高一生物格羅寶爾集成墻飾細胞凋亡

高一生物格羅寶爾集成墻飾細胞凋亡一.細胞凋亡的研究歷史1.

凋亡概念的形成和形態(tài)學的研究(1972）1972年Kerr等在英國癌癥雜志發(fā)表論文，首次提出細胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了對細胞凋亡的真正探索的開始。2．DNA的降解和內源性核酸內切酶的參與。(1987）3.蛋白質水解酶活化的研究(1995)4.細胞膜的變化(1997)5.線粒體的變化和分子生物學的研究(1998-)1)相關基因及調控2）信號轉導3）各種分子及其相互作用及相互關系4）疾病機制的闡明，以及新療法的探索及問世。

二.概念

細胞凋亡是能量依賴的細胞內死亡程序活化而致的細胞自殺，由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程。細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）

PCD最初是1956年發(fā)育生物學中提出的概念，是個功能性概念，強調的是其分子生物學和生理功能，一般指生理性細胞死亡。描述在一個多細胞生物體中某些細胞死亡是個體發(fā)育中的一個預定的，并受到嚴格程序控制的正常組成部分。細胞凋亡與壞死的區(qū)別

細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別特征細胞凋亡細胞壞死誘導因素生理及弱刺激強烈刺激受累范圍單個細胞丟失成群細胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細胞體積減少、固縮增大腫脹染色質凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細胞器無明顯變化腫張破壞溶酶體保持完整破壞外溢細胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機降解大分子合成一般需要不需要基因調控有無后果不引起炎癥反應引起炎癥反應意義生理死亡方式病理死亡方式三.細胞凋亡的生物學特征形態(tài)學變化生物化學變化

DNA片段化大分子的合成

tTG（組織轉谷氨酰胺酶）的積累并達到較高的水平。

細胞凋亡的形態(tài)特征（1）凋亡的起始；微絨毛的消失，細胞間接觸的消失，與周圍的細胞脫離，細胞質中，線拉體大體完整，染色質固縮，（2）細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，（3）凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞膜所包圍。（4）凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。

細胞凋亡DNA的片段化演示文稿1

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后

等格羅寶爾集成墻飾亞叀夻格羅寶爾集成墻飾四.細胞凋亡的過程及機理

接受凋亡信號凋亡調控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的級聯(lián)反應細胞凋亡的兩條通路：膜受體通路、線粒體通路膜受體的信號轉導參與死亡受體信號轉導的接頭蛋白：（死亡結構域蛋白deathdomainprotein）TRADD：TNF受體相關死亡結構域蛋白TNF+TNFRI（死亡結構域）+TRADD—細胞凋亡FADD：Fas相關死亡結構域蛋白FasL+Fas（死亡結構域）

+FADD—細胞凋亡RIP：受體相互作用蛋白CRADD：含有死亡結構域的caspase和RIP接頭蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡結構域蛋白(一)細胞凋亡的膜受體通路FASL+FAS+FADD

凋亡誘導復合物（DISC）胞質中游離的caspase8聚集到這個復合物上細胞有足夠caspase8細胞caspase8濃度不夠死亡受體活化，切割BidtBid從胞質到線粒體細胞凋亡

CtyC釋放線粒體與細胞凋亡線粒體參與細胞凋亡或壞死的途徑釋放caspase活化因子細胞色素C：細胞色素C+Apaf-1+caspase9—凋亡體AIF（凋亡誘導因子）Caspase3Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子

(二)線粒體通路

五.凋亡的效應分子

細胞凋亡的分子機制雖然還不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用，細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應過程。半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽鍵，因此又稱之為Caspases(取英文CysteineC，asparticacid，Asp，proteases的詞頭)Caspase家族的結構與分類ICE亞類Caspase蛋白酶：ICE是單核細胞來源的參與成熟的一種蛋白酶，參與凋亡但不起主要作用；Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11Caspase12，Caspase13，Caspase14。凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase2，Caspase9，Caspase10。凋亡效應亞類Caspase蛋白酶：Caspase3，Caspase6，Caspase7Caspase家族的特點

以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和異源活化,活化后形成四聚體的蛋白水解酶，發(fā)揮生物學作用

C端同源區(qū)存在半光氨酸激活位點

Caspase分：啟動酶和效應酶

Caspase活化機制：

Caspase的活化是有順序的多步水解的過程，雖然分子各異，但是它們活化的過程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，并進而形成兩兩組成的有活性的四聚體,Caspase的效應機制

凋亡細胞的特征性表現(xiàn)，包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質濃縮，細胞膜活化，細胞皺縮，最后形成由細胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細胞所吞噬。破壞細胞抗凋亡因素破壞細胞結構影響核酸的結構與功能破壞細胞抗凋亡因素正?；罴毎蚝怂崦柑幱跓o活性狀態(tài)，這是由于核酸酶和抑制物結合在一起，如抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化。現(xiàn)知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonuleaseCAD），而把它的抑制物稱為ICAD。有意義的是CAD只在ICAD存在時才能合成并顯示活性，因而ICAD對CAD的活化與抑制是必需要的。

