第五章 微生物傳感器

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第五章微生物傳感器

Microbiologicalsensor

微生物傳感器是生物傳感器的重要分支。

1975年，Divies制成了第一支微生物傳感器;

1977年，研制出檢測精氨酸的微生物電極；

1979年，研制出檢測谷氨酰胺的組織傳感器。2微生物傳感器的優(yōu)點：

●微生物中含有多種酶，對于需要多種酶的反應(yīng)，微生物傳感器提供了方便；

●穩(wěn)定性好，使用壽命長；

●

響應(yīng)遲鈍時，放入培養(yǎng)基使活性恢復(fù)；

●

有些酶至今無法分離，可用含有該酶的細(xì)菌組成傳感器；

●

克服酶價格昂貴、提取困難以及不穩(wěn)定的缺點。3微生物傳感器的缺點：

由于含有多種酶，使選擇性和靈敏度受到限制；

底物需要通過細(xì)胞壁擴散，響應(yīng)時間長。45.1微生物的特征

一、微生物的營養(yǎng)要素

水、碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽。

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微生物要進行各種代謝以維持生命活動，就必須從周圍環(huán)境中吸收適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)，這些物質(zhì)稱為營養(yǎng)物質(zhì)。營養(yǎng)物質(zhì)是微生物新陳代謝和一切生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。

根據(jù)微生物所利用碳源、能源的不同，可分為四種基本營養(yǎng)類型：光能自養(yǎng)型

光能異養(yǎng)型化能自養(yǎng)型

化能異養(yǎng)型二、微生物的營養(yǎng)類型1．光能自養(yǎng)型（光能無機營養(yǎng)型）

以CO2為主要碳源，以無機物（如H2、H2S、H2O等）作為供氫體，通過光合作用獲取生長所需的能量。

光能自養(yǎng)微生物借細(xì)菌葉綠素的光合作用吸收日光的能量。念珠藍細(xì)菌光菌綠素2H2S+CO2

(CH2O)+H2O+2S（綠硫細(xì)菌和紫硫細(xì)菌）光葉綠素H2O＋CO2(CH2O)+O2↑（藍細(xì)菌）以有機碳化合物作為碳源和供氫體，以光為能源進行光合作用而生長繁殖的微生物。

2．光能異養(yǎng)型（光能有機營養(yǎng)型）

光能細(xì)菌葉綠

CH3

CO2+2CHOHCH2O+2CH3COCH3+H2O

CH3(紅螺菌)3.化能自養(yǎng)型（化能無機營養(yǎng)型）

以CO2作為主要碳源，利用無機化合物（如銨、亞硝酸鹽、硫化氫、鐵離子等）氧化時釋放的能量作為能源進行生長的一類微生物。產(chǎn)甲烷細(xì)菌11

化能自養(yǎng)微生物不含細(xì)菌葉綠素，不能利用日光的能量，但可在無機物的培養(yǎng)基中生長。

不同的化能自養(yǎng)微生物在氧化各自所需的無機物時獲得能量。

如：硫化細(xì)菌

硝化細(xì)菌

產(chǎn)甲烷菌

H2

H2SSH2SO4

NH3HNO2HNO3

4.化能異養(yǎng)型（化能有機營養(yǎng)型）以有機化合物為碳源，利用有機化合物氧化過程中產(chǎn)生的能量作為能源而生長的一類微生物。

大多數(shù)微生物屬于這種營養(yǎng)類型。分為：腐生菌：利用無生命的有機物(如動植物尸體

和殘體)作為營養(yǎng)物質(zhì)。寄生菌：只能在活寄主體吸收營養(yǎng)物生活的。兼性寄生菌：既營寄生又營腐生生活的。(結(jié)核桿菌)小結(jié)：（1）微生物營養(yǎng)劃分主要依據(jù)：碳源和能源。（2）營養(yǎng)劃分具有相對性，如紅螺菌。能源碳源光能自養(yǎng)光能CO2光能異養(yǎng)光能有機物化能自養(yǎng)無機物CO2化能異養(yǎng)有機物有機物1516

