酶活性的測(cè)定課件

過(guò)氧化物酶(ＰＯＤ)活性的測(cè)定

—愈創(chuàng)木酚法一、實(shí)驗(yàn)原理過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化酚類的反應(yīng)，產(chǎn)物為醌類化合物。實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚為過(guò)氧化物酶的底物。在此酶存在下，H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化生成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470nm有最大光吸收，故可通過(guò)470nm處的吸光度變化測(cè)定過(guò)氧化物酶的活性。過(guò)氧化物酶(ＰＯＤ)活性的測(cè)定

—愈創(chuàng)木酚法1二、材料和設(shè)備１、材料：馬鈴薯塊莖

２、儀器設(shè)備：751型分光光度計(jì)、離心機(jī)、研缽、25ml容量瓶、量筒、試管、吸量管。

３、試劑：0.05ml/L愈創(chuàng)木酚溶液，0.05ml/L的磷酸緩沖液(pH5.5)，2%H2O2，0.1mol/L兒茶酚溶液，20%三氯乙酸溶液二、材料和設(shè)備１、材料：馬鈴薯塊莖2三、實(shí)驗(yàn)步驟１、酶液的制備取5.0g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放入研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于3000g水中離心10min，上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸緩沖液再提取２次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下保存?zhèn)溆谩Ｈ?、?shí)驗(yàn)步驟１、酶液的制備3２、過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系包括:2.9ml0.05mol/L磷酸緩沖液、1.0ml2%H2O2、1.0ml0.05mol/L愈創(chuàng)木酚和0.1ml酶液。以在沸水中加熱5min的酶液為對(duì)照，做二組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系加入酶液后，立即于37℃水浴中保溫15min，然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中，并加入2.0ml20%三氯乙酸終止反應(yīng)。然后，過(guò)濾(或5000g離心10min),濾液適當(dāng)稀釋，用751型分光光度計(jì)在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度。２、過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定4四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以每min內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活力單位

酶活力=——×D

酶的比活力=——×D

式中，△A為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為馬鈴薯鮮重（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；D為稀釋倍數(shù)，即提取的總酶液為反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)酶液的倍數(shù)△A0.01t△A0.01Wt四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每min內(nèi)A470變化0.05CAT過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法CAT過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法6

過(guò)氧化氫酶(HydrogenPeroxidase)又名觸酶(Catalase，CAT)，是一類以鐵卟琳為輔基的結(jié)合酶，由4個(gè)亞基組成，分子量為240000。存在于動(dòng)植物組織與細(xì)胞中的氧化還原酶類，它專一性地將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的過(guò)氧化氫分解成H2O和02，避免了H202在體內(nèi)積累，從而可維持體內(nèi)正常的活性氧水平。是最早發(fā)現(xiàn)的與種子活力有關(guān)的氧化酶類之一.過(guò)氧化氫酶(HydrogenPeroxi7過(guò)氧化氫酶的應(yīng)用：被用于食品包裝，防止食物被氧化。在紡織工業(yè)中，被用于除去紡織物上的過(guò)氧化氫，以保證成品是不含過(guò)氧化物的。它還被用在隱形眼鏡的清潔上：眼鏡在含有過(guò)氧化氫的清潔劑中浸泡后，使用前再用過(guò)氧化氫酶除去殘留的過(guò)氧化氫。近年來(lái)，過(guò)氧化氫酶開(kāi)始使用在美容業(yè)中。一些面部護(hù)理中加入了該酶和過(guò)氧化氫，目的是增加表皮上層的細(xì)胞氧量。植物細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶體參與了光呼吸（利用氧氣并生成二氧化碳）和共生性氮固定（將氮?dú)?N2）解離為活性氮原子）。細(xì)胞被病原體感染時(shí)，過(guò)氧化氫可以被用作一種有效的抗微生物試劑。其活性也與糧食品質(zhì)之間有一定的相關(guān)性，是一項(xiàng)衡量谷物品質(zhì)的重要指標(biāo)。過(guò)氧化氫酶的應(yīng)用：被用于食品包裝，防止食物被氧化。8過(guò)氧化氫酶的測(cè)定：化學(xué)測(cè)定法：高錳酸鉀滴定法，碘量法。光度法：紫外分光光度法，熒光分析法，化學(xué)發(fā)光法。電化學(xué)法：極譜氧電極法，電流測(cè)定法，電泳一染色法。放射化學(xué)測(cè)定法。簡(jiǎn)易氣量測(cè)定法。過(guò)氧化氫酶的測(cè)定：化學(xué)測(cè)定法：高錳酸鉀滴定法，碘量法。9高錳酸鉀滴定法：過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧，在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。

據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2。即可求出消耗的H2O2的量。高錳酸鉀滴定法：過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶10酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：酶活(mgH2O2/gFW·min)=

式中A—對(duì)照KMnO4滴定毫升數(shù)；B—酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)；VT—酶液總量（ml）；V1—反應(yīng)所用酶液量（ml）;W—樣品鮮重（g）；1.7—1ml0.1mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7mgH2O2。酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：11

紫外分光光度法:H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活性。以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。

過(guò)氧化氫酶活性(u/gFW/min)=

式中A240=AS0－

AS0—加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值；AS1,AS2—樣品管吸光值；Vt—粗酶提取液總體積（ml）；V1—測(cè)定用粗酶液體積（ml）；FW—樣品鮮重（g）；0.1—A240每下降0.1為1個(gè)酶活單位（u）；t—加過(guò)氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間（min）。紫外分光光度法:12方法比較：研究認(rèn)為，化學(xué)滴定法重復(fù)性差、緊密度低、操作繁瑣、檢測(cè)線低，不適于大批量的樣品測(cè)定。其優(yōu)點(diǎn)是不需要任何特殊的儀器，適用性比較廣泛。紫外分光光度法具有重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)線相對(duì)較低得到優(yōu)點(diǎn)。但是對(duì)于測(cè)定底物或產(chǎn)物改變量方面不太準(zhǔn)確。方法比較：13

總結(jié)：綜上所述，過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定的方法大都基于過(guò)氧化氫酶催化過(guò)氧化氫的分解反應(yīng)：根據(jù)反應(yīng)生成的氧氣的量、反應(yīng)剩余的過(guò)氧化氫的量或根據(jù)反應(yīng)時(shí)的電子的轉(zhuǎn)移及電流的變化等。同時(shí)，影響測(cè)定結(jié)果的因素很多，如過(guò)氧化氫的濃度、酸度、溫度及重金屬的含量等；并且各種方法的準(zhǔn)確性和靈敏度也有一定差異。因此，在測(cè)定CAT活性時(shí)，應(yīng)該根據(jù)具體組織種類及測(cè)量要求選擇適合的測(cè)定的方法?？偨Y(jié)：綜上所述，過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定的方法大都基于過(guò)氧14抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定

——在茶葉中抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定

15實(shí)驗(yàn)原理APX（抗壞血酸過(guò)氧化物酶）催化AsA與H2O2反應(yīng)而使H2O2:2AsA+H2O2→2MD-AsA(單脫氫抗壞血酸)+2H2O?？箟难徇^(guò)氧化物酶是以抗壞血酸為電子供體的，APX首先與H2O2形成中間復(fù)合物，中間復(fù)合物接著氧化AsA形成產(chǎn)物，當(dāng)AsA未被復(fù)合物利用時(shí)，APX失活。只要AsA能夠再生，APX就能充分進(jìn)行催化反應(yīng)，從而保護(hù)葉綠體維持正常的光合能力。實(shí)驗(yàn)原理APX（抗壞血酸過(guò)氧化物酶）催16

APX酶液的制備稱取0.5g的茶樹(shù)鮮葉剪碎，加入適量的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液，在冰浴中充分研磨，離心（10000g、4℃、20min）取上層清夜1mL，分裝于小離心管中置于4℃?zhèn)溆没?20℃保存。

APX酶液的制備稱取0.5g的茶樹(shù)17APX活性的測(cè)定提取液：50mmol/LPBS（磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液），pH7.8；2mmol/LAsA；5mmol/LEDTA。反應(yīng)液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5mmol/LAsA；0.1mmol/LEDTA。在三個(gè)比色皿中各加入20μL鮮葉APX粗酶液，再加入3mL反應(yīng)液；1號(hào)比色皿中不加AsA和H2O2啟動(dòng)反應(yīng)；每10s連續(xù)記錄室溫下290nm吸光值的變化X。室溫下每一分鐘氧化1μmolAsA的酶量作為一個(gè)酶活性單位（U）。APX活性的測(cè)定提取液：50mmol/LPBS（磷酸氫二鉀-18計(jì)算公式每克鮮葉APX的酶活性U=（X×7.5×1000×60×1000）/（m×2.8×20×10）上式中，X：OD值的變化；7.5：每克材料提取7.5mL粗酶液；1000：將ml轉(zhuǎn)化成μL；60：將1min轉(zhuǎn)化成60s；1000：將mmol轉(zhuǎn)化成μmol；m：鮮葉的重量，單位為g；2.8：吸光系數(shù)mmol/Lcm；20：用20μL酶液進(jìn)行活性測(cè)定；10：每10s記錄吸光值的變化。計(jì)算公式每克鮮葉APX的酶活性U=（X×7.5×1000×619測(cè)定茶樹(shù)鮮葉APX活性的最佳條件

PVPP的加入量為鮮葉重的1.5倍，提取液pH為7.8，反應(yīng)液pH為7.0，底物AsA濃度為0.5mmol/L。測(cè)定茶樹(shù)鮮葉APX活性的最佳條件PVPP的加入量為鮮20注意事項(xiàng)：（1）由于測(cè)定反應(yīng)是通過(guò)測(cè)定反應(yīng)底物AsA的降低來(lái)計(jì)算APX活性，因此所加的酶量一般不宜過(guò)大，應(yīng)使加液量控制在60s內(nèi)，使產(chǎn)生的A290光值下降呈良好的線性關(guān)系。（2）由于此反應(yīng)中AsA和H2O2量都很少，可以將30%的H2O2稀釋500倍，在測(cè)定時(shí)直接吸取15μL的H2O2與3mL反應(yīng)液將加入到比色皿中，啟動(dòng)反應(yīng)。（3）H2O2由于本身對(duì)AsA的氧化作用在測(cè)定時(shí)間內(nèi)可以忽略不計(jì)。注意事項(xiàng)：（1）由于測(cè)定反應(yīng)是通過(guò)測(cè)定反應(yīng)底物AsA的降低來(lái)21超氧化物歧化酶（SOD）的活性測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）的活性測(cè)定22黃嘌呤氧化酶法原理:通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。黃嘌呤氧化酶法原理:通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧23實(shí)驗(yàn)試劑：

硫酸鹽緩沖液，鹽酸羥胺，黃嘌呤，黃嘌呤氧化酶，醋酸等。實(shí)驗(yàn)試劑：24實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：25計(jì)算方法：每毫升反應(yīng)液中SOD抑止率達(dá)50％時(shí)對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U），待測(cè)樣品中的SOD活力由下式計(jì)算：SOD抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100%SOD活力（U/ml）＝（A2-A1）/A2×100%÷50％×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)式中：A1:測(cè)定管的吸光值；A2:空白管的吸光值。計(jì)算方法：每毫升反應(yīng)液中SOD抑止率達(dá)50％時(shí)對(duì)應(yīng)的SOD26鄰苯三酚自氧化法原理：

在堿性條件下,鄰苯三酚迅速氧化釋放出超氧化物陰離子，生成有色中間產(chǎn)物，吸光度隨之增加，使吸光度值與反應(yīng)時(shí)間呈良好的線性關(guān)系。SOD加入鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系后，催化超氧化物陰離子生成過(guò)氧化氫，使有色中間產(chǎn)物的生成受阻，導(dǎo)致吸光值下降，鄰苯三酚自氧化速率降低，可作為測(cè)定SOD活性的理論依據(jù)。鄰苯三酚自氧化法原理：在堿性條件下,鄰苯三酚迅速氧化釋放271.試劑：

