光合作用測定系統(tǒng)的測定方法及使用注意事項

PP托普云農(nóng)一一致力于中國農(nóng)業(yè)信息化的發(fā)展!PP托普云農(nóng)一一致力于中國農(nóng)業(yè)信息化的發(fā)展!光合作用測定系統(tǒng)的測定方法及使用注意事項隨著科學(xué)研究的深入和現(xiàn)代化光合測定系統(tǒng)的推廣，越來越多的植物生理學(xué)和植物生態(tài)學(xué)以及農(nóng)學(xué)、林學(xué)、園藝學(xué)和遺傳學(xué)的研究均涉及葉片光合作用的測定。用于葉片光合測定的儀器種類和數(shù)量越來越多。這類儀器的使用簡便、快捷，幾乎人人都能使用，即使對光合作用一無所知的人也可以用它在2min內(nèi)測得一組光合速率及有關(guān)的參數(shù)。然而，盡管使用這類儀器的人很多，但能利用所得資料寫出高水平科學(xué)論文的人卻很少。其中的原因主要的可能是使用者缺乏足夠的有關(guān)光合作用的背景知識和測定及研究經(jīng)驗，測定方法不當，所得結(jié)果不可靠；或者實驗設(shè)計不合理，難以說明問題；或者是對相關(guān)研究現(xiàn)狀不清楚，不能明確地提出科學(xué)問題；或者是對光合作用的基礎(chǔ)知識知之太少，不能對所得結(jié)果作出恰當?shù)姆治雠c解釋。這幾種情況也許兼而有之。為了充分發(fā)揮這類現(xiàn)代化但價格昂貴的儀器的作用，將光合作用研究推向深入，這里將光合測定與研究中一些常見的問題提出來，以引起初學(xué)者們的注意。1測定方法光合作用的一個突出特點是對植物自身生理狀態(tài)和外界環(huán)境條件的變化高度敏感。這一特點，決定了測定方法的復(fù)雜性、多樣性和靈活性，也決定了測定結(jié)果的多變性以及解釋這些結(jié)果時了解植物狀態(tài)、測定條件、環(huán)境條件、背景知識和研究經(jīng)驗的重要性。測定時間在田間測定時，不僅要選擇無云或少云的晴天，以便保證在太陽光強相對穩(wěn)定的條件下進行，而且要注意選擇合適的日時段。眾所周知，在晴天，光強和溫度等環(huán)境條件從早到晚都呈現(xiàn)規(guī)律性變化，上午逐漸增高，中午達到最高值，然后逐漸降低。葉片的光合作用速率也發(fā)生類似的變化。光合速率之所以在中午前后才達到最高值，一是因為上午早些時候光強和溫度比較低，二是因為光合作用還處在逐步增高的光合誘導(dǎo)期中。因此，在作不同處理或品種的對比測定時，一定要在光合作用的誘導(dǎo)期結(jié)束、光合作用達到穩(wěn)態(tài)之后進行，否則會得到不可靠、不可比、甚至錯誤的結(jié)果。為了避免可能發(fā)生的中午光合作用明顯降低（“午睡”或“午休”Xu和Shen2005）對測定結(jié)果可比性的影響，以在10:00?12:00和14:00~16:00之間進行測定較為適宜。除了光合作用日變化的觀測以外，過早開始和過晚結(jié)束測定，都不合適。為了盡量縮小測定期間環(huán)境條件變化的影響，比較類實驗的測定時間要盡量短，處理或品種的數(shù)目要盡可能少，最好相互交替進行（許大全2002），以便避免較長時間內(nèi)環(huán)境因素變化對測定結(jié)果可比性產(chǎn)生的不良影響。在較長時間陰雨天之后，葉片的光合活力往往很低，不宜在轉(zhuǎn)晴后立即測定。至少在轉(zhuǎn)晴半天或1d后開始測定。有研究表明，前幾天的天氣不同（陰雨或晴天），所得觀測結(jié)果也不同（Yong等2006）。特別是在觀測葉片光合作用的發(fā)育變化或季節(jié)變化時，更要注意這一點。