根據(jù)微生物反應(yīng)對氧的要求將微生物分為：

需氧型微生物，如枯草桿菌、青霉菌、假單胞菌等

厭氧型微生物，如丙酮丁醇梭菌、巴氏菌、破傷風(fēng)菌等17二、微生物的生長與控制

根據(jù)微生

物的生長速率，

可分為四個主

要生長期：

●停滯期

●對數(shù)期

●恒定期

●衰亡期18三、微生物的代謝

微生物從周圍環(huán)境中攝取營養(yǎng)物質(zhì)，并通過酶的作用，在體內(nèi)進行一系列的生物分解和生物合成反應(yīng)，以保持正常的生長和繁殖，這一過程稱為微生物的代謝。

包括分解代謝和合成代謝。191.微生物的分解代謝（異化作用）

微生物從周圍環(huán)境中吸取營養(yǎng)，通過一系列酶促作用進行分解，并釋放能量稱為分解代謝。把自己變成非己。

包括：碳水化合物的分解

脂肪和脂肪酸的分解

蛋白質(zhì)的分解

202.微生物的合成代謝（同化作用）

微生物把從周圍環(huán)境中獲取的營養(yǎng)物質(zhì)變成自身的組成物質(zhì)，并且儲存能量。簡單地說就是把非己變成自己。21合成代謝主要包括：

氨基酸的合成、蛋白質(zhì)的合成、核苷酸的合成、RNA的合成、DNA的合成。

分解代謝和合成代謝是生物體內(nèi)不可分割的兩個方面，兩個過程共同維持微生物的生命。

225.2微生物敏感膜的制備技術(shù)

微生物固定化的要求：

●固定化過程的反應(yīng)條件和所用化學(xué)試劑對活細(xì)胞無害；

●固定化過程適宜在無菌條件下操作；

●固定后的菌穩(wěn)定性要好。

23微生物固定化方法常用夾心法和包埋法。245.3微生物傳感器的類型

微生物傳感器從工作原理上可分為兩種類型:

●呼吸機能型微生物傳感器

●代謝機能型微生物傳感器

25微生物傳感器類型26呼吸機能型微生物傳感器

以需氧型微生物作為生物活性物質(zhì)，它在與有機底物作用的同時，細(xì)胞的呼吸活性提高，耗氧量增大，通過電極測定呼吸活性變化而轉(zhuǎn)變的擴散電流值從而間接測定有機物濃度。

27呼吸機能型微生物傳感器28代謝機能型微生物傳感器

以厭氧型微生物作為生物活性物質(zhì)，它的原理是微生物分解有機物，產(chǎn)生各種代謝生成物，如NH3，CO2，有機酸，可用相應(yīng)的離子選擇性電極測得代謝物濃度，進而測定底物濃度。29代謝機能型微生物傳感器

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微生物傳感器按照信號轉(zhuǎn)換器的不同分為：

●電化學(xué)微生物傳感器

●光微生物傳感器

●熱敏電阻型微生物傳感器

●壓電微生物傳感器

●燃料電池型微生物傳感器等311.電化學(xué)微生物傳感器

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電流型微生物傳感器

微生物敏感膜與待測物發(fā)生反應(yīng)后，通過輸出電流信號的變化來檢測某一物質(zhì)含量的變化。

常用的信號轉(zhuǎn)換器件有氧電極、過氧化氫電極。

（1）甲烷微生物傳感器33

甲烷與空氣可以形成爆炸性混合物，空氣中甲烷含量在5-14％之間具有爆炸性；另外，甲烷的生產(chǎn)過程是一個發(fā)酵過程，控制發(fā)酵過程也需要測定各發(fā)酵階段的甲烷含量。