0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.2內(nèi)含2mmol/LEDTA)0.2mol/L（Tris）三羥甲基氨基甲烷(內(nèi)含4mmol/L乙二胺四乙酸EDTA)100ml與0.2mol/LHCl44.76ml混合加雙蒸水至200ml調(diào)pH8.2±0.01;鄰苯三酚(45mmol/L)以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液存放于冰箱備用。2.儀器:紫外分光光度計(jì)，酸度計(jì)，恒溫水浴鍋1.試劑：0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH28實(shí)驗(yàn)步驟：（1）.鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定：在試管中加入4.5ml50mmol/LTris緩沖溶液，于25℃保溫20min,加入10～20ul30mmol/L鄰苯三酚，立即計(jì)時(shí)并搖勻，傾于比色杯內(nèi)，于325nm下，每隔1min測(cè)吸光值一次，空白以10mmol/LHCl代替鄰苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070OD/min左右。

實(shí)驗(yàn)步驟：（1）.鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定：29.SOD活性測(cè)定：

將樣液加入到Tris緩沖溶液中，其余步驟同自氧化速率測(cè)定方法。活力單位定義：將一定條件下使每毫升反應(yīng)液自氧化速率抑制50%的酶量定義為一個(gè)單位（u）。.SOD活性測(cè)定：30過(guò)氧化物酶(ＰＯＤ)活性的測(cè)定

—愈創(chuàng)木酚法一、實(shí)驗(yàn)原理過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化酚類的反應(yīng)，產(chǎn)物為醌類化合物。實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚為過(guò)氧化物酶的底物。在此酶存在下，H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化生成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470nm有最大光吸收，故可通過(guò)470nm處的吸光度變化測(cè)定過(guò)氧化物酶的活性。過(guò)氧化物酶(ＰＯＤ)活性的測(cè)定

—愈創(chuàng)木酚法31二、材料和設(shè)備１、材料：馬鈴薯塊莖

２、儀器設(shè)備：751型分光光度計(jì)、離心機(jī)、研缽、25ml容量瓶、量筒、試管、吸量管。

３、試劑：0.05ml/L愈創(chuàng)木酚溶液，0.05ml/L的磷酸緩沖液(pH5.5)，2%H2O2，0.1mol/L兒茶酚溶液，20%三氯乙酸溶液二、材料和設(shè)備１、材料：馬鈴薯塊莖32三、實(shí)驗(yàn)步驟１、酶液的制備取5.0g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放入研缽中。加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于3000g水中離心10min，上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸緩沖液再提?。泊危锨逡翰⑷肴萘科恐?，定容至刻度，低溫下保存?zhèn)溆?。三、?shí)驗(yàn)步驟１、酶液的制備33２、過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系包括:2.9ml0.05mol/L磷酸緩沖液、1.0ml2%H2O2、1.0ml0.05mol/L愈創(chuàng)木酚和0.1ml酶液。以在沸水中加熱5min的酶液為對(duì)照，做二組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系加入酶液后，立即于37℃水浴中保溫15min，然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中，并加入2.0ml20%三氯乙酸終止反應(yīng)。然后，過(guò)濾(或5000g離心10min),濾液適當(dāng)稀釋，用751型分光光度計(jì)在470nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度。２、過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定34四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以每min內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活力單位

酶活力=——×D

酶的比活力=——×D

式中，△A為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為馬鈴薯鮮重（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；D為稀釋倍數(shù)，即提取的總酶液為反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)酶液的倍數(shù)△A0.01t△A0.01Wt四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每min內(nèi)A470變化0.035CAT過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法CAT過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定方法36