觀測葉片發(fā)育期間光合作用的變化，最好在環(huán)境因素可控制的條件下例如人工氣候室內(nèi)進行,以便避免環(huán)境因素變化的干擾。在室內(nèi)測定時，要注意光合作用的誘導(dǎo)期（光合速率逐步增高）是否已經(jīng)結(jié)束（光合速率達到穩(wěn)定不變的狀態(tài)，即穩(wěn)態(tài)）的問題，在將植物或葉片從黑暗中轉(zhuǎn)移到光下或從弱光下轉(zhuǎn)移到強光下的時候，測定前一定要在測定光強的光下先照射一段時間（0.5~1h或更長），以保證所測定的葉片完成光合作用誘導(dǎo)而達到穩(wěn)定狀態(tài)。1.2葉片的選擇許多研究已經(jīng)表明，不僅不同葉位葉片、不同葉齡葉片、同一葉片的不同部位（例如禾本科植物葉片的上、中、下部）的光合速率明顯不同，而且不同葉片取向或著生角度（平展和直立）也對葉片的光合速率有影響。因此，在作對比測定時一定要充分注意所測葉片的葉位、葉齡、葉取向和葉部位等因素的一致性和可比性。由于剛剛完全展開的葉片光合活力最高，所以在光合作用的比較測定中常常選用為樣品葉。不考慮這些因素的差異而隨便取一個葉片就測的作法是不適宜的。有的人在介紹其所測定的葉片時喜歡用“功能葉”一詞，其實在多數(shù)情況下這是一個含糊的概念，至少應(yīng)該標明它的葉位和葉齡（幼、成、老）。在使用離體葉片進行光合測定時，一定要在水下剪斷葉柄，并將葉柄插入水中。否則，如果在空氣中剪斷葉柄，木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)水柱收縮后空氣會乘虛而入，此后即使將葉柄插在水中，水分也不容易進入葉片，從而導(dǎo)致水分脅迫。由于離體葉片的水分供應(yīng)不如連體葉片，所以對較大的葉片最好作適當修剪，保留的葉面積比葉室窗口面積稍大一些即可。經(jīng)驗表明，葉片離體后光合活力在短時間（例如4h）內(nèi)是穩(wěn)定的，長時間以后活力會大幅度下降，不再適用于光合作用測定。另外，用樹木離體枝條上的葉片進行測定，不是一個好辦法，因為這些葉片很容易由于供水狀況不良而導(dǎo)致氣孔部分或完全關(guān)閉。有的人為了測定方便，在測定前臨時把田間生長的較大的植株連根挖出來帶回實驗室測定。這也不是個好辦法，因為部分細根和須根的折斷或丟失會導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度和光合速率的明顯降低。這種移栽的植株葉片光合作用可能至少需2周后才能恢復(fù)正常。L3測定結(jié)果的可靠性檢驗在測定過程中，應(yīng)當隨時檢查和分析所得結(jié)果的可靠性，看看有關(guān)的指標或參數(shù)是否處于正常范圍內(nèi)。例如，胞間與葉片周圍的二氧化碳濃度比是否為0.7左右，碳同化的量子需要量是否大于8或量子效率是否小于0.125（如果分別小于或大于這些理論值，則說明測定和計算結(jié)果有問題），C3植物光合作用的飽和光強（光量子通量密度）是否低于2000mol-m-2-s-1,充分暗適應(yīng)葉片光系統(tǒng)H的光化學(xué)效率是否在0.83?0.85之間，C3植物的C02補償濃度是否大于10 mol-mol-L而C4植物的CO2補償濃度是否小于5mol?mol-1;看看光響應(yīng)曲線和二氧化碳響應(yīng)曲線是否合乎規(guī)律而流暢自然（通常為一直角雙曲線）。如若不然，參數(shù)奇高或奇低，曲線奇形怪狀，就要及時找出原因：是植物材料處于某種環(huán)境脅迫之下呢，還是儀器發(fā)生故障，或是測定方法不恰當，應(yīng)該及時加以糾正或改善。否則，一直盲目地測定下去，不僅得到一些不可靠而沒有用處的資料，而且可能喪失合適的測定時機。特別是田間實驗，生長季節(jié)不等人，往往一些實驗想重做都不可能，只好等待明年。1.4測定條件和環(huán)境條件的記錄由于葉片的光合作用受植物生理狀態(tài)的制約和環(huán)境條件的影響，生理狀態(tài)和環(huán)境條件的變化往往引起葉片光合速率的明顯變化。只有清楚地了解所測定葉片的生理狀態(tài)和環(huán)境條件，才能對葉片光合速率的變化做出正確的解釋。因此，在記錄光合速率和有關(guān)參數(shù)的同時，應(yīng)該詳細地記錄天氣狀況、環(huán)境條件和測定條件以及植物、葉片的生理狀態(tài)。這樣，在日后整理、分析光合測定結(jié)果和寫文章時，才不會因缺乏這些資料而感到茫無所措。2研究方法為了光合作用測定的結(jié)果準確、可靠，能夠用于說明問題，寫作具有創(chuàng)新意義的科學(xué)論文，不僅要有正確的測定方法，而且還要有正確的研究方法，這包括實驗設(shè)計合理，對測定結(jié)果進行必要的生物統(tǒng)計、綜合分析和深入探討新現(xiàn)象以及排除實驗假象等。否則，測定的數(shù)據(jù)再多、工作再辛苦，積累的也只能是一些沒有多大用途的資料。實驗設(shè)計首要的是目標明確，圍繞已定的科學(xué)問題或假說設(shè)計實驗（見下面第3節(jié)）。其次是設(shè)置合適的對照。例如，要想研究人工遮陰對葉片衰老和光合作用的影響，不僅要觀測葉片遮陰不同天數(shù)后光合作用的變化，而且要設(shè)不遮陰的對照，同時觀測對照葉片光合作用變化的進程，因為除了遮陰的作用外，葉片本身也處在自然衰老過程之中。再如，要尋找外來物種（由外地引進的物種）迅速擴展的原伊,托普云農(nóng)伊,托普云農(nóng)一一致力于中國農(nóng)業(yè)信息化的發(fā)展！伊,托普云農(nóng)伊,托普云農(nóng)一一致力于中國農(nóng)業(yè)信息化的發(fā)展！因，僅僅觀測外來物種的光合作用是不夠的，還應(yīng)該同時觀測本土物種的光合作用，以便相互比較，找出外來物種的優(yōu)勢所在。如果是單因子實驗，除了某一因素有不同以外，處理與對照的其它因素應(yīng)當完全相同。例如，在研究低溫脅迫的實驗中，如果處理與對照之間不僅溫度不同，而且光強也不同時，就不能把觀測到的差異僅僅歸之于低溫。在實驗設(shè)計中一個比較常見的問題是，光合速率以單位葉面積計算，而葉綠素、光合產(chǎn)物含量等卻以單位葉片鮮重計算，這樣很難把這些指標聯(lián)系起來分析、討論。尤其是在涉及水分脅迫的研究中，如果也以單位葉片鮮重表示有關(guān)物質(zhì)的含量，則處理和對照之間一些物質(zhì)含量的差異很可能是含水量不同造成的假象，即如果以單位葉面積表示時這些物質(zhì)的含量在處理和對照之間沒有差異。生物統(tǒng)計在不少文稿中，對光合作用的比較測定結(jié)果缺乏必要的統(tǒng)計分析，以至不能確定處理和對照之間或不同品種之間的差異是實驗誤差呢，還是處理引起的或不同品種之間確實存在的差異。所以，如果不經(jīng)過差異顯著水平分析，就不能隨便說什么差異顯著與否。為了便于測定和統(tǒng)計，應(yīng)盡量減少相比較的品種數(shù)目或處理的數(shù)目，以便測定足夠多的樣本數(shù)。如果所測的樣本太少，即使差異很大也達不到顯著水平。有的初學(xué)者或缺乏光合測定經(jīng)驗的人，往往在一次測定中用于比較的不同處理或不同品種的數(shù)目太多，有時竟高達幾十個，以致每個處理或品種只測定2~3片葉，其結(jié)果的可靠性很差?