(duì)這種疾病的控制。

據(jù)WTO統(tǒng)計(jì)，2010年有2億瘧疾病例，并導(dǎo)致655000人死亡。3.青蒿素一種由我國(guó)學(xué)者在20世紀(jì)70年代初從ArtemisiaannuaL（菊科植物，俗稱青蒿）中提煉出來的倍半萜內(nèi)酯環(huán)內(nèi)過氧化物（C-15倍半萜），通過釋放高劑量的自由基殺死隱藏于紅細(xì)胞中的惡性瘧原蟲。是目前世界上最有效的治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的藥物，被世界衛(wèi)生組織稱為“治療瘧疾的最大希望”。1簡(jiǎn)介1.瘧疾19簡(jiǎn)介4.青蒿素工藝路徑人工全化學(xué)合成青蒿素由于其工藝復(fù)雜、毒副作用大、成本高而不能投入生產(chǎn)。世界上青蒿素藥物的生產(chǎn)主要依靠我國(guó)從野生和栽培青蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低(0.1%-1%

w/w),且受地域性種植影響較大。用酵母生產(chǎn)青蒿酸，再由青蒿酸合成青蒿素本文使用了半化學(xué)合成法來生產(chǎn)青蒿素。

2簡(jiǎn)介4.青蒿素工藝路徑研究人員已經(jīng)探明青蒿素是通過以下途徑在青蒿細(xì)胞內(nèi)合成的：焦磷酸法呢酯（FPP）Amorphadiene（合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前體原料）青蒿酸青蒿素青蒿素天然合成路徑由于酵母也可以合成FPP，所以我們所需要做的只是將FPP到Amorphadiene再到青蒿酸這兩個(gè)過程克隆進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)的其他與之相關(guān)的基因進(jìn)行調(diào)控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。

研究人員已經(jīng)探明青蒿素是通過以下途徑在青蒿細(xì)胞內(nèi)合成的：焦磷21酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合成鯊烯，最終獲得固醇CYP71AV1：控制一種細(xì)胞色素P450合成的酶CPR1：與CYP71AV1對(duì)應(yīng)的還原酶的表達(dá)基因4酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合22主要工作開發(fā)了一種利用純態(tài)氧（singletoxygen）將青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素的有效、可行的化學(xué)合成途徑2本文證實(shí)了青蒿酸在酵母體內(nèi)全生物合成途徑，并發(fā)現(xiàn)了一種植物脫氫酶和另一種細(xì)胞色素（CYB5）

15主要工作開發(fā)了一種利用純態(tài)氧（singleto23酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合成鯊烯，最終獲得固醇CYP71AV1：控制一種細(xì)胞色素P450合成的酶CPR1：與CYP71AV1對(duì)應(yīng)的還原酶的表達(dá)基因6酵母內(nèi)代謝途徑ERG9：編碼鯊烯合成酶，將2分子FPP合24Amorphadiene

合成青蒿酸途徑1.已有文獻(xiàn)指出細(xì)胞色素b5與細(xì)胞色素P450酶作用會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞色素P450酶的反應(yīng)速率。本文鑒定出一種細(xì)胞色素b5的cDNA,從而獲得編碼細(xì)胞色素b5的基因CYB5。2.近期分離出了青蒿醛脫氫酶的cDNA,并將其對(duì)應(yīng)的基因ALDH1在酵母體內(nèi)表達(dá)3.檢測(cè)到一種脫氫酶，對(duì)其純化分析，并通過ESTs、序列分析等獲得基因ADH1綜上，我們認(rèn)為有5種酶（CYP71AV1、CPR1、CYB1、ADH1和ALDH1）參與了amorphadiene氧化為青蒿酸的過程，并將其重新在酵母中構(gòu)建形成生物合成amorphadiene的完整路徑。7Amorphadiene

合成青蒿酸途徑1.已有文獻(xiàn)指出細(xì)25生物合成青蒿酸菌株改造：Y337（原始菌株，PMET3-ERG9）Y1516（PCTR3-ERG9）將控制ERG9基因表達(dá)的啟動(dòng)子PMET3替換為PCTR3Y285（PMET3-ERG9）導(dǎo)入表達(dá)CYP71AV1和CPR1基因的高拷貝質(zhì)粒Y301（PCTR3-ERG9）導(dǎo)入表達(dá)CYP71AV1和CPR1基因的高拷貝質(zhì)粒將控制ERG9基因表達(dá)的啟動(dòng)子PMET3替換為PCTR38生物合成青蒿酸菌株改造：Y337（原始菌株，PMET3-26

結(jié)果Y337產(chǎn)amorphadiene12g/LY285產(chǎn)青蒿酸3.3g/L+amorphadiene0.3g/L+青蒿酸乙酯0.18g/L（不產(chǎn)青蒿醛）Y285產(chǎn)量少，且生長(zhǎng)能力顯著變差，猜測(cè)是由細(xì)胞色素P450氧化amorphadiene，或青蒿酸的積累引起的9結(jié)果Y337產(chǎn)amorphadiene12g/L27生物合成青蒿酸菌株改造：Y657（PCTR3-ERG9）插入弱啟動(dòng)子GAL3控制CPR1的表達(dá)，并將其整合到基因組DNA上Y692（PCTR3-ERG9）將受強(qiáng)啟動(dòng)子GAL7控制的CYB5基因整合到染色體導(dǎo)入ALDH1基因Y1368（PCTR3-ERG9）Y1283（PCTR3-ERG9）Y1284（PCTR3-ERG9）敲除GAL80基因Y301（PCTR3-ERG9）導(dǎo)入ALDH1基因Y973（PCTR3-ERG9）導(dǎo)入ADH1基因10生物合成青蒿酸菌株改造：Y657插入弱啟動(dòng)子GAL3控制28

結(jié)果Y657較Y285（或Y301，是將Y285啟動(dòng)子PMET3替換為PCTR3

）細(xì)胞生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，但青蒿酸產(chǎn)量降低盡管降低CPR1的表達(dá)水平降低了青蒿酸的產(chǎn)量，總的倍半萜烯類物質(zhì)產(chǎn)量仍很高，說明低CPR1表達(dá)量增加細(xì)胞的生存能力，但減少了amorphadiene氧化物的生成速率11結(jié)果Y657較Y285（或Y301，是將Y285啟29

結(jié)果對(duì)比Y657和Y692，發(fā)現(xiàn)Y692的青蒿素、青蒿醛的產(chǎn)量均較高，總倍半萜烯類產(chǎn)物的產(chǎn)量增加了40%，說明CYB5基因的表達(dá)會(huì)提高青蒿素產(chǎn)率對(duì)比Y692和Y1368,說明ALDH1基因的表達(dá)顯著地增加了青蒿酸的產(chǎn)量，并且檢測(cè)不到產(chǎn)物青蒿醛，且菌株的生存能力顯著增加，產(chǎn)量是菌株Y285的兩倍多。對(duì)比Y1368和Y1283，青蒿酸產(chǎn)量增加了18%，說明ADH1基因的表達(dá)能增加目的產(chǎn)物產(chǎn)量12結(jié)果對(duì)比Y657和Y692，發(fā)現(xiàn)Y692的青蒿素、30添加IMP表達(dá)ALDH1基因的菌株以胞外晶體沉淀的形式生產(chǎn)青蒿酸，沉淀在初期發(fā)酵時(shí)便能