34測量系統(tǒng)的組成

原理：甲烷電極所用微生物是甲烷氧化細(xì)菌（鞭毛甲基單胞菌）。從天然物質(zhì)中提取并在一定的培養(yǎng)環(huán)境中生長的甲烷氧化細(xì)菌，通過氧化甲烷而生長，甲烷是它的主要碳源和能源。

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甲烷微生物傳感器系統(tǒng)示意圖361,10-真空泵；2-氣體樣品袋；3-氣體管道；4-過濾膜；5-可控反應(yīng)器；6-甲烷-微生物反應(yīng)器；7-氧電極；8-放大器9-記錄儀；11,12,13,14,15,16,17-玻璃閥

甲烷微生物傳感器連續(xù)檢測系統(tǒng)37

含甲烷的氣體流過有微生物的反應(yīng)池時，甲烷被微生物同化，微生物呼吸增強而消耗氧，使得反應(yīng)器中溶解氧的濃度降低。當(dāng)微生物的耗氧量與從樣品向微生物擴散的氧量之間達到平衡時，電流下降會達到穩(wěn)定，穩(wěn)態(tài)電流的大小取決于甲烷的濃度。

參比電極所在反應(yīng)池中不含微生物，氧含量及電流不變，所以兩電流之間的最大差值與氣體中甲烷含量有關(guān)。原理

38(2)致癌物微生物傳感器

利用枯草桿菌的DNA修復(fù)機構(gòu)缺損菌株（）和野生菌株（）兩種細(xì)菌，分別固定在兩個氧電極上，并將兩個氧電極的電信號輸入差分電路，即構(gòu)成檢驗致癌物質(zhì)的傳感器系統(tǒng)。

391-；2-；3-過濾器；4-聚四氟乙烯膜；5-鉑陰極；6-鉛陽極；7-記錄儀；Ⅰ，Ⅱ-為含DNA修復(fù)機構(gòu)缺損株和野生株的枯草桿菌測定變異原的微生物傳感器系統(tǒng)40兩個氧電極同時放入待測溶液中，若溶液中含有致癌物質(zhì)，則內(nèi)的DNA將受到損傷而死亡，氧電極由于停止呼吸而不再消耗氧，氧電流增加。

但內(nèi)的DNA雖受到短暫損傷卻能自動進行修復(fù)，因此呼吸反應(yīng)繼續(xù)進行而不斷消耗氧，使電流保持初始時的水平，差分電路顯示出的電流差值表示被測物質(zhì)是致癌可疑物質(zhì)。原理

41（3）BOD微生物傳感器

BOD（生化需氧量Biochemicaloxygendemand）的測定是監(jiān)測水體被有機物污染狀況的最常用指標(biāo)。

常規(guī)的BOD測定法操作復(fù)雜、重復(fù)性差、耗時耗力、干擾性大，不宜現(xiàn)場監(jiān)測。

BOD（生化需氧量）微生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖

BOD微生物傳感器的電流響應(yīng)

44將傳感器放在緩沖液中，微生物處于內(nèi)源呼吸狀態(tài)，當(dāng)氧的擴散作用于內(nèi)源呼吸的耗氧量達到平衡時，傳感器輸出恒定的電流。

將傳感器放在待測樣品中，微生物由內(nèi)源呼吸變?yōu)橥庠春粑?，耗氧量增大，擴散到氧電極的氧降低，輸出電流降低，電流的下降值與有機物的濃度呈一定的線性關(guān)系。原理

商業(yè)化BOD微生物傳感器目前利用的微生物有假單胞菌、活性淤泥菌、絲孢酵母菌、枯草芽孢桿菌。46（4）甲醇和乙醇微生物傳感器用固定化的甲醇細(xì)菌或絲孢菌母與氧電極組成。47甲醇（5）醋酸微生物傳感器用固定化的絲孢菌母與氧電極組成。48醋酸（6）葡萄糖微生物傳感器49用固定化的假單孢菌與氧電極組合而成。50（7）氨微生物傳感器

