DNA重組技術(shù)的基本工具上課

專題1基因工程一、基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程實質(zhì)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的生物類型和生物產(chǎn)品剪切→拼接→導(dǎo)入→表達基因重組指按照人們的愿望，進行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。記一記

1.1DNA重組技術(shù)的基本工具3DNA重組技術(shù)的基本工具工欲善其事,必先利其器.想一想:獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉需要做哪些工作呢?

實現(xiàn)這一精確的操作過程的工具是什么呢?

1.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”(1)來源:

(2)化學(xué)本質(zhì)：

(3)作用

(4)作用特點：(5)切割方式識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。錯位切：產(chǎn)生兩個相同的黏性末端平切：形成平末端特異性，即識別特定的脫氧核苷酸序列,切割特定位點。主要從原核生物蛋白質(zhì)T磷酸二酯鍵1234512345A7限制酶所識別的序列有什么特點？限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。圖1-1限制酶識別序列的中心軸線當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，產(chǎn)生的是平末端。當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線兩側(cè)切開時，產(chǎn)生的是黏性末端。黏性末端當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線兩側(cè)切開時，被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。EcoRI限制酶的的切割：：中軸線黏性末端端黏性末端端在G與A之間切割割大腸桿菌菌的一種種限制酶酶(EcoRⅠ)只能識別別GAATTC序列，并在G和A之間切開開。平末端當(dāng)限制酶酶從識別別序列的的中心軸線線處切開開時，切開的的DNA兩條單鏈鏈的切口口，是平平整的，，這樣的的切口叫叫平末端。CCCG

GGGGGCCCSmaI限制酶酶的切割割：只能識別別CCCGGG序列，并在C和G之間切開開。中軸線要想獲得得某個目目的基因因必須要要用限制制酶切幾幾個切點點？可產(chǎn)產(chǎn)生幾個個黏性末末端？一一個目的的基因有有幾個黏黏性末端端？要切兩個個切點，，產(chǎn)生四四個黏性性末端，，兩個。。如果把兩兩種來源源不同的的DNA用同一種種限制酶酶來切割割，會怎怎樣呢？？會產(chǎn)生相相同的黏黏性末端端。是不是把把兩者的的黏性末末端黏合合起來，，這樣就就真的合合成重組的DNA分子了?實際還不夠夠,還需要DNA連接酶進行行連接。思考題：2、ＤＮＡ連連接酶——“分子縫合針針”種類：作用部位：：E·coliDNA連接酶（黏性末端）T4DNA連接酶（黏性末端和平末端）是磷酸二酯酯鍵，將雙鏈DNA片段段“縫合””起來，恢恢復(fù)被限制制酶切開的的兩個核苷苷酸之間的磷酸酸二酯鍵,這樣一一個重組的的DNA分分子就形成成了。不是氫鍵。。E·coliDNA連接酶與T4DNA連接酶比較較：類型來源E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別DNA聚合酶和DNA連接酶有何何相同點和和不同點？？DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈連接部位相同點雙鏈單鏈在兩DNA片段之間形形成磷酸二酯酯鍵將單個核苷苷酸加到已存在的的核酸片段的3’末端的羥基上，形形成磷酸二酯鍵都能形成磷酸二酯鍵鍵二者都由蛋蛋白質(zhì)構(gòu)成成記一記DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點DNA連接酶與DNA聚合酶1)只能將單個核苷酸酸連接到已有有的核酸片片段上，形形成磷酸二二酯鍵形成磷酸二酯鍵鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸酸通過磷酸二二酯鍵連接成一條條互補的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個缺口同同時連接起來，不需要模板板限制酶解旋酶區(qū)別限制性內(nèi)切切酶與解旋旋酶的區(qū)別別切割特定的的核苷酸序序列的磷酸酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫氫鍵打開形形成兩條單單鏈據(jù)右圖所示示，有關(guān)工工具酶功能能的敘述不不正確的是是（））A.限制制性內(nèi)切酶酶可以切斷斷a處，DNA連接接酶可以連連接a處B.DNA連接酶可以連接接a處C.解旋旋酶可以使使b處解開開D.連接接b處的酶可以以為DNA連接酶D3、基因進入受受體細(xì)胞的的載體——“分子運輸車車”（1）載體的作作用將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。運載體對外源基因進行大量復(fù)復(fù)制。（2）作為載體體必須具備備的條件能夠在宿主主細(xì)胞中自自我復(fù)制并并穩(wěn)定地保保存。具有一個或或多個限制制酶切點，，以便與外外源基因連連接。具有某些標(biāo)標(biāo)記基因，，便于進行行篩選。必需是安全全的，不會會對受體細(xì)細(xì)胞有害害。大小應(yīng)適合合，便于提提取和操作作記一記（3）常用的載載體質(zhì)粒λ噬菌體衍生生物動植物病毒毒常用的載體體：質(zhì)粒復(fù)制起始的的一段序列列有切割位點點有標(biāo)記基因因的存在，，可用含氨氨芐青霉素素的培養(yǎng)基基鑒別質(zhì)粒存在于于許多細(xì)菌以及酵酵母菌等生生物細(xì)胞中中。是一種裸裸露的、結(jié)結(jié)構(gòu)簡單、、獨立于細(xì)細(xì)菌擬核DNA或細(xì)胞核之之外自我復(fù)復(fù)制的很小小的雙鏈環(huán)環(huán)狀DNA分子不屬于質(zhì)粒粒被選為基基因運載體體的理由是是A、能復(fù)制（（））B、有多個限限制酶切點點C、具有標(biāo)記記基因D、它是環(huán)狀狀DNAD議一議2、能否用SARS病毒作為基基因載體？？3、作為載體，，若沒有切切割位點將將怎樣？4、攜帶目的的基因的載載體是否進進入了受體體細(xì)胞，如如何鑒定？？5、假如目的的基因?qū)肴胧荏w細(xì)胞胞后不能復(fù)復(fù)制，將怎怎樣？1、從化學(xué)組組成來看，，載體應(yīng)含含有什么成成分？雙鏈DNA不能不能進行DNA的重組載體上應(yīng)有有標(biāo)記基因因可能造成基基因丟失思考與探究究1.限制酶在DNA的任何部位位都能將DNA切開嗎？以以下是四種種不同限制制酶切割形形成的DNA片段：(1)…CTGCA(2)…AC(3)GC……G…TGCG…（4）…G(5)G…(6)…GC…CTTAAACGTC……CG(7)GT…(8)AATTC…CA…G…你能用DNA連接酶將它它們連接起起來？2和7能連接形成成…ACGT……TGCA…；4和8能連接形成成…GAATTC………CTTAAG……；3和6能連連接接形形成成…GCGC………CGCG……；1和5能連連接接形形成成…CTGCAG………GACGTC……。272、為為什什么么限限制制酶酶不不能能將將自自己己的的DNA分子子剪剪切切掉掉？？1、DNA分子不具備該種限制酶的識別切割序列；2、通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能切開。4.網(wǎng)上上查查詢詢：：DNA連接接酶酶有有連連接接單單鏈鏈DNA的本本領(lǐng)領(lǐng)嗎嗎？？迄今今為為止止，，所所發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的的DNA連接接酶酶都都不不具具有有連連接接單單鏈鏈DNA的能能力力，，至至于于原原因因，，現(xiàn)現(xiàn)在在還還不不清清楚楚，，也也許許將將來來會會發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)可可以以連連接接單單鏈鏈DNA的酶酶。。29真核核生生物物的的基基因因由由編編碼碼區(qū)區(qū)和和非非編編碼碼區(qū)區(qū)組組成成，，兩兩邊邊是是非非編編碼碼區(qū)區(qū)（（非非編編碼碼序序列列））、、中中間間是是編編碼碼區(qū)區(qū)（（編編碼碼序序列列））。。而而中中間間的的編編碼碼區(qū)區(qū)也也由由編編碼碼序序列列和和非非編編碼碼序序列列相相間間排排列列組組成成，，其其中中的的編編碼碼序序列列稱稱外外顯顯子子、、而而非非編編碼碼序序列列稱稱內(nèi)內(nèi)含含子子。。原原核核生生物物的的基基因因也也有有編編碼碼區(qū)區(qū)、、非非編編碼碼區(qū)區(qū)，，但但是是編編碼碼區(qū)區(qū)內(nèi)內(nèi)是是連連續(xù)續(xù)的的編編碼碼區(qū)區(qū)列列。。（（注注意意在在原原核核生生物物基基因因中中，，沒沒有有外外顯顯子子和和內(nèi)內(nèi)含含子子的的概概念念，，即即你你不不能能說說原原核核生生物物的的編編碼碼區(qū)區(qū)全全是是外外顯顯子子））這這樣樣的的基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄是是，，先先以以編編碼碼區(qū)區(qū)其其中中一一條條鏈鏈為為模模板板合合成成mRNA，這這就就是是前前體體mRNA，然然后后有有些些酶酶將將那那些些內(nèi)內(nèi)含含子子對對應(yīng)應(yīng)的的序序列列切切去去，，把把外外顯顯子子對對應(yīng)應(yīng)的的mRNA的序序列列鏈鏈接接在在一一起起，，這這就就是是成成熟熟的的mRNA，這這就就是是翻翻譯譯蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的直直接接模模板板了了。。核核糖糖體體結(jié)結(jié)合合在在上上面面，，并并沿沿其其滑滑動動。。當(dāng)當(dāng)遇遇到到AUG（真真核核生生物物的的起起始始密密碼碼子子））或或者者GUG（原原核核生生物物的的起起始始密密碼碼子子））時時，，肽肽鏈鏈的的合合成成開開始始，，當(dāng)當(dāng)遇遇到到UAA、UAG、UGA（終終止止密密碼碼子子））的的時時候候，，肽肽鏈鏈合合成成終終止止。。一一句句話話：：編編碼碼區(qū)區(qū)（（外外顯顯子子、、內(nèi)內(nèi)含含子子））和和非非編編碼碼區(qū)區(qū)是是基基因因的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)。。起起始始、、終終止止密密碼碼子子是是mRNA