第十章 基因定位和基因克隆

醫(yī)學遺傳學第十章基因定位與基因克隆本章節(jié)重點基因定位和基因克隆的概念連鎖分析遺傳標記基因定位的策略基因定位(genemapping)：利用一定的方法將一個基因確定到染色體上的實際位置上。1911年，Wilson將紅綠色盲基因定位到X染色體1968年，Duffy血型基因定位于1號染色體基因定位(genemapping)：利用一定的方法將一個基因確定到染色體上的實際位置上?；蚩寺?genecloning)：用一定的方法把不同位點上的基因分離出來。連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用重組值(recombinationfraction)：是基因定位時兩個基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。

如果兩個基因之間有1％的重組值，其遺傳圖的距離就是1厘摩(centimorgan，cM)。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用遺傳標記(geneticmarker)：基因定位是確定某一基因在染色體上的未知位置，用連鎖分析法進行基因定位需要一些遺傳位點，這些位點應按孟德爾方式遺傳，且具有多態(tài)性以顯示其連鎖關系，這些標記位點稱為遺傳標記。連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ3.0Kb1.7Kb探針第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用神經(jīng)纖維瘤，NF1RFLP標記ⅠⅡⅢ1212345678123456783.0Kb1.7Kb4.7Kb第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用神經(jīng)纖維瘤，NF1RFLP標記ⅠⅡⅢ1212345678123456784.7Kb3.0Kb第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用神經(jīng)纖維瘤，NF1RFLP標記ⅠⅡⅢ121234567812345678Lod法Lod(logarithmoftheodds)，是Morton在1955年提出的優(yōu)勢對數(shù)法。Lod分值為＋3，連鎖:不連鎖＝1000:1，表示連鎖存在第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用Lod分值為－2，不連鎖:連鎖＝100:1，表示連鎖不存在第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用多點連鎖定位(multipointlinkagemapping)利用三點交叉法(threepointcrosses)，可將某一致病基因定位于遺傳標記的框架內，更精確的進行基因定位。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用多點連鎖定位(multipointlinkagemapping)子代類型重組位置數(shù)目ABC/abc非重組體853abc/abcABc/abc(A，B)-X-C5abC/abcaBC/abcA–X–(B，C)47Abc/abcAbC/abcB–X–(A，C)95aBc/abc第二節(jié)體細胞雜交與基因定位體細胞雜交(somaticcellhybridization)：又稱細胞融合(cellfusion)，是將兩個同種和/或不同種的細胞融合成一個新細胞，即雜種細胞(hybridcell)。病毒誘導的細胞融合——仙臺病毒化學融合技術——聚乙二醇(PEG)電融合技術——電穿孔法細胞融合第二節(jié)體細胞雜交與基因定位細胞融合第二節(jié)體細胞雜交與基因定位異核細胞合核細胞第二節(jié)體細胞雜交與基因定位細胞融合兩個同種的動物細胞融合后形成的雜種細胞，細胞核一般保留雙親的染色體；不同種動物的細胞融合后，細胞核含有雙親的的染色體，但隨著增殖傳代的過程，會出現(xiàn)保留一方染色體，另一方染色體逐漸丟失的現(xiàn)象。第二節(jié)體細胞雜交與基因定位第二節(jié)體細胞雜交與基因定位HAT選擇系統(tǒng)

1962年，利用缺乏HPRT酶為遺傳標記的人突變細胞株發(fā)展起來的HPRT系統(tǒng)；1964年，加入缺乏TK(胸苷激酶)的小鼠細胞株TK－系統(tǒng)，結合發(fā)展為HAT系統(tǒng)。第二節(jié)體細胞雜交與基因定位HAT選擇系統(tǒng)

H：次黃嘌呤(Hypoxanthine)A：氨基喋呤(Aminopterin)T：胸腺嘧啶(Thymidine)氨基喋呤阻斷DNA合成；融合細胞中含有TK和HPRT，可使次黃嘌呤轉變?yōu)榇吸S核苷酸，鳥嘌呤轉變?yōu)轼B苷酸。第二節(jié)體細胞雜交與基因定位雜種細胞的選擇和分離HPRT－TK－第二節(jié)體細胞雜交與基因定位TK－HPRT－第二節(jié)體細胞雜交與基因定位雜種細胞的選擇和分離基因產(chǎn)物的檢測與染色體定位TK：17號染色體第二節(jié)體細胞雜交與基因定位第二節(jié)體細胞雜交與基因定位基因產(chǎn)物的檢測與染色體定位微細胞融合(microcellfusion)第二節(jié)體細胞雜交與基因定位染色體畸變和區(qū)域定位(regionalassignment)第三節(jié)原位雜交和熒光原位雜交原位雜交(InSiteHybridization，ISH)：利用同位素標記的DNA探針，與玻片上的中期染色體進行雜交。是一種直接進行基因定位的方法。熒光原位雜交(FISH)：用特殊的熒光素標記DNA探針，與玻片上的染色體或細胞組織標本進行雜交。第三節(jié)原位雜交和熒光原位雜交X染色體Y染色體13號染色體18號染色體21號染色體第三節(jié)原位雜交和熒光原位雜交13號染色體21號染色體第四節(jié)放射雜種放射雜種(radiationhybrid)：用含有輻射切割的人類染色體片段的細胞與嚙齒類細胞融合產(chǎn)生的雜種克隆細胞，是體細胞雜種的另一種類型。1975年，Goss和Harris提出1990年，Cox構建單染色體雜種細胞1994年，Walter建立全基因組放射雜種第四節(jié)放射雜種第四節(jié)放射雜種?Genebridge4

radiationdose:3,000Radsnumberofhybrids:93

averagefragmentsize:~10Mb第四節(jié)放射雜種HumanWhole-GenomePanels?StanfordG3

radiationdose:10,000Rads

numberofhybrids:83averagefragmentsize:~4Mb?StanfordTNG4(TheNextGeneration)

radiationdose:50,000Radsnumberofhybrids:90averagefragmentsize:~800kb/123456789101112ABCDEFG10000100000000001000001000000000100000000000000001000000000000000000000010001000000

10000100000000001000001000000000100000000000000001000000000000000000000010001000000

第四節(jié)放射雜種第五節(jié)基因克隆一、功能克隆(functionalcloning)先研究功能，再定位克隆基因。血紅蛋白病HbS——血紅蛋白缺陷(1949)

——β鏈

谷氨酸6纈氨酸

GAG→GTG

——11p(70年代)第五節(jié)基因克隆第五節(jié)基因克隆第五節(jié)基因克隆二、定位克隆(positionalcloning)ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCG