抗體類藥物的生物分析方法,藥學(xué)論文

抗體類藥物的生物分析方法,藥學(xué)論文內(nèi)容摘要：抗體類藥物因其靶向性、高度特異性、低毒性等優(yōu)點(diǎn)成為臨床治療諸多疾病的首選藥物，但在生物體內(nèi)的處置機(jī)制有其特殊性和復(fù)雜性，極大地增加了生物檢測(cè)的難度，因而必須建立靈敏、準(zhǔn)確、可重復(fù)的測(cè)定方式方法。本文主要針對(duì)該類藥物的生物分析方式方法，介紹酶聯(lián)免疫吸附分析、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)以及一些新技術(shù)方式方法的特點(diǎn)和應(yīng)用大概情況，以期為研究此類藥物提供參考。本文關(guān)鍵詞語：?jiǎn)慰寺】贵w；生物分析方式方法；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)；流式細(xì)胞術(shù)；Abstract:Antibodydrugshavebecomethefirstchoiceforclinicaltreatmentofmanydiseasesduetotheiradvantagesoftargeting,highspecificityandlowtoxicity.However,thedisposalmechanisminvivohasitsparticularityandcomplexity,whichgreatlyincreasesthedifficultyofbiologicaldetection.Therefore,toestablishthesensitive,accurateandrepeatablemethodsisurgent.Thispapermainlyfocusesonthebioanalyticalmethodsofthiskindofdrugs,introducesthecharacteristicsandapplicationofenzyme-linkedimmunosorbentassay,electrochemiluminescence,liquidchromatography-massspectrometry,flowcytometryandsomenewtechniques,inhopeofprovidingareferenceforthestudyofrelateddrugs.Keyword:monoclonalantibody;bioanalyticalmethods;LC-MS/MS;flowcytometry;隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的單克隆抗體藥物被開發(fā)用于臨床治療。相比于以往的小分子藥物，抗體藥物具有特異性強(qiáng)、活性高、生物功能明確、毒性低、半衰期長(zhǎng)、有利于臨床應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。調(diào)查顯示，最近幾年單克隆抗體獲得市場(chǎng)批準(zhǔn)的速度是小分子藥物的兩倍[1].截至2021年9月，全球已上市的單克隆抗體藥物有133個(gè)。抗體類藥物具有與內(nèi)源性分子類似、相對(duì)分子質(zhì)量大、分子類型多樣和部分用藥劑量小等特點(diǎn)，在生物體內(nèi)的處置機(jī)制有其特殊性和復(fù)雜性，極大地增加了生物檢測(cè)的難度。因而選用具有更高層次特異性、靈敏度、回收率、重現(xiàn)性以及更寬線性范圍，并且能將進(jìn)入體液的藥物及其降解產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物與內(nèi)源性、外源性干擾物區(qū)別開來的分析方式方法是非常重要的。與典型的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法對(duì)多種不同靶點(diǎn)單抗的測(cè)定參數(shù)比擬〔Tab.1〕，各種分析手段都存在著各自的優(yōu)缺點(diǎn)。因而，本文就當(dāng)前進(jìn)行該類藥物的生物分析方式方法做一概述。1酶聯(lián)免疫吸附分析〔ELISA〕酶聯(lián)免疫吸附分析〔enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA〕是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)，當(dāng)前這種方式方法已經(jīng)成為免疫分析領(lǐng)域最通用的分析方式方法。此方式方法是以酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體為主要試劑，通過復(fù)合物中的酶催化底物呈色而對(duì)被測(cè)物進(jìn)行定性或定量的標(biāo)記免疫技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)并且適用于批量處理等優(yōu)點(diǎn)[1].