Chapter離子交換和體積排除色譜

液相色譜基礎(chǔ)離子交換與體積排除色譜吸附/分配色譜離子交換色譜（IEC）原理保留的影響因素例子體積排除色譜（SEC）原理校正曲線凝膠過濾與凝膠滲透影響保留的因素例子離子交換色譜的機(jī)制離子交換平衡離子交換的類型強(qiáng)弱強(qiáng)交換劑在pH2至12的范圍內(nèi)保持離子狀態(tài)弱交換劑在pH改變時(shí)可能會(huì)變?yōu)榉请x子化狀態(tài)硅膠型的離子交換劑優(yōu)點(diǎn) 高柱效小顆粒沒有收縮或膨脹機(jī)械穩(wěn)定性好能耐受有機(jī)溶劑價(jià)格低缺點(diǎn)2<pH<7低容量（meg/g）聚合物基礎(chǔ)上的離子交換聚苯乙烯－二乙烯基苯的合成（PSDVB）其他聚合物基礎(chǔ)上的離子交換例,甲基丙烯酸酯離子交換樹脂的合成聚合物基質(zhì)的離子交換優(yōu)點(diǎn)1<pH<12高容量（meq/g） 缺點(diǎn)機(jī)械穩(wěn)定性不好會(huì)收縮或膨脹機(jī)械穩(wěn)定性不好能耐受的有機(jī)溶劑的量是有限的離子交換能力指交換劑結(jié)合離子的能力通常填料meq/g來裝填若不考慮填充密度，可引起誤解（canbemisleading）聚合物型：5meq/g,密度0.2g/ml→1meq/ml硅膠型：1.5meq/g,密度0.5g/ml→0.75meq/ml容量越大，需要越強(qiáng)的流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度對(duì)弱離子交換，取決于流動(dòng)相的pH值交換能力與pH值的關(guān)系在離子交換色譜中影響保留的因素流動(dòng)相的離子強(qiáng)度（k）pH(k,α)抗衡離子的濃度(k,α)溫度(k,α)影響平衡共存離子(α)有機(jī)溶劑(k,α)克服反相的影響/與疏水基團(tuán)的相互作用色譜柱類型，強(qiáng)或弱離子交換劑離子強(qiáng)度的影響pH值的影響不同離子的洗脫強(qiáng)度陽(yáng)離子交換劑 Ba2+>Pb2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+>Mn2+>Ag2+>Cs2+>Rb2+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+Li是最弱的陰離子交換劑 檸檬酸鹽3->SO22->草酸鹽2->I->NO3->CrO4->Br->SCN->Cl->]醋酸鹽->OH->F-氟化物是最弱的溫度的影響流動(dòng)相：1MKH2PO4，pH3.8柱溫：60℃流速：4ml/min色譜柱：SilicaSCX40℃50℃60℃IEC－應(yīng)用氨基酸典型的應(yīng)用，由Moore和Stein在上世紀(jì)50年代末發(fā)展而來蛋白質(zhì)無機(jī)離子也稱離子色譜氨基酸的離子化用IEC分離氨基酸色譜柱：陽(yáng)離子交換柱洗脫劑A：0.2NNa+pH=3.0洗脫劑B：0.2NNa+pH=9.8梯度：0-100%Bin48min流速：0.4ml/min用IEC分離蛋白質(zhì)可應(yīng)用于多有的蛋白質(zhì)對(duì)生物活性有非常好的重現(xiàn)性對(duì)電荷差別特別小的蛋白質(zhì)分離能力非常強(qiáng)對(duì)濃度小體積大的樣品分離能力很好是可分離的質(zhì)量數(shù)最高可有多種途徑改善分離效果選擇離子交換劑類型的原則pl，等電點(diǎn)陽(yáng)離子交換劑陰離子交換劑＋－pH蛋白質(zhì)電荷是pH的函數(shù)用于蛋白質(zhì)分離的離子色譜填料粒徑：5-40μm色譜柱內(nèi)徑：5-50mm長(zhǎng)度5-30cm類型陰離子陽(yáng)離子強(qiáng)季胺磺酸磺酸鹽弱二乙基氨乙基(Diethylamine,DEAE)羧甲基(Carboxymethyl,CM)選擇合適的pH值凈電荷數(shù)蛋白質(zhì)表面電荷問題：你認(rèn)為這三種蛋白質(zhì)哪一種會(huì)最后一個(gè)被洗脫出來？注：這三種蛋白質(zhì)的凈電荷均等于－1pH值對(duì)蛋白質(zhì)分離的影響色譜柱：Protein–PakDEAE8HR10×100mm（陰離子交換）流速：1.5ml/min梯度：0-200mMNaCl緩沖鹽：20mMTRIS-HClC=Conalbumin

（伴清蛋白）T=Transferrin

（鐵傳遞蛋白）O=Ovalbumin

（卵清蛋白）S=Soybeantrypin

inhibitor（大豆胰島素抑制劑）pH梯度用于pH梯度的WatersAutoBlendTM

方法蛋白質(zhì)的分離－反離子的影響色譜柱：Protein–PakDEAE8HR10×100mm(陰離子交換)流速：1.5ml/min緩沖鹽：20mMTRIS-HClpH7.5梯度：0-200mMNaCl0-200mMNaAcetateC=Conalbumin