；蛘唠m然每個處理或品種測定的葉片比較多，但是由于處理種類或品種過多，以致整個測定時間拖得很長，測定期間的光強和溫度等環(huán)境條件變化較大，結(jié)果是先后測定的資料之間缺乏可比性。根據(jù)經(jīng)驗，在一次測定中，處理和對照總數(shù)或品種總數(shù)最好不超過4個，每個處理或品種測定的葉片數(shù)最好不少于10片。當然，這是對葉片光合速率的比較而言的。對于測定起來比較費時的量子效率和羧化效率等指標來說，測定的樣本數(shù)可以少一些，但是也不宜小于3。在測定光合速率時，有人喜歡在同一葉片上重復(fù)多次，這樣做雖然使一個葉片的測定結(jié)果更可靠，但在統(tǒng)計時，一個葉片上無論重復(fù)多少次，還是算一個樣本，并不能按多個樣本進行統(tǒng)計。綜合分析認真分析測定結(jié)果，不僅可以判斷所得結(jié)果是否可靠，而且還可以對所得結(jié)果做出恰當?shù)慕忉?，同時有可能發(fā)現(xiàn)值得深入研究的問題。首先要看有關(guān)參數(shù)和指標的變化是否與光合速率的變化相互一致，是否合乎理論的準量關(guān)系。如果不一致，就要找出原因，是測定有誤，還是計算有誤。眾所周知,在光合作用中，每同化一分子二氧化碳成碳水化合物，需要消耗3分子ATP和2分子NADPH,而2分子NADPH的產(chǎn)生是2個光系統(tǒng)的光合電子傳遞鏈傳遞4個電子的結(jié)果。這樣，即使在沒有光呼吸和氮同化等其它同化作用同時進行的情況下，電子傳遞速率也應(yīng)當是凈光合速率的4倍以上，才可以為碳同化提供足夠的同化力。因此，如果最大電子傳遞速率小于光合速率的4倍，說明測定或計算存在某種偏差。又如，多種陽生植物葉片中葉綠素a/葉綠素b的比值通常為3左右，只有那些葉綠素b缺乏的突變體和遭受嚴重環(huán)境脅迫的植物這個比值會遠大于3，而陰生植物的這一比值則小于3。如果不是上述幾種特殊情況，這個比值若是遠離3，其可靠性是值得懷疑的，這很可能與測定葉綠素含量的儀器所用光的波長控制不準確有關(guān)。再如，用葉綠素?zé)晒夥治龅玫降墓饣瘜W(xué)效率變化與光化學(xué)猝滅的變化如果方向相反，也是不可思議的。雖然不同參數(shù)和指標之間的相關(guān)分析有用，但不要做盲目的相關(guān)分析，不要把不同情況下得到的數(shù)據(jù)不分青紅皂白地混合在一起做相關(guān)分析，也不要僅僅根據(jù)相關(guān)分析結(jié)果作結(jié)論。否則，可能會得出令人難以置信甚至違背常識的結(jié)論。例如，蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度呈負相關(guān)，光化學(xué)效率與光合速率呈負相關(guān)，光合速率與光能利用率呈負相關(guān)，光合速率與大氣CO2濃度呈負相關(guān)等等。應(yīng)當指出，在統(tǒng)計光合作用或氣孔導(dǎo)度與空氣濕度的相關(guān)性時，不應(yīng)當使用相對濕度值，而應(yīng)當用空氣的水汽飽和差或葉片與空氣之間的蒸汽壓虧缺，因為光合作用或氣孔導(dǎo)度響應(yīng)的是后者，而不是前者。并且，在不同溫度下，相同的相對濕度值所反映的空氣水汽含量很不相同。作關(guān)于光合速率和氣孔導(dǎo)度變化之間的因果關(guān)系分析時，必須依據(jù)葉肉細胞間的CO2濃度變化，而不能想當然地根據(jù)它們之間的正相關(guān)關(guān)系下結(jié)論。光合速率降低可能是氣孔導(dǎo)度降低的結(jié)果，也可能是氣孔導(dǎo)度降低的原因。只有葉肉細胞間的CO2濃度降低可以證明光合速率的降低是氣孔導(dǎo)度降低的結(jié)果。