過(guò)氧化氫酶(HydrogenPeroxidase)又名觸酶(Catalase，CAT)，是一類以鐵卟琳為輔基的結(jié)合酶，由4個(gè)亞基組成，分子量為240000。存在于動(dòng)植物組織與細(xì)胞中的氧化還原酶類，它專一性地將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的過(guò)氧化氫分解成H2O和02，避免了H202在體內(nèi)積累，從而可維持體內(nèi)正常的活性氧水平。是最早發(fā)現(xiàn)的與種子活力有關(guān)的氧化酶類之一.過(guò)氧化氫酶(HydrogenPeroxi37過(guò)氧化氫酶的應(yīng)用：被用于食品包裝，防止食物被氧化。在紡織工業(yè)中，被用于除去紡織物上的過(guò)氧化氫，以保證成品是不含過(guò)氧化物的。它還被用在隱形眼鏡的清潔上：眼鏡在含有過(guò)氧化氫的清潔劑中浸泡后，使用前再用過(guò)氧化氫酶除去殘留的過(guò)氧化氫。近年來(lái)，過(guò)氧化氫酶開(kāi)始使用在美容業(yè)中。一些面部護(hù)理中加入了該酶和過(guò)氧化氫，目的是增加表皮上層的細(xì)胞氧量。植物細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶體參與了光呼吸（利用氧氣并生成二氧化碳）和共生性氮固定（將氮?dú)?N2）解離為活性氮原子）。細(xì)胞被病原體感染時(shí)，過(guò)氧化氫可以被用作一種有效的抗微生物試劑。其活性也與糧食品質(zhì)之間有一定的相關(guān)性，是一項(xiàng)衡量谷物品質(zhì)的重要指標(biāo)。過(guò)氧化氫酶的應(yīng)用：被用于食品包裝，防止食物被氧化。38過(guò)氧化氫酶的測(cè)定：化學(xué)測(cè)定法：高錳酸鉀滴定法，碘量法。光度法：紫外分光光度法，熒光分析法，化學(xué)發(fā)光法。電化學(xué)法：極譜氧電極法，電流測(cè)定法，電泳一染色法。放射化學(xué)測(cè)定法。簡(jiǎn)易氣量測(cè)定法。過(guò)氧化氫酶的測(cè)定：化學(xué)測(cè)定法：高錳酸鉀滴定法，碘量法。39高錳酸鉀滴定法：過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過(guò)氧化氫分解為水和分子氧，在此過(guò)程中起傳遞電子的作用，過(guò)氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。

據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2。即可求出消耗的H2O2的量。高錳酸鉀滴定法：過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶40酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：酶活(mgH2O2/gFW·min)=

式中A—對(duì)照KMnO4滴定毫升數(shù)；B—酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)；VT—酶液總量（ml）；V1—反應(yīng)所用酶液量（ml）;W—樣品鮮重（g）；1.7—1ml0.1mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7mgH2O2。酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示：41

紫外分光光度法:H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活性。以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。

過(guò)氧化氫酶活性(u/gFW/min)=

式中A240=AS0－

AS0—加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值；AS1,AS2—樣品管吸光值；Vt—粗酶提取液總體積（ml）；V1—測(cè)定用粗酶液體積（ml）；FW—樣品鮮重（g）；0.1—A240每下降0.1為1個(gè)酶活單位（u）；t—加過(guò)氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間（min）。紫外分光光度法:42方法比較：研究認(rèn)為，化學(xué)滴定法重復(fù)性差、緊密度低、操作繁瑣、檢測(cè)線低，不適于大批量的樣品測(cè)定。其優(yōu)點(diǎn)是不需要任何特殊的儀器，適用性比較廣泛。紫外分光光度法具有重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)線相對(duì)較低得到優(yōu)點(diǎn)。但是對(duì)于測(cè)定底物或產(chǎn)物改變量方面不太準(zhǔn)確。方法比較：43

總結(jié)：綜上所述，過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定的方法大都基于過(guò)氧化氫酶催化過(guò)氧化氫的分解反應(yīng)：根據(jù)反應(yīng)生成的氧氣的量、反應(yīng)剩余的過(guò)氧化氫的量或根據(jù)反應(yīng)時(shí)的電子的轉(zhuǎn)移及電流的變化等。同時(shí)，影響測(cè)定結(jié)果的因素很多，如過(guò)氧化氫的濃度、酸度、溫度及重金屬的含量等；并且各種方法的準(zhǔn)確性和靈敏度也有一定差異。因此，在測(cè)定CAT活性時(shí)，應(yīng)該根據(jù)具體組織種類及測(cè)量要求選擇適合的測(cè)定的方法?？偨Y(jié)：綜上所述，過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定的方法大都基于過(guò)氧44抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定