（伴清蛋白）T=Transferrin（鐵傳遞蛋白）O=Ovalbumin

（卵清蛋白）S=Soybeantrypininhibitor（大豆胰島素抑制劑）NaClNaAcetateCTOSSCTO蛋白分離的共離子效應(yīng)色譜柱：Protein–PakSP8HR10×100mm(陰離子交換)流速：1.5ml/min梯度：0-300mMNaCl緩沖鹽：20mMNaPhosphatepH5.520mMNaAcetatepH5.5A=AlphaChymotrypsinogen(α胰凝乳蛋白酶原)R=RibonucleaseA（核糖核酸酶）C=CytochromeC（細(xì)胞色素)L=Lysozyme(溶解酵素)IEC分離無機(jī)陰離子色譜柱：WaterIC-PakAHR洗脫：硼酸鹽/葡(萄)糖酸鹽流速：1.0ml/min檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器IEC分離無機(jī)陽(yáng)離子色譜柱：WaterIC-PakCM/D洗脫：3.0mMHNO3流速：1.0ml/min檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器1.鋰2.

鈉3.氨4.鉀5.鎂6.鈣7.鍶8.鋇體積排阻色譜氣相色譜液相色譜吸附/分離液相色譜離子交換體積排除色譜凝膠滲透/凝膠過濾SEC的機(jī)理待測(cè)無經(jīng)過一個(gè)多孔凝膠固定相凝膠孔徑可能是一種也可能是幾種的混合，取決于所選用的柱子分離取決于在溶液中的大小而不是分子量大的先出，小的后出流向凝膠顆粒凝膠顆粒體積排阻色譜中保留體積與分子量的關(guān)系SEC定義凝膠過濾（GFC）此名詞原用于描述生物聚合物SEC，現(xiàn)在也指水相SEC。蛋白，多糖等，洗脫液常為水相。凝膠滲透（GPC）此名詞原用于描述有機(jī)聚合物SEC，現(xiàn)在也指有機(jī)相SEC。聚乙烯，聚丙烯等，洗脫液常為有機(jī)相，如THF或甲苯。常采用高溫90－140℃（高溫GPC）硅基團(tuán)水相SEC柱聚合物型水相SEC柱交聯(lián)環(huán)氧丙氧基甲基丙烯酸酯表面含有醇或二醇官能團(tuán)親水性，阻止與極性化合物的反應(yīng)表面通常有負(fù)電荷疏水性待測(cè)組分可與反相填料發(fā)生作用交聯(lián)聚乙烯醇聚合物型色譜柱的工作曲線蛋白的校正曲線實(shí)例在水相SEC中影響洗脫的因素色譜柱類型/孔大小粒徑流速離子強(qiáng)度（克服IEX與表面的負(fù)電荷的反應(yīng)）有機(jī)溶劑（克服與反相疏水填料的反應(yīng)）柱溫多酶混合物用SEC進(jìn)行初步純化色譜柱：Protein–Pak60+125+300SW洗脫液：100mM磷酸鹽pH7.4流速：2ml/min樣品：5mg酶混合樣凝膠滲透色譜由Moore在上世紀(jì)60年代在Dow化學(xué)公司開發(fā)的GPC是塑料工業(yè)的官方認(rèn)可的方法，并被美國(guó)材料測(cè)試協(xié)會(huì)（ASTM）所采用，用于測(cè)聚合物分子量聚乙烯（Polyethene，PE） 塑料袋聚丁二烯（Polybutadiene） 橡膠輪胎聚氯乙烯（Polyvinychloride，PVC） 合成革，水管聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA） 有機(jī)玻璃聚碳酸酯（polycarbonate） CD光盤聚合物分布聚合物科學(xué)家指出聚合物鏈的長(zhǎng)度或大小作為其流體力學(xué)體積（hydrodynamicvolume）與分子量大小相關(guān)。分子量分布是組成一個(gè)聚合物的分子統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯示。聚合物有一系列的鏈長(zhǎng)度的分布，因而產(chǎn)生分子量。分布的形狀是聚合過程（游離基、縮合等）的反映。如果聚合物易于降解（熱解、氧化…），聚合物鏈的側(cè)鏈斷裂，會(huì)導(dǎo)致分子量分布的變化。凝膠滲透色譜分析可以測(cè)定聚合物的平均分子量或其力矩與分布。聚合物分布洗脫曲線形狀可表達(dá)根據(jù)不同分子量相對(duì)含量所表示的聚合物分配洗脫體積(保留時(shí)間)最大

最小MnMwMzMpMz+1BigOnesComeOut

First聚合物平均分子量GPC好與差的分辨能力比較GPC商品柱總結(jié)離子交換色譜根據(jù)化合物離子的差異進(jìn)行分離重要參數(shù)包括：1流動(dòng)相的離子強(qiáng)度（k）2pH（k，α）3溫度（k，α）4共存離子（α）5有機(jī)溶劑（k，α）6柱型號(hào)、IEX的強(qiáng)弱總結(jié)（續(xù)）SEC分離溶液中大小/分子量不同的化合物最重要的參數(shù)是填料的孔徑分兩類水相SEC/凝膠過濾（GFC）有機(jī)SEC/