氨的測定在醫(yī)療、環(huán)境及工業(yè)領(lǐng)域的檢驗中都很重要。用氨氣敏電極測定必須在強堿（pH>11)條件下進行，有些揮發(fā)性化合物如胺會干擾測定。

由固定化硝化菌、聚四氟乙烯透氣膜和氧電極組成的微生物電極可用于氨的測定。

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硝化菌(Nitrosomonas.sp)可利用氨作為唯一的能源，在反應(yīng)中消耗氧，即

2NH3+3O23HNO2+H2O

氨的濃度可以通過檢測附著在氧電極上的固定化微生物的呼吸量來測定。5253電位型微生物傳感器

電位型微生物傳感器以電位型電極作為信號轉(zhuǎn)換器，輸出的信號是電位。

常用的轉(zhuǎn)換器件有：pH電極、氨氣敏電極、二氧化碳電極等，各種電位型傳感器的電位值與被測離子活度之間的關(guān)系符合能斯特方程。（1）谷氨酸微生物傳感器

是一種酸性氨基酸。在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中占重要地位，參與動物、植物和微生物中的許多重要化學(xué)反應(yīng)。54谷氨酸谷氨酸鈉

大腸桿菌具有谷氨酸脫羧酶，與CO2電極組成微生物傳感器測定谷氨酸的含量。55（2）尿素微生物傳感器56

用谷氨酸棒狀桿菌作為酶源，可以制備尿素傳感器。

根據(jù)電極電位響應(yīng)便可對尿素含量進行測定。57部分電位型微生物傳感器582.光微生物傳感器

原理：有些微生物具有光合作用能力，在光照作用下能將待測物轉(zhuǎn)變成電極敏感物質(zhì)或其本身能釋放氧，將這類微生物固定化并與氧電極、氫電極等結(jié)合即制得光微生物傳感器。3.熱敏電阻微生物傳感器

4.壓電微生物傳感器壓電石英晶體諧振頻率變化量與晶體表面均勻沉積的極薄層剛性物質(zhì)質(zhì)量之間成正比，即605.燃料電池型微生物傳感器

有機分子被氧化時能釋放一定能量，稱為“燃料”，使燃料的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)殡娔艿脑姵匮b置稱為燃料電池。

如果在電池中發(fā)生的反應(yīng)由生物所催化，這種裝置便稱為生物燃料電池（bio-fuelcells）。

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燃料電池型微生物傳感器信號產(chǎn)生機理

有機物作為燃料在陽極室中被微生物氧化，產(chǎn)生的電子傳遞給電池陽極，電子通過外電路到達陰極，從而形成回路產(chǎn)生電流。其陽極和陰極反應(yīng)式如下所示：陽極反應(yīng)：

(CH2O)n＋nH2OnCO2＋4ne-＋4nH+陰極反應(yīng)：

4e-＋O2＋4H+2H2O(1)生物燃料電池的原理63部分燃料電池型微生物傳感器(2)生物燃料電池的特點原料來源廣泛；操作條件溫和；資源利用率高，無污染。(3)生物燃料電池的應(yīng)用前景作為新能源；改善汽車的燃料結(jié)構(gòu)；為可植入人體的設(shè)備提供能量。66(1)酶—微生物混合型傳感器

敏感材料由酶和微生物混合構(gòu)成，這樣可使敏感膜的性能更加完善。

6.其他類型微生物傳感器2NH3+3O23HNO2+H2O

硝化菌69(2)嗜熱菌傳感器

又稱高溫細(xì)菌、嗜熱微生物。生活在高溫環(huán)境中，如火山口、溫泉、工廠高溫廢水排放區(qū)。70用嗜熱菌作為敏感材料，可在較高溫度下使用，同時具有抗酸、堿能力，可克服常溫菌不耐酸、堿和高溫的不足。717.生物組織傳感器

生物組織傳感器是以活的動植物細(xì)胞切片作為分子識別元件與相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)換元件構(gòu)成生物組織傳感器。