當(dāng)前已廣泛應(yīng)用于各種抗體類藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究中，如阿達(dá)木單抗及其生物仿制藥[2]、PD-L1單抗[3]、抗體偶聯(lián)藥物[4]等。但是此方式方法也存在著一些缺乏：〔1〕牽涉多個(gè)孵育和洗滌步驟；〔2〕有限的動(dòng)態(tài)范圍；〔3〕不能同時(shí)測(cè)定生物技術(shù)藥物及其代謝產(chǎn)物；〔4〕易受內(nèi)源性和外源性物質(zhì)干擾；〔5〕高度依靠特異性高，親和力強(qiáng)的高品質(zhì)單克隆抗體試劑等。由此可見，ELISA作為當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的免疫分析法，仍需要不斷完善及改良。Tab.1Characteristicsofanalyzedplatforms2基于MSD技術(shù)平臺(tái)的電化學(xué)發(fā)光技術(shù)〔ECL〕電化學(xué)發(fā)光技術(shù)〔electrochemiluminescence,ECL〕是一個(gè)抗原與用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合，根據(jù)電極上的發(fā)光強(qiáng)度而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量分析，提供藥物代謝動(dòng)力學(xué)〔pharmacokinetic,PK〕研究的獨(dú)特平臺(tái)[5,6,7,8].其免疫分析格式類似于典型的ELISA格式，但將其線性范圍擴(kuò)大至1000倍以上，靈敏度提升100倍，為當(dāng)前一些疾病樣本中低劑量待測(cè)蛋白濃度的測(cè)定提供了更好的選擇。雷珠單抗〔ranibizumab〕是一種用于治療新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物，ELISA的靈敏度僅為20ng/mL,而ECL能夠在低至300pg/mL的濃度下可靠地量化此單抗[7].趙小平[9]進(jìn)行乙型肝炎病毒感染血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)方式方法比照的結(jié)果顯示ECL比ELISA方式方法操作愈加簡(jiǎn)單，反響時(shí)間更短，準(zhǔn)確度更高層次。Teimouri等[10]使用ECL檢測(cè)人血清抗弓形蟲IgG的靈敏度和特異性均高于ELISA,但其存在專業(yè)讀取器增加測(cè)定成本的缺點(diǎn)。除此之外，MSD技術(shù)平臺(tái)通過點(diǎn)陣技術(shù)可在96孔石墨電極板實(shí)現(xiàn)10個(gè)指標(biāo)/孔的檢測(cè)。Sumathi等[11]使用MSD平臺(tái)上的多重免疫測(cè)定法準(zhǔn)確地測(cè)量了血清樣品中REGN3470,REGN3471和REGN3479的總濃度，并且特異性地定量每種抗埃博拉病毒單克隆抗體的濃度而不受其他抗體的干擾。因而，ECL方式方法具有線性范圍寬、靈敏度高和可進(jìn)行多重檢測(cè)等優(yōu)于ELISA方式方法的特點(diǎn)，但在吞吐量和工作流程方面沒有太大改良。所以在成本預(yù)算較高的情況下，ECL方式方法可為ELISA提供高靈敏度，可重復(fù)性，同源性和血清耐受性的替代方式方法。3液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)〔LC-MS/MS〕配體結(jié)合試驗(yàn)〔ligandbindingassay,LBA〕如ELISA、ECL等，由于低成本、操作簡(jiǎn)單和高通量等特征已成為蛋白質(zhì)生物分析的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方式方法。然而，該技術(shù)存在一些局限性，包括穿插反響性，高劑量鉤狀效應(yīng)，本身抗體的存在會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果等。近年來，由于LC-MS/MS技術(shù)的改良，它已成為定量生物基質(zhì)中蛋白質(zhì)和抗體的有前景的替代技術(shù)。尤其是在早期的單克隆抗體開發(fā)階段，LC-MS/MS方式方法的出現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)LBA開發(fā)時(shí)間長(zhǎng)，缺乏特異性試劑，基質(zhì)效應(yīng)因物種而異的缺陷。當(dāng)前已有眾多文獻(xiàn)報(bào)道LC-MS/MS用于單克隆抗體臨床和非臨床的藥代動(dòng)力學(xué)研究[12,13,14].