相反，葉肉細胞間的CO2濃度增高說明光合速率的降低是氣孔導(dǎo)度降低的原因。在光合作用的氣孔限制分析中，胞間CO2濃度是一個很有用的參數(shù)，而且多種現(xiàn)代的光合測定儀器在測定光合速率時都能同時給出這個參數(shù)，可惜不少初學(xué)者還不知道充分利用它。假象的排除在實驗中看到新現(xiàn)象是令人高興的事情，但在深入研究新現(xiàn)象、提出和證實假說之前，不僅要多次重復(fù)，而且要用多種方法證明它確實是新現(xiàn)象，而不是方法不當造成的假象。例如，自然條件下生長的許多C3植物在光量子通量密度為800~1600Wol?m-2?s-1的光下，它們的葉片光合作用達到飽和，即光合速率不再隨光強的提高而增高。因此，那些飽和光強高達1800、2000Mmol-m-2-s-1，甚PP托普云農(nóng)一一致力于中國農(nóng)業(yè)信息化的發(fā)展!伊,托普云農(nóng)伊,托普云農(nóng)一一致力于中國農(nóng)業(yè)信息化的發(fā)展！至2400、3500Mol?m-2-s-1的結(jié)果總是讓人難以置信，很可能是在觀測葉片光響應(yīng)的過程中葉溫逐步增高或光合誘導(dǎo)期沒有結(jié)束造成的假象（陳根云等2006）。順便要指出的是，有的人在觀測光合作用的光響應(yīng)時使，用的光照強度高達2500、3000和3500Wol?m-2?s-1,這完全沒有必要，因為自然界（海拔很高的高原可能是例外）的植物不可能遇到這么強的光，C3植物光合作用的飽和光強也不可能有這么高。并且，使用這么強的光不僅耗電過多，不利于田間較長時間的測定，而且也可能對葉片造成傷害或破壞。又如，在低溫光抑制研究中，如果受處理的是葉片，那么從低溫和光照處理的葉片中分離的葉綠體，其光合活力會明顯低于從常溫和光照下（對照）葉片中分離的葉綠體。這是由于光下低溫導(dǎo)致光合作用的光抑制甚至光合機構(gòu)光破壞的結(jié)果。但是，如果處理的不是葉片，而是離體葉綠體，其結(jié)果會相反：低溫光照預(yù)處理的葉綠體的光合活力明顯高于常溫光照預(yù)處理（對照）的葉綠體。顯然，這后一種差異并不是預(yù)想的低溫光抑制的結(jié)果,而是實驗設(shè)計不當造成的假象。這是因為，葉綠體離體后，多種蛋白酶開始對光合機構(gòu)起破壞作用。在常溫（對照）下的這種破壞作用會遠甚于低溫下的處理，因為在生理溫度范圍內(nèi)酶的作用是隨著溫度提高而增強的。再如，在觀測C3植物光合作用對CO2的響應(yīng)時可能會看到，較高濃度CO2下光合速率竟會隨著CO2濃度的增高而下降，這大多是在CO2濃度變化后沒有隨時對所使用的光合測定儀進行“匹配”操作（讓同一氣體流過分析室和參比室并將兩室的CO2濃度差值調(diào)至零）而造成的假象。3結(jié)束語光合作用測定及研究的結(jié)果最后往往要通過科學(xué)論文報告出來。科學(xué)論文的靈魂和魅力在于創(chuàng)新，報告新現(xiàn)象、新結(jié)果和新發(fā)現(xiàn)，提出新觀點、新思想和新假說，明確地提出和解決科學(xué)問題。例如，葉片光合作用對光照強度變化的響應(yīng)，是人們最常觀測的項目。在C3植物或C4植物中不同種類植物的光響應(yīng)曲線大致相同，不同種植物之間往往只有量的差異，而沒有質(zhì)的不同。所以，如果沒有特殊的科學(xué)問題與研究目的，僅僅泛泛地觀測，是不會得到什么新結(jié)果的。然而，如果把這種觀測和某一科學(xué)問題例如飽和光下部分捕光天線的可逆脫離聯(lián)系起來，情況就不相同（Chen和Xu2006）。在以光合作用為主要研