——在茶葉中抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性測(cè)定

45實(shí)驗(yàn)原理APX（抗壞血酸過(guò)氧化物酶）催化AsA與H2O2反應(yīng)而使H2O2:2AsA+H2O2→2MD-AsA(單脫氫抗壞血酸)+2H2O?？箟难徇^(guò)氧化物酶是以抗壞血酸為電子供體的，APX首先與H2O2形成中間復(fù)合物，中間復(fù)合物接著氧化AsA形成產(chǎn)物，當(dāng)AsA未被復(fù)合物利用時(shí)，APX失活。只要AsA能夠再生，APX就能充分進(jìn)行催化反應(yīng)，從而保護(hù)葉綠體維持正常的光合能力。實(shí)驗(yàn)原理APX（抗壞血酸過(guò)氧化物酶）催46

APX酶液的制備稱取0.5g的茶樹(shù)鮮葉剪碎，加入適量的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液，在冰浴中充分研磨，離心（10000g、4℃、20min）取上層清夜1mL，分裝于小離心管中置于4℃?zhèn)溆没?20℃保存。

APX酶液的制備稱取0.5g的茶樹(shù)47APX活性的測(cè)定提取液：50mmol/LPBS（磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液），pH7.8；2mmol/LAsA；5mmol/LEDTA。反應(yīng)液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5mmol/LAsA；0.1mmol/LEDTA。在三個(gè)比色皿中各加入20μL鮮葉APX粗酶液，再加入3mL反應(yīng)液；1號(hào)比色皿中不加AsA和H2O2啟動(dòng)反應(yīng)；每10s連續(xù)記錄室溫下290nm吸光值的變化X。室溫下每一分鐘氧化1μmolAsA的酶量作為一個(gè)酶活性單位（U）。APX活性的測(cè)定提取液：50mmol/LPBS（磷酸氫二鉀-48計(jì)算公式每克鮮葉APX的酶活性U=（X×7.5×1000×60×1000）/（m×2.8×20×10）上式中，X：OD值的變化；7.5：每克材料提取7.5mL粗酶液；1000：將ml轉(zhuǎn)化成μL；60：將1min轉(zhuǎn)化成60s；1000：將mmol轉(zhuǎn)化成μmol；m：鮮葉的重量，單位為g；2.8：吸光系數(shù)mmol/Lcm；20：用20μL酶液進(jìn)行活性測(cè)定；10：每10s記錄吸光值的變化。計(jì)算公式每克鮮葉APX的酶活性U=（X×7.5×1000×649測(cè)定茶樹(shù)鮮葉APX活性的最佳條件

PVPP的加入量為鮮葉重的1.5倍，提取液pH為7.8，反應(yīng)液pH為7.0，底物AsA濃度為0.5mmol/L。測(cè)定茶樹(shù)鮮葉APX活性的最佳條件PVPP的加入量為鮮50注意事項(xiàng)：（1）由于測(cè)定反應(yīng)是通過(guò)測(cè)定反應(yīng)底物AsA的降低來(lái)計(jì)算APX活性，因此所加的酶量一般不宜過(guò)大，應(yīng)使加液量控制在60s內(nèi)，使產(chǎn)生的A290光值下降呈良好的線性關(guān)系。（2）由于此反應(yīng)中AsA和H2O2量都很少，可以將30%的H2O2稀釋500倍，在測(cè)定時(shí)直接吸取15μL的H2O2與3mL反應(yīng)液將加入到比色皿中，啟動(dòng)反應(yīng)。（3）H2O2由于本身對(duì)AsA的氧化作用在測(cè)定時(shí)間內(nèi)可以忽略不計(jì)。注意事項(xiàng)：（1）由于測(cè)定反應(yīng)是通過(guò)測(cè)定反應(yīng)底物AsA的降低來(lái)51超氧化物歧化酶（SOD）的活性測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）的活性測(cè)定52黃嘌呤氧化酶法原理:通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光