在非臨床研究中，可通過計(jì)算機(jī)搜索出抗體候選物的重鏈和輕鏈恒定區(qū)的可能序列，過濾動(dòng)物物種的血漿蛋白質(zhì)組的這些序列的肽，實(shí)現(xiàn)LC-MS/MS分析方式方法的通用性。Li等[15]使用一種通用的同位素標(biāo)記特征肽技術(shù)和免疫捕獲技術(shù)，對(duì)不含臨床前物種氨基酸序列的4種人源化IgG1單抗和4種人源化IgG2單抗進(jìn)行了大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，與ELISA方式方法之間的時(shí)間-濃度曲線顯示出良好的一致性，實(shí)現(xiàn)了IgG2和IgG1的分析方式方法通用性。但在臨床研究中此方式方法的通用性仍處于探尋求索階段[16].LC-MS/MS也具有可檢測(cè)降解產(chǎn)物和翻譯后修飾物質(zhì)，免除高免疫原性對(duì)PK/TK分析存在干擾的優(yōu)勢(shì)。Kang等[17]報(bào)道了一種有效的LC-MS/MS法，能夠同時(shí)測(cè)定胰高血糖素樣肽1-Fc融合蛋白〔GLP1-Fc〕的母體藥物和兩種活性代謝物。Law和Wang等[18,19]均得到了LC-MS/MS法測(cè)得的抗體藥物濃度始終高于ELISA法的結(jié)論，并證明了是由于抗藥性抗體的存在而導(dǎo)致的。除此之外，分析物富集、色譜分離和多反響監(jiān)測(cè)技術(shù)提供了多個(gè)選擇維度，使LC-MS/MS適用于多重分析。Lanshoeft等[20]成功地運(yùn)用LC-MS/MS的多重分析同時(shí)定量多種不同人類IgG1抗體。由此可見，LC-MS/MS具有線性動(dòng)態(tài)范圍寬、方式方法開發(fā)快、多組分分析、可同時(shí)量化母體和代謝物等優(yōu)點(diǎn)。LC-MS/MS法可使單克隆抗體大小的蛋白質(zhì)〔~150000〕的定量下限到達(dá)50ng/mL[21],靈敏度稍低于ELISA,但此水平足以在大多數(shù)情況下對(duì)抗體藥物進(jìn)行定量。并且隨著更多尖端技術(shù)的出現(xiàn)，包括免疫捕獲〔IC〕在內(nèi)的樣品制備經(jīng)過的改良，靈敏度得到了顯著提高，但可重復(fù)性差這一問題尚未解決。4流式細(xì)胞術(shù)〔flowcytometry〕在免疫分析方式方法中，通常需要精制的抗原以及特異性的單克隆抗體用于生物基質(zhì)中被分析物的捕獲與檢測(cè)，流式細(xì)胞術(shù)則可基于空間構(gòu)造近乎于天然存在形式的細(xì)胞外表抗原來定量檢測(cè)生物基質(zhì)中的抗體。RhD是在Rh血型系統(tǒng)中存在于紅細(xì)胞外表的D抗原，Yver等[22]使用流式細(xì)胞術(shù)成功地對(duì)一種人重組單克隆抗RhD抗體roledumab進(jìn)行了定量。抗體-藥物偶聯(lián)物〔antibody-drugconjugate,ADC〕的抗原是具有復(fù)雜蛋白質(zhì)構(gòu)造的膜蛋白，其可溶性表示出仍然是一個(gè)難題。奧法木單抗〔OFA〕是一種抗CD20單克隆抗體，用于治療非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。Zhao等[23]建立了基于流式細(xì)胞術(shù)的奧法木單抗ADC〔OFA-HL-MMAE〕藥物測(cè)定分析方式方法，并利用這種新方式方法定量測(cè)量了小鼠血清中OFA-HL-MMAE的濃度。鄧承蓮等[24]采用ELISA與流式細(xì)胞術(shù)兩種方式方法對(duì)抗CD20單抗進(jìn)行定量分析，結(jié)果表示清楚兩種方式方法均具有良好的特異性、精致細(xì)密度和準(zhǔn)確度，但其靈敏度與ELISA相比相差約兩個(gè)數(shù)量級(jí)。由此看出，此方式方法不受可溶性抗原表示出問題的限制，還擴(kuò)展了LBA方式方法的應(yīng)用范圍，對(duì)于量化臨床ADC樣品和以細(xì)胞外表抗原為靶點(diǎn)的單克隆抗體具有很高的價(jià)值。但存在著可重復(fù)性差、靈敏度低的缺點(diǎn)，而且適用性及通用性也需要我們進(jìn)一步的探究。5新型檢測(cè)技術(shù)5.1微流控免疫分析平臺(tái)〔Gyrolab〕典型的Gyrolab免疫測(cè)定是將分析試劑和研究樣品從聚丙烯微量滴定板全自動(dòng)轉(zhuǎn)移到一系列含有納升級(jí)鏈霉親合素蛋白柱的光盤〔CD〕微構(gòu)造上，通過測(cè)量來自每個(gè)柱的熒光信號(hào)定量藥物濃度。可在5h內(nèi)完成單個(gè)5CD運(yùn)行以獲得560個(gè)最大樣品量，以允許在有限的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行快速的分析方式方法開發(fā)[25].具有試劑消耗低，動(dòng)態(tài)范圍寬，基質(zhì)效應(yīng)低，樣品體積小和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。