基因診斷試劑

基因診斷試劑產(chǎn)品和當前國內(nèi)外正在大力研究開發(fā)的基因芯片產(chǎn)PCR產(chǎn)品靈敏度高、特異性強、診斷窗口期短，可進行定性、定量但成本高、開發(fā)難度大，目前產(chǎn)品種類很少，只用于科研和藥物篩選等用途。因此、診斷試劑的高端化是未來發(fā)展的必然趨勢，預計基因診斷25%。核酸診斷技術（PCR）疾控系列核酸診斷試劑炭疽桿菌(BA)核酸檢測試劑盒(PCR炭疽桿菌(BA)核酸擴增檢測試劑盒鼠疫桿菌(YP)核酸檢測試劑盒(PCR鼠疫桿菌(YP)核酸擴增檢測試劑盒腦膜炎奈瑟菌通用型(NM-U)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)腦膜炎奈瑟菌通用型(NM-U)核酸擴增檢測試劑盒A(NM-A)核酸檢測試劑盒(PCRA(NM-A)核酸擴增檢測試劑盒C群(NM-C)核酸檢測試劑盒(PCRC群(NM-C)核酸擴增檢測試劑盒登革熱病毒Ⅰ型(DFV-U)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)登革熱病毒Ⅰ型(DFV-U)核酸擴增檢測試劑盒(RT-PCR法)登革熱病毒Ⅰ型(DFV-Ⅰ)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)登革熱病毒Ⅰ型(DFV-Ⅰ)核酸擴增檢測試劑盒(RT-PCR法)(PCR-熒光探針法)登革熱病毒Ⅱ型(DFV-Ⅱ)核酸擴增檢測試劑盒(RT-PCR法)漢坦病毒通用型(HTV-U)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)漢坦病毒通用型(HTV-U)核酸擴增檢測試劑盒(RT-PCR法)漢坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)漢坦病毒Ⅰ型(HTV-Ⅰ)核酸擴增檢測試劑盒(RT-PCR法)漢坦病毒Ⅱ型(HTV-Ⅰ)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)漢坦病毒Ⅱ型(HTV-Ⅰ)核酸擴增檢測試劑盒(RT-PCR法)麻疹病毒(MV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)麻疹病毒(MV)核酸擴增檢測試劑盒(RT-PCR)嗜肺軍團桿菌(LP)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)嗜肺軍團桿菌(LP)核酸擴增檢測試劑盒綠膿桿菌(PA)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)綠膿桿菌(PA)核酸擴增檢測試劑盒EV71(PCREV71(RT-PCR)EV71/A16核酸擴增檢測試劑盒(RT-PCR腸道病毒通用型/EV71/A16A16型(CAV-16)核酸檢測試劑盒(PCRA16(CAV-16)核酸檢測試劑盒(RT-PCR)臨床檢驗系列核酸診斷試劑：甲型肝炎病毒(HAV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)乙型肝炎病毒(HBV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)丙型肝炎病毒(HCV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)庚型肝炎病毒(HGV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)乙型?炎病毒cccDNA(HBV-cccDNA)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)乙型?炎病毒拉米夫定耐藥(HBV-YMDD)核酸檢測試劑盒(PCR乙型?炎病毒基因分型(HBV-A/B/C)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)沙眼衣原體(CT)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)解脲脲原體(UU)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)淋球菌(NG)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)人類免疫缺陷病毒(HIV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)人乳頭瘤病毒6,11型(HPV-6,11(PCR-熒光探針法)16,18(HPV-16,18(PCR-熒光探針法)人乳頭瘤病毒高危型(HR-HPV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)梅毒螺旋體(TP)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)白色念珠菌(CAN)核酸檢測試劑盒(PCR生殖道支原體通用型(MG-U)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)單純皰疹病毒通用型(HSV-U)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)結核桿菌(TB)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)肺炎支原體(MP)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)呼吸道合胞病毒(RSV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)DNARNA，反映核酸的結構和功能。檢測的基因有內(nèi)源性（即機體自身的基因）和外源性（如病毒、細菌等）診斷基因有無病變，后者用于診斷有無病原體感染?；蛟\斷的主要技術有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應、恒溫擴增、基因測序和生物芯片技術等。．核酸分子雜交技術原理：具有一定互補序列和核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補配對原則締用該技術可對特定DNARNA序列進行定性或定量檢測?；蛱结樇捌錁擞洠夯蛱结樖且欢闻c待測DNARNA可以是DNA或RNA，長度不一，可為完整基因，也可為其中一部分。根據(jù)探針的來源和性質(zhì)分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針。作為探針至少必須滿足兩個條件，一是應為單鏈（或通過變性形成單鏈） ，二是應帶有可示蹤和檢測的標記。