破壞細胞結構

Caspase可直接破壞細胞結構，如裂解核纖層，核纖層（Lamin）是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結構，使染色質（chromatin）得以形成并進行正常的排列。在細胞發(fā)生凋亡時，核纖層蛋白作為底物被Caspase裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導致細胞染色質的固縮。6影響核酸的結構與功能Caspase可作用于多種與DNA，RNA功能有關的蛋白如滅活或下調與DNA修復有關的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細胞的增殖與復制受阻并發(fā)生凋亡。六.細胞凋亡的調節(jié)

1.Bcl-2家族（Bcelllymphoma/leukemia-2）B細胞淋巴瘤/白血病-2)Bc1-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延長細胞的生存，能抑制細胞凋亡,而不是促進細胞的增殖。

Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)15個成員，所有Bcl-2家族成員均含有1個或多個BH結構域。蛋白含有4個Bcl-2同源結構域，依次命名為BHl、BH2、BH3和BH4?？煞譃?個亞族：Bcl-2亞家族：Bcl-2Bcl-xlBcl-w、Mcl-1、A1。Bcl-2亞家族成員對細胞凋亡起抑制作用

Bax亞家族：Bax、Bak、Bok，它們的作用與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進細胞凋亡。

BH3亞家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；僅有BH3結構域。它們的作用也與Bcl-2亞家族的作用相反，可促進細胞凋亡。

作用機制：影響APAF1的功能影響線粒體的結構與功能2.VDAC和ANT

是線粒體外膜上最為豐富的兩種蛋白。最近有一些研究工作表明，WDAC和ANT可與Bc1-2家族蛋白相互作用，在細胞凋亡過程中介導對線粒體的損傷。VDAC本身是一種通道蛋白，它與Bax的結合可使共通道性能發(fā)生某種變化，這樣一些凋亡蛋白如cytC就可通過。因為這兩種蛋白在跨越線粒體膜的核苷酸和小分子轉運中起作用，所以它們與Bax的結合可能與細胞凋亡過程中線粒體ATP/ADP轉化和磷酸肌酸外運的抑制有關。3.P53與細胞凋亡

P53是腫瘤抑制基因，其產物主要存在于細胞核內。P53基因是人類腫瘤有關基因中突變頻率最高的基因。在依賴P53蛋白的細胞凋亡中，P53基因是通過調節(jié)Bc1-2和Bax基因的表達來影響細胞凋亡的。P53蛋白能特異地抑制Bc1-2的表達，相反對Bax的表達則有明顯的促進作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的轉錄活化因子。在這些細胞中，P53蛋白的積累和活動引起了細胞凋亡。4.IAP（inhibitorofapoptosis，細胞凋亡抑制因子）

IAP超家族的成員較多，如c-IAP1,c-IAP2,XIAP,NIAP和Survivin，新的成員在不斷的被發(fā)現(xiàn)。IAP家族成員有一個共同的特征，含有一個或多個７０個氨基酸的重復序列（BIR），類似于zinc指狀的結構。c-IAP1、c-IAP2和XIAP含有環(huán)指裝結構。BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導對caspase的抑制作用，而環(huán)指狀結構則具有泛素化蛋白連接酶的作用，介導caspase－３和－７的泛素化降解作用。5.Smac/Dablo

在細胞凋亡過程中它可以從線粒體釋放進入細胞質。成熟的Smac蛋白產生一個新的N基端,這個N基端的前面4個氨基酸可以與lAP的BIR結構域結合。Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結合。Smac與BIR2的結合可以中和XlAP對胱解酶9的抑制，促進凋亡。

七.細胞凋亡的生物學意義細胞凋亡與個體發(fā)育細胞凋亡與免疫細胞凋亡與人類疾病免疫細胞凋亡胸腺細胞成熟過程中的凋亡陽性選擇陰性選擇激活誘導的細胞凋亡：（activation-inducedcelldeath，AICD）

CTL誘導靶細胞的凋亡：穿孔素介導的靶細胞死亡

Fas介導的靶細胞凋亡B細胞凋亡:經(jīng)過基因重排,92%的細胞凋亡

細胞凋亡與人類疾病細胞凋亡受抑制有關的疾病

惡性腫瘤:濾泡性淋巴瘤、乳腺癌、等白血病自身免疫性疾病：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎病毒感染性疾?。合俨《静?、庖疹病毒病細胞凋亡增多有關的疾病

艾滋?。荷窠?jīng)變性性疾?。涸缋闲赃t呆、帕金森病、小腦退化病骨髓發(fā)育不全性疾病缺血性疾病酒精中毒性肝炎八.細胞凋亡的檢測方法.一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測.二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）三、線粒體膜勢能（mt）的檢測四、DNA片斷化檢測

五、TUNEL法六、Caspase-3活性的檢測

七、WB檢測八、凋亡相關蛋白TFAR19的表達和細胞定位分析

細胞凋亡的形態(tài)學檢測

1光學顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質的形態(tài)學改變來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。3電子顯微鏡觀察NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess（488nm400）電鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期的細胞核內染色質高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結構。細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。磷脂酰絲氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內側，在凋亡早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