已被提議作為傳統(tǒng)的基于微量滴定板的免疫測(cè)定的可行替代方式方法。Liu等[25]使用Gyrolab平臺(tái)對(duì)兩種抗體的四個(gè)非臨床毒理學(xué)和兩個(gè)臨床試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，根據(jù)LBA方式方法的可接受標(biāo)準(zhǔn)，觀察到分析批的通過率高達(dá)83%~100%,真實(shí)樣品再分析的通過率高達(dá)94%以上，與傳統(tǒng)的ELISA方式方法相比，樣本測(cè)定時(shí)間縮短了1~2周，樣品和試劑的消耗量低約10倍。除此之外，研究顯示較短的孵育時(shí)間使非特異性互相作用最小化，進(jìn)而使其基質(zhì)效應(yīng)比ELISA低10倍，比ECL低2倍[26].常規(guī)ELISA方式方法檢測(cè)克羅恩病人中的單克隆抗體Etrolizumab時(shí)有著較強(qiáng)的基質(zhì)干擾，Williams等[27]運(yùn)用Gyrolab免疫測(cè)定法有效地消除了基質(zhì)效應(yīng)，并將其定量范圍擴(kuò)大了將近兩個(gè)數(shù)量級(jí)。但此平臺(tái)易發(fā)生污染和管道堵塞，需要較為頻繁的清潔，而且每個(gè)BioaffyCD的價(jià)格比ELISA板的價(jià)格高出約300倍，緩沖液和標(biāo)記系統(tǒng)等也需要額外的費(fèi)用[28,29].只要當(dāng)分析時(shí)間作為一個(gè)考慮因素時(shí)，Gyrolab工作站最終比ELISA和ECL更具成本效益。5.2外表等離子共振技術(shù)〔Biacore〕BIA〔biomolecularinteractionanalysis〕技術(shù)是基于一種稱為外表等離子共振〔surfaceplasmonresonance,SPR〕的物理光學(xué)現(xiàn)象發(fā)展起來的新型生物傳感分析技術(shù)。將一種生物分子固定在傳感器的葡聚糖外表，與之互相作用的分子溶于流過芯片外表的溶液中，通過SPR共振角的變化檢測(cè)器能跟蹤檢測(cè)溶液中的分子與芯片外表的分子結(jié)合、解離整個(gè)經(jīng)過的變化。此方式方法被廣泛用于動(dòng)力學(xué)常數(shù)和樣品濃度的測(cè)定[30]、分析分子的互相作用形式[31]等方面。Alaedini等[32]用Biacore平臺(tái)檢測(cè)抗單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂〔抗GM1〕本身抗體，其靈敏度和特異性與經(jīng)典的ELISA試驗(yàn)相當(dāng)。Schlichtiger等[33]檢測(cè)抗心磷脂抗體，Biacore平臺(tái)顯示出比傳統(tǒng)ELISA更高層次的靈敏度，并允許分析結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力。與常規(guī)ELISA相比，Biacore系統(tǒng)在免疫測(cè)定中具有樣本需求量少、監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)性、樣品無需標(biāo)記及快速自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。但此項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)還不夠成熟，對(duì)蛋白純度要求也較高。5.3單分子免疫檢測(cè)技術(shù)〔singlemoleculecounting,Erenna〕單分子計(jì)數(shù)〔SMC〕技術(shù)利用激光聚焦于愛里斑中單個(gè)熒光標(biāo)記分子，初次實(shí)現(xiàn)了在單分子水平對(duì)蛋白進(jìn)行計(jì)量。用洗脫液將檢測(cè)抗體從基于珠或板的免疫復(fù)合物中解離下來，并送入Erenna系統(tǒng)的毛細(xì)管中，通過獨(dú)特的軟件擬合單個(gè)熒光素標(biāo)記抗體在通過檢測(cè)空間時(shí)產(chǎn)生的熒光閃爍輸出信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)寬動(dòng)態(tài)范圍和加強(qiáng)的靈敏度。SMCTM技術(shù)采用了與傳統(tǒng)ELISA技術(shù)特別類似的流程，但將靈敏度提高了三個(gè)數(shù)量級(jí)，并且具有多重檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。Gilbert等[34]通過含有多個(gè)激光器的Erenna系統(tǒng)一次性準(zhǔn)確地測(cè)量三種分析物的亞pg/mL含量，此多路復(fù)用可減少使用較小體積的樣品來分析多個(gè)分析物所需的時(shí)間。但是SMCTM技術(shù)吞吐量相對(duì)較低，每個(gè)分析人員天天的檢測(cè)通量不可能超過兩個(gè)96孔板[35],存在著試劑殘留的問題[36].測(cè)定成本也較高，但既可使用磁珠又可使用普通96孔板作為抗體包被介質(zhì)的特點(diǎn)，使其在靈敏度和成本方面獲得了巧妙平衡。6結(jié)論與瞻望單抗藥物憑借其靶向性強(qiáng)、毒性低，具有傳統(tǒng)化學(xué)療法無可比較的優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于臨床。伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展，又涌現(xiàn)出了各種更具療效的抗體藥物衍生物，如構(gòu)造域抗體、雙特異性抗體、肽抗體、抗體藥物結(jié)合物等。固然此類藥物的生物分析技術(shù)已經(jīng)獲得了長(zhǎng)足發(fā)展，有多種技術(shù)手段可供選擇，但選擇一個(gè)適宜的生物分析平臺(tái)是由多個(gè)因素決定的，不僅取決于靈敏度要求，還取決于平臺(tái)可訪問性、樣本量可用性、方式方法開發(fā)容易性、平臺(tái)靈敏性和吞吐量需求。應(yīng)根據(jù)這類藥物性質(zhì)特點(diǎn)、方式方法需求及可操作性等選擇合適的分析方式方法或者多種分析手段聯(lián)合使用。隨著科技的進(jìn)步，也將會(huì)有更靈敏、樣本量需求更少、分析周期更短、重復(fù)性更高層次、全自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)的生物分析技術(shù)被開發(fā)出來，為該類藥物的藥動(dòng)學(xué)研究提供更可靠的數(shù)據(jù)。以下為參考文獻(xiàn)[1]FreseK,EisenmannM,OstendorpR,etal.Anautomatedimmunoassayforearlyspecificityprofilingofantibodies[J].mAbs,2020,5〔2〕：279-287.[2]PuriA,NiewiarowskiA,AraiY,etal.Pharmacokinetics,safety,tolerabilityandimmunogenicityofFKB327,anewbiosimilarmedicineofadalimumab/Humira,inhealthysubjects[J].BritJClinPharmacol,2021,83〔7〕：1405-1415.[3]李雪，史晶瑩，董雪，等。一種人抗PD-L1單抗的間接ELISA方式方法的建立[J].生物技術(shù)，2021,27〔6〕：552-556.[4]李萌，于傳飛，王文波，等。抗體偶聯(lián)藥物抗HER2單抗-MCC-DMl質(zhì)控方式方法的建立[J].藥物分析雜志，2021,36〔1〕：22-30.[5]SoderstromCI,SpriggsFP,SongW,etal.Comparisonoffourdistinctdetectionplatformsusingmultipleligandbindingassayformats[J].JImmunolMethods,2018,371〔1/2〕：106-113.[6]夏明。ECLIA法檢測(cè)血清促甲狀腺激素受體抗體在本身免疫性甲狀腺病中的診斷價(jià)值[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2021,23〔1〕：160-162.[7]LoweJ,MaiaM,WakshullE,etal.Developmentofanovelhomogenouselectrochemiluminescenceassayforquantitationofranibizumabinhumanserum[J].JPharmBiomedAnal,2018,52〔5〕：680-686.[8]SmeragliaJ,SilvaJP,JonesK.Improvingthesensitivityandspecificityofabioanalyticalassayforthemeasurementofcertolizumabpegol[J].Bioanalysis,2021,9〔16〕：1217-1226.[9]趙小平。兩種不同免疫檢驗(yàn)方式方法檢測(cè)乙型肝炎病毒感染血清學(xué)標(biāo)志物的臨床比照討論[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2022,17〔3〕：61-62.[10]TeimouriA,ModarressiMH,ShojaeeS,etal.Detectionoftoxoplasma-specificimmunoglobulinGinhumansera:performancecomparisonofinhouseDot-ELISAwithECLIAand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