有了合適的探針，就有可能檢測出目的基因，觀察有無突變，也可根據(jù)探針的結合量進行定量檢測。選擇探針最基本的原則是要有高度特異性，其次也需考慮到制備探針的難易性和檢測手段的靈敏性等其他因素。常用核酸分子雜交技術： ①Southern印跡雜交；②Northern印跡雜交；③斑點雜交（dotblotting；④原位雜交（in-situhybridization ；⑤夾心雜交（三明治雜交）液相雜交。．聚合酶鏈反應 (PCR)核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana 于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆 tRNA基因”1983年的一天，美國科學家KaryMulis驅(qū)車在蜿蜒的州際高速公路上行駛中，孕育出了PCR技術的原型。他在實驗上證明了PCR的構想，并于1985年申請了有關PCR第一個專利，在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學術論文。從此PCR技術得到了生命科學界的普遍認可，Kary Mulis也因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點是酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。 1988年Saiki等人從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱DNA聚合酶，克服了這個缺點，從而使 PCR技術得到了廣泛的應用，也使PCR成為遺傳與分子分析的根本性基石。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，PCR缺少的手段，是一種極為敏感的放大系統(tǒng)。相比于傳統(tǒng)的臨床診斷方法，核酸診斷是分子水平上的診斷技術，可以彌補傳統(tǒng)臨床診斷方法的某些缺陷，比如，核酸診斷能直接揭示病原體的存在，能客觀反映病原體在人體內(nèi)感染及活動情況，可以作為臨床治療中的一個有效監(jiān)控手段，另外采用核酸診斷技術還可以檢測到常規(guī)檢測方法難以檢測到的病原體，例如可以克服酶免檢測技術中從感染到抗體產(chǎn)生的窗口期問題。因此，以 PCR技術為代表的核酸診斷技術在臨床診斷中得到日益廣泛的應用。恒溫擴增恒溫擴增技術主要包括鏈置換擴增法(stranddisplacementamplification,SDA) 、核酸序列擴增法(nucleic acid sequence-based amplification ,NASBA) 、轉(zhuǎn)錄介導擴增法( Transcription Mediated Amplification , TMA) 和滾環(huán)擴增法(RollingCircleAmplification ,RCA) 以及環(huán)介導等溫擴增法(Loop-mediated isothermal amplification LAMP)等。LAMP是Notomi 等在2000 年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法,即環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP), 其特點是針對靶基因的6個區(qū)設計4 種特異引物,利用一種鏈置換 DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等溫條件(65℃左右)保溫幾十分鐘,即可完成核酸擴增反應。不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。LAMP 是一種嶄新的DNA擴增方法,具有簡單、快速、特異性強的特點,具有替代PCR 方法的可能性。醫(yī)學基因測序又稱為再測序（Re?sequencing，基于[1分薄弱，其原因之一在于臨床病理基因診斷的操作技術復雜、知識基礎不足。目前，美國癌癥基因組計劃已涉及到癌癥的全基因組突變、病理形態(tài)類型的基因標記分類、癌癥的病理基因檢測指導治療。美國ABI 所屬的Celera公司目前已生產(chǎn)了3萬多種不同的醫(yī)學基因測序診斷試劑盒及與其相匹配的全基因組軟件 —Seq?Scap V2.0及相關SOP ，在很大程度上自動、準確地完成數(shù)萬種不同類型的基因測序、突變檢測。臨床基因測序檢測對病理科的形態(tài)診斷金標準含金量的提升和分子病理技術的開發(fā)及經(jīng)濟效益改善有現(xiàn)實意義。2年多來，我們完成了十多種病理基因測序及片段分析共 1100例的檢測，體會如下：組織和血液DNA抽提成功率100％，石蠟標本首次抽提成功率80％，關鍵環(huán)在于選用DNA抽提試劑盒，用中性甲醛固定時間<48 h，充分洗脫甲醛且消化徹底；結果顯示基線平整，各堿基平均信號強度（ AveSignalIntensity ）在200~1000 之間，噪音（Noise）<５，Raw基線接近［1（基因測序結果如圖1~3；測序質(zhì)量控制要點：模板DNA質(zhì)量要高；PCR要求條帶單一，但拷貝量要求不高；PCR產(chǎn)物一定要經(jīng)過純處理，測序反應后推薦用酒精/NaAc 法再純化；電泳毛細管需定期養(yǎng)護和灌膠；通過檢測腫瘤及相關基因的序列，總結出開展基因測序項目在病理外檢中有如下幾點臨床應用意義：對于可疑癌前病變患者可以明確其病變標本是否真正含有候選基因的突變，以解除大量由免疫組化標記癌基因陽性患者的心理恐慌和經(jīng)濟負擔［2。對病理切片平面局部未能反映的淋巴結轉(zhuǎn)移，通過全淋巴結組織DNA溶膠K?RAS癌基因測序，輔助檢測臨床微轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。鑒定心腦血管疾病APOE基因多態(tài)性6種基因表型，ε4脂血癥、冠心病、腦血管病和老年性癡呆有關。對癌癥家族有血緣關系的親屬檢測相關癌基因突變或多態(tài)性，具有亞健康診斷和體檢意義。對腫瘤分子靶向藥物治療檢測C?kit［3］和EGFR18、19、21外顯子突變具有癌癥治療的積極意義［4~7。YMDD突變檢測乙肝病毒對拉米呋定的耐藥性。生物芯片又稱 DNA芯片或基因芯片它們是DNA雜交[2]探針技術與半導體工業(yè)技術相結合的結晶。該技術系指將大量探針分子固定于支持物上后與帶熒光標記的DNA樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。生物芯片技術起源于核酸分子雜交。所謂生物芯片一般指高密度固定在互相支持介質(zhì)上的生物信息分子（如基因片段、CDNA 片段或多肽、蛋白質(zhì)）的微陣列雜交型芯（micro-arrays